香椿子多酚的制药用途

1.本发明属生物制药领域，提供一种可治疗脑缺血的中药提取物-香椿子多酚。


背景技术：

2.脑卒中又称中风、脑血管意外，是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞而引起脑组织损伤的一类疾病，包括缺血性和出血性卒中，中风的特征是“3h”，高死亡率(high mortality)、高发病率(high morbidity)和高伤残率(high disability)，给家庭和社会造成了巨大的健康和经济负担。缺血性卒中又被称为脑缺血。目前人类社会逐渐向老年化迈进，脑缺血也成为老年化社会普遍性疾病之一，并且可能成为威胁人类健康的主要问题。目前临床上缺血性中风治疗方法包括溶栓治疗和血管内血栓切除术，然而，由于狭窄的治疗窗口，这些治疗方法的有效性和安全性在临床实践中受到限制。因此，迫切需要替代的有效医学干预措施，尤其是神经保护药的开发。
3.香椿toona sinensis(a.juss.)roem又名椿树、春芽树等，因其嫩芽有特殊香气而得名，该树主要以叶为食，药食同源。香椿子为香椿的果实，常在秋季采收，晒干。其长2.5-3.5 cm，果皮开裂为5瓣，深裂至全2/3左右，裂片披针形，先端尖，外表黑褐色，有细纹理，内表黄棕色，光滑，厚约2.5mm，质脆。果轴呈圆锥形，顶端钝尖，黄棕色，有5条棕褐色棱线。断面内心松泡色黄白。种子着生于果轴及果瓣之间，5列，种子有极薄的种翅，黄白色，半透明，基部斜口状，种仁细小不明显，气微弱。以完整、干燥者为。目前研究发现，香椿子中含有酚类、皂苷、甾体、萜类、多糖、挥发油、醛、酮等成分。香椿子的药理作用及临床应用主要有：(1)胃和十二指肠溃疡、慢性胃炎、慢性萎缩性胃炎；(2)头痛、偏头痛； (3)胸痛；(4)风湿关节痛；(5)疝气痛；(6)痔漏；(7)风寒外感等。本发明针对香椿子进行了实验研究，提出了香椿子多酚在制备治疗神经元细胞损伤的药物中的应用、在制备治疗神经功能损伤的药物中的应用以及在制备治疗脑缺血的药物中的应用。


技术实现要素：

4.本发明针对上述问题采用ttc染色、longa评分以及改良的神经损害严重程度评分评价香椿子多酚对脑梗死体积以及神经功能的作用，采用he染色评价香椿子多酚对神经元细胞损伤的保护作用。
5.基于此，本发明提供一种香椿子多酚在制备治疗神经元细胞损伤和神经功能损伤的药物中的应用。
6.进一步的，本发明还提供一种香椿子多酚在制备治疗脑缺血的药物中的应用。
7.本发明的技术方案还提供一种包含香椿子多酚的组合物在制备治疗所述的神经元细胞损伤、神经功能损伤或脑缺血的药物中的应用，所述的组合物中包括药学上可接受的赋形剂。
8.针对上述的应用，香椿子多酚为水提取物或10-80％质量浓度的乙醇提取物均能实现上述中制备治疗神经元细胞损伤或脑缺血的药物中的应用。
9.作为优选方案香椿子多酚为50％-80％质量浓度的乙醇提取物。
10.作为优选方案香椿子多酚为70％质量浓度的乙醇提取物所实现的效果最优。
附图说明
11.图1为没食子酸标准曲线。
12.图2为香椿子水煎剂及香椿子70％提醇提取物对脑缺血sd大鼠的脑梗死体积的影响，图2-a 为ttc染色图；图2-b为其对应的脑梗死体积统计图，其中，sham：假手术组；ischemia：缺血模型组；5
‰
cmc-na：溶媒组；ctfd：香椿子水煎剂组；ctfe组：香椿子70％乙醇粗提物组。
*
p＜0.05；
