一种多肽修饰的金团簇及通过抑制组织蛋白酶B活性抗肿瘤侵袭转移的应用的制作方法

一种多肽修饰的金团簇及通过抑制组织蛋白酶b活性抗肿瘤侵袭转移的应用
技术领域
1.本发明涉及一种生物制剂及抑制肿瘤侵袭转移的应用，具体涉及一种基于多肽修饰的金团簇作为生物制剂，通过抑制组织蛋白酶b活性从而抑制肿瘤侵袭转移的应用。


背景技术：

2.癌症是严重危害人类健康的疾病之一，一旦病情恶化，癌细胞将发生侵袭并快速转移至人体内各个组织器官，是造成肿瘤患者死亡的主要原因。组织蛋白酶b(cathepsin b，ctsb)被认为是一种重要的促肿瘤因子，与癌症侵袭和转移密切相关。ctsb参与细胞外基质降解，这一过程促使肿瘤微血管的生成和肿瘤迁移、侵袭、转移发生。研究发现，ctsb在许多恶性肿瘤中高表达或过表达，因此通过设计合理高效的ctsb抑制剂来抑制这一蛋白酶的活性可作为潜在的癌症治疗的新方法。
3.然而目前已发现的ctsb小分子抑制剂如环氧琥珀酸肽类、氮丙啶类等，虽然对其活性的抑制有很好的效果，但是存在选择性差、在体内稳定性不佳、细胞毒副作用等问题而得不到临床应用。近期的研究表明，含金化合物可以通过与蛋白酶活性位点成键从而抑制酶活性，ctsb的催化活性依赖于活性位点上的半胱氨酸(cys)，因此利用cys作为抗癌药物的重要靶点，其与含金化合物进行配体交换形成金-硫键，来达到抑制半胱氨酸蛋白酶活性的目的是一种潜在的抑制酶活的策略。然而传统的含金化合物的作用有限，是因为有些化合物不容易被细胞摄取，以及对蛋白质巯基的非特异反应性极大地限制了其抗肿瘤侵袭转移能力。例如一种治疗类风湿关节炎的药物金诺芬虽然能够抑制ctsb的活性，但是其缺乏靶向性导致抑制效力较弱，ic
50
～250μm。因此，提高含金化合物与ctsb活性位点半胱氨酸的特异性靶向结合能力是设计含金化合物作为抑制癌细胞侵袭转移的潜在药物的关键。
4.金团簇是由几个至几百个金原子构成的分子聚集体，其粒径一般小于几纳米，尺寸介于原子和纳米颗粒之间。小尺寸粒径使其具备了原子和大的纳米颗粒不具备的物理、化学性质。而多肽保护的金团簇具有良好的荧光特性、稳定性、低毒性、表面易被修饰、良好的生物相容性等特点，广泛应用于生物分析检测、肿瘤诊断与治疗等领域。基于此，根据ctsb活性位点的结构特点，通过合理设计具有靶向ctsb蛋白酶活性位点的多肽序列，即设计的多肽序列既包含组织蛋白酶b底物肽序列，又引入带电氨基酸和疏水性氨基酸提高靶向结合的