**
p＜0.01；(n＝14,)。
13.图3为香椿子多酚对脑缺血sd大鼠的脑梗死体积的影响，图3-a为ttc染色图，图3-b 为脑梗死体积统计图。其中，sham：假手术组；ischemia：缺血模型组；5
‰
cmc-na：溶媒组；ctfp：香椿子多酚(polyphenols of chinese toon fruits,ctfp)组；asprin组：阿司匹林阳性对照组。
*
p＜0.05；
**
p＜0.01；(n＝7,)。
14.图4为不同剂量香椿子多酚对脑缺血sd大鼠神经行为学评分(longa评分)的影响。其中， sham：假手术组；ischemia：缺血模型组；5
‰
cmc-na：溶媒组；ctfp：香椿子多酚(polyphenolsof chinese toon fruits,ctfp)组；asprin组：阿司匹林阳性对照组。
*
p＜0.05；
**
p＜0.01； (n＝7,)。
15.图5为香椿子多酚对脑缺血sd大鼠的神经功能(mnss评分)的影响。其中，sham：假手术组；ischemia：缺血模型组；5
‰
cmc-na：溶媒组；ctfp：香椿子多酚(polyphenols of chinesetoon fruits,ctfp)组；asprin组：阿司匹林阳性对照组。
*
p＜0.05；
**
p＜0.01；(n＝7,)。图6为香椿子多酚对脑缺血sd大鼠皮层和海马各区神经元的影响，图6-a、6-b、6-c及6-d 分别为200
×
、400
×
镜下大脑皮层、海马ca1区、ca3区及dg区he染色图，sham：假手术组；ischemia：缺血模型组；5
‰
cmc-na：溶媒组；ctfp：香椿子多酚(polyphenols of chinesetoon fruits,ctfp)100mg/kg组；asprin组：阿司匹林阳性对照组。其中
↑
代表正常神经元，代表损伤神经元。
16.图7为香椿子多酚对sd大鼠皮层和海马各区神经元的影响，图7-a、7-b、7-c及7-d分别为对应区域损伤神经元百分比统计图。其中图7-a、7-b、7-c及7-d分别为对应分别对应于图6中的a、b、c、d。与sham组相比，*p＜0.05，**p＜0.01；与ischemia组相比，
#
p＜ 0.05，
##
p＜0.01(n＝4,)。
具体实施方式
17.实施例1
18.本发明采用的采用无特定病原体(specific pathogen free,spf)级8周龄(体重180-200g) sd雄性大鼠购于所需动物均购于三峡大学实验动物中心，实验动物许可证编号：scxk(鄂) 2017-0012；香椿子购于豫西郭天社中药材经营部，经三峡大学医学院曾建红教授鉴定为楝科植物香椿的干燥的成熟果实；阿司匹林肠溶片：批号：190408，规格：50mg
×
75片，产自于大同市利群药业有限公司；ab-8大孔吸附树脂购于东鸿化工有限公司；95％乙醇购于山东富宇化工有限公司；福林酚试剂购于北京索莱宝科技有限公司；没食子酸标准对照品 (hplc≥98％)购于北京索莱宝科技有限公司；苏木素染液购于北京索莱宝科技有
限公司；伊红染色液购于北京索莱宝科技有限公司；无水碳酸钠购于国药集团化学试剂有限公司；羧甲基纤维素钠购于国药集团化学试剂有限公司；pbs购于武汉塞维尔生物科技有限公司； 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，ttc)购于sigma；mcao 线栓购于深圳市瑞沃德生命科技有限公司
19.香椿子提取物的制备：
20.(1)香椿子水煎剂
21.香椿子toona sinensis roem粉碎后，称重，先以料液比1:15用超纯水浸泡过夜后煎煮1.5h，抽滤，再分别以料液比1:10用超纯水煎煮2次，时间均为1.5h。抽滤，合并滤液，80℃加热浓缩，冷冻干燥后得香椿子水煎剂。
22.(2)香椿子70％乙醇粗提物：香椿子粉碎后，称重，先以料液比1:15用70％乙醇浸泡过夜后加热回流提取，再分别以料液比1:10用70％乙醇提取2次，时间均为1.5h。抽滤，合并滤液，然后用旋转蒸发仪回收乙醇至无醇味，80℃加热浓缩后即得70％乙醇粗提液，4℃保存。70％乙醇粗提液冷冻干燥后得香椿子70％乙醇粗提物。
23.(3)香椿子多酚：将70％乙醇粗提液80℃加热助溶后，4000r/min离心10min，将上清液加至装好的ab-8大孔吸附树脂柱子中，上样体积不得超过柱子体积的三分之二，上样结束后，使其吸附30min。分别以超纯水、70％乙醇、95％乙醇为流动相冲洗柱子，恒流泵控制加入流动相的速度，与柱子流出速度一致，流动相总体积不得少于三个柱子体积，收集超纯水、70％乙醇、95％乙醇洗脱部位，70％乙醇、95％乙醇洗脱液经过旋转蒸发仪回收乙醇至无醇味，80℃分别加热浓缩超纯水、70％乙醇、95％乙醇洗脱部位，冷冻干燥别得香椿子水部位、香椿子多酚、香椿子95％乙醇部位。
24.(4)多酚含量测定
25.1)标准曲线的建立：精密称取0.0021g没食子酸标准品，定容至50ml，配成浓度为400μg/ml 的母液，吸取0.75ml的母液，使其溶于4.25ml的双蒸水中，混匀，得5ml 60μg/ml的没食子酸溶液，倍比稀释成浓度为30μg/ml、15μg/ml、7.5μg/ml、3.75μg/ml、1.875μg/ml、0.9375 μg/ml的对照品溶液，从0.9375μg/ml的对照品溶液中移出2.5ml，各管中加入500μl福林酚试剂，静置7min后，加入600μl na2co3溶液，50℃水浴加热5min，冷却3min，依次吸取 200μl至96孔板，每个浓度设立3个副孔，于760nm测定其吸光度，以od值为纵坐标，浓度为横坐标得标准曲线。标准曲线见图1。由图1可知：以没食子酸为标准品，以没食子酸浓度为横坐标，od值为纵坐标，所得的标准曲线为y＝0.0376x 0.0789(r2＝0.9995)。
26.2)香椿子多酚中多酚含量：将香椿子水煎剂、香椿子70％乙醇粗提物、香椿子水部位、香椿子多酚、香椿子95％乙醇部位分别配置成0.002g/ml的溶液，分别吸取50μl至ep管中，加入2.45ml双蒸水，得浓度为40μg/m的提取物溶液，各管中加入500μl福林酚试剂，静置7 min后，加入600μl na2co3溶液，50℃水浴加热5min，冷却3min，依次吸取200μl至96 孔板，每个浓度设立3个副孔，于760nm测定其吸光度，代入公式，计算其中多酚含量。上述实验重复3次，取平均值。以ab-8大孔树脂富集的香椿子多酚作为药物，探究其对脑缺血的神经保护作用。
27.表1香椿子不同提取物中多酚含量
[0028][0029]
将无特殊病原体级别(free of special pathogens，spf)的sd大鼠适应性喂养1周后，随机分为假手术组、缺血模型组、5
‰
cmc-na组、香椿子水煎剂组(1000mg/kg)、香椿子70％乙醇粗提物组(920mg/kg)、ctfp低剂量组(50mg/kg)、ctfp中剂量组(100mg/kg)、ctfp 高剂量组(200mg/kg)、阿司匹林(10mg/kg，阳性对照)组，预给药1周后，除假手术组外，进行mcao手术。给药期间，正常饮食饮水。
[0030]
药物配置
[0031]
香椿子水煎剂：称取4g香椿子水煎剂，溶于40ml 5
‰
cmc-na中，超声助溶，配置成 100mg/ml的香椿子水煎剂溶液。
[0032]
香椿子70％乙醇粗提物：称取3.68g香椿子70％乙醇粗提物，溶于40ml 5
‰
cmc-na 中，超声助溶，配置成92mg/ml的香椿子70％乙醇粗提物溶液。(香椿子70％乙醇粗提物的剂量是根据香椿子水煎剂的剂量和产率换算成香椿子的重量得到的，香椿子水煎剂的产率为 11.85％，香椿子70％乙醇粗提物的产率为10.9％。)
[0033]
香椿子多酚：分别称取0.2g、0.4g、0.8g香椿子多酚，溶于40ml 5
‰
cmc-na中，超声助溶，分别配置成5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml的香椿子多酚溶液。
[0034]
阿司匹林：将一片阿司匹林片(每片含阿司匹林50mg)研磨成粉末，使其溶于50ml 双蒸水中，超声助溶，配置成1mg/ml的阿司匹林溶液。
[0035]
灌胃给药
[0036]
称量体重，以10ml/kg灌胃给药，假手术组和缺血模型组给予双蒸水，溶媒组给予5
‰ꢀ
cmc-na溶液，香椿子水煎剂组给予100mg/ml的香椿子水煎剂溶液，香椿子70％乙醇粗提物组92mg/ml的香椿子70％乙醇粗提物溶液，香椿子多酚组分别给予不同剂量(5mg/ml、 10mg/ml、20mg/ml)的香椿子多酚溶液，阿司匹林组给予1mg/ml阿司匹林溶液。将sd大鼠置于鼠笼盖子上，右手抓住大鼠尾部，左手抓住其颈部，小手指压住其后肢，使其呈仰卧位，以灌胃针头轻压其嘴角，尽量使口腔与食道形成直线，从嘴角将灌胃针沿上腭壁轻轻进入食道，进入胃部可感受到落空感，药物注射完毕将灌胃针轻轻拔出。灌胃结束后观察大鼠状态，防止因灌入肺部致其死亡。
[0037]
sd大鼠mcao模型的建立
[0038]
称量体重，使用10％水合氯醛腹腔麻醉大鼠，剂量为0.35ml/100g，腹腔注射时需控制速度，防止速度过快产生呼吸抑制致其死亡。待其麻醉后，剔除颈部毛发，将其仰卧位固定于加热垫上，碘伏消毒，沿颈部中线剪开，沿肌肉间隙分离，分离右侧颈总动脉(common carotidartery，cca)、颈外动脉(external carotid artery，eca)和颈内动脉(internal carotid artery，ica)，在cca远心端、近心端以及eca和ica分叉处插入5-0线，于近心端结扎cca，分叉处结扎ica，动脉夹夹闭eca，在靠近近心端结扎处剪一“v”型小口，将线栓(线头直径0.35mm，硅胶5-6mm，线身直径0.20mm，线长5cm)从小口处插入到ica，用绕在cca 远心
端的细线轻轻系住线栓，防止血流将线栓冲出导致初学过多，松开动脉夹，用眼科镊轻推线栓，当线栓黑色标记出超过eca和ica分叉处并感觉轻微阻力，插入深度约为18-20mm 时，停止插入线栓，结扎远心端细线，计时，缝合颈部伤口。缺血2h后，将线栓拔出，再灌注22h后取材。
[0039]
ttc染色测定梗死体积
[0040]
ttc可以与正常组织中的琥珀酸脱氢酶发生反应，生成红色的甲臜，而缺血组织中脱氢酶活性降低，几乎不与ttc发生反应，故呈现白色。将sd大鼠在缺血2h再灌22h后断头取脑，行ttc染色。
[0041]
sd大鼠用10％水合氯醛(0.35ml/100g)深度麻醉后处死，迅速取脑，将脑组织置于称量纸上，于-20℃冰箱中速冻30min，用刀片将脑组织沿冠状面平均切成5片脑片，每片大约 2mm厚，放入0.4％ttc溶液，于37℃烘箱中染色30min，每10min反转脑片一次，染色过程注意避光，然后用4％多聚甲醛固定，固定24h后手机拍照并上传至计算机，采用imagej图像处理软件分析梗死面积(红色部分为正常脑组织，白色部分为梗死脑组织)，各脑片梗死面积之和乘以厚度(2mm)为总的梗死体积，以梗死体积/全脑体积比作为统计参数。结果见图2、图3：如图2所示，图2-a为ttc染色图，其中红色代表非梗死区，白色代表梗死区；图2-b为其对应的脑梗死体积统计图；结果显示：与假手术组相比，缺血组脑梗死体积显著增加；与模型组相比，香椿子水煎剂组以及香椿子70％乙醇粗提物组均可以显著减小脑梗死体积(p《0.01)；与香椿子水煎剂组相比，香椿子70％乙醇粗提物相对于水提取物更显著减小脑梗死体积(p《0.01)，因此得出结论：香椿子70％乙醇粗提物均可以减小脑梗死体积。如图3所示：其中图3-a为ttc染色图，图3-b为脑梗死体积统计图。如图可见：与假手术组相比，缺血模型组脑梗死体积明显增加(p《0.01)；与缺血模型组相比，三种剂量香椿子多酚组脑梗死体积显著降低(p《0.01)，与低剂量组相比，中、高剂量在减小梗死体积方面的作用更显著(p《0.01)，与高剂量比，中剂量减小梗死体积效果更优(p《0.05)。因此得出结论：香椿子多酚中剂量的效果最为显著。
[0042]
事实上，本技术人对香椿子多酚为10％、20％、30％、40％、50％、60％、80％质量浓度的乙醇提取物均进行了上述的ttc染色测定梗死体积，发现这些质量浓度的乙醇提取物也能显著减小脑梗死体积。
[0043]
神经功能评分评估神经功能
[0044]
(1)longa评分法
[0045]
动物苏醒后longa法对大鼠进行神经行为学评分，评分标准为：0分：正常，无神经功能缺损；1分：左侧前爪不能完全伸展，轻度神经功能缺损；2分：行走时，大鼠向左侧(瘫痪侧)转圈，中度神经功能缺损；3分：行走时，大鼠身体向左侧(瘫痪侧)倾倒，重度神经功能缺损；4分：不能自发行走，有意识丧失。分值越高，说明动物行为障碍越严重。评分1-3分者定为造模成功(动物苏醒后出现血管栓塞同侧hornor征和对侧肢体功能障碍即为造模成功)，4分者排除实验之外。结果见图4，如图所示：与假手术组相比，缺血模型组神经功能评分明显提高(p《0.01)；与缺血模型组相比，三种剂量香椿子多酚均可以明显改善神经功能(p《0.01)，中、高剂量效果优于低剂量(p《0.05)，但中剂量与高剂量没有显著差别。
[0046]
(2)mnss
[0047]
缺血2h，再灌注22h后，采用双盲法对sd大鼠进行改良的神经损害严重程度评分，
注意保证环境的安静，避免因环境影响评定结果。结果见表2，具体评分标准见表3，结果见图 5，如图所示：与假手术组相比，缺血模型组神经功能评分明显提高(p《0.01)；ctfp可以降低脑缺血大鼠mnss评分(p《0.01)
[0048]
表2mnss评分标准
[0049][0050][0051]
he染色
[0052]
(1)灌注、固定、取材：将恒流泵组装好，排空气泡。采用10％的水合氯醛以0.35g/kg腹腔注射，麻醉sd大鼠，大鼠胸腹部去毛备皮，仰卧位固定，碘伏消毒后，沿腹中线剪开直至剑突，随后向两侧剪至上肢，将剑突与牙齿用血管钳夹在一起，打开胸腔，分离皮下组织，充分暴露心脏，左手食指和拇指夹住心脏，使心尖与主动脉呈直线，右手持灌流针从心尖插入，经过左心室直至主动脉，要求可以看到主动脉中的针尖，使用血管钳固定灌流针，开启恒流泵，剪开右心耳，注入生理盐水，直至肝脏等组织发白，流出液体澄清，然后注入4％多聚甲醛直至大鼠四肢僵硬。若灌流针位置合适，在多聚甲醛刚进入大鼠体内时，大鼠肢体会剧烈抽动。灌注完成后断头取脑，并将完整大脑置于4％多聚甲醛中固定24h。
[0053]
(2)脱水、透化：从固定液中取出脑组织，将其分为3段，保留具有标准海马形状的组织部位，进行脱水处理(75％乙醇12h
→
85％乙醇2h
→
95％乙醇
ⅰꢀ
2h
→
95％乙醇
ⅱꢀ
2h
→
100％乙醇
ⅰꢀ
1.5h
→
100％乙醇
ⅱꢀ
1.5h)，后进行透明处理(二甲苯
ⅰꢀ
60min
→
二甲苯
ⅱꢀ
30min)。
[0054]
(3)浸蜡、包埋：将已经进行透明的组织置于石蜡ⅰ、石蜡ⅱ中各2h，放入熔蜡箱中保温，在1.5cm*1.5cm方形石蜡模块盒中，倒入少许石蜡，将组织放到正中央，倒入融蜡，待
其凝固后取出。
[0055]
(4)切片、烤片：将包有组织的蜡块固定于切片机上，切4μm厚的薄片，于热水中烫平，贴于载玻片上，于60℃恒温烤箱中烤干。
[0056]
(5)脱蜡、染色：于全自动智能染色机中进行，染色程序为：烤箱5min
→
二甲苯ⅰ3min
→
二甲苯ⅱ3min
→
二甲苯ⅲ4min
→
100％乙醇ⅰ1min
→
100％乙醇ⅱ1min
→
100％乙醇ⅲ1min
→
95％乙醇ⅰ1min
→
95％乙醇ⅱ1min
→
蒸馏水30s
→
苏木精染色6min
→
自来水30s
→
1％盐酸酒精5s
→
0.5％伊红染色2min
→
95％乙醇ⅰ10s
→
95％乙醇ⅱ20s
→
100％乙醇ⅰ30s
→
100％乙醇ⅱ1min
→
100％乙醇ⅲ3min
→
二甲苯ⅰ20s
→
二甲苯ⅱ4min。
[0057]
(6)取出切片后，在二甲苯干掉之前，在切片中央滴一滴中性树脂，夹住盖玻片，倾斜45
°
角，将盖玻片放下，不要产生气泡。于常温处等中性树脂自然凝固。
[0058]
(7)镜下观察：在多功能显微镜下，分别在200x和400x视野下观察组织内细胞状态，并在皮层及海马ca1区、ca3区、dg区取图，每组4只大鼠，统计200x视野下损伤细胞数目。结果见图6、图7，图6-a、6-b、6-c及6-d分别代表大脑皮层、海马ca1、ca3及dg区200x及400xhe染色图，如图6所示：缺血组大脑皮层及海马ca1区、ca3区、dg区神经元排列紊乱，核固缩，胞浆空泡样改变，表明神经细胞受损严重；香椿子多酚组神经元数量明显增加，神经细胞排列及形态均有明显改善。图7-a、7-b、7-c及7-d分别为对应区域损伤神经元百分比统计图。如图所示：与假手术组相比，缺血模型组皮层、海马ca1区、ca3区及dg区损伤神经元百分比在均有明显增加(分别为p《0.01，p《0.01，p《0.01，p《0.05)；香椿子多酚可以减轻脑缺血导致的各个区域的神经元死亡(分别为p《0.01，p《0.05，p《0.01，p《0.05)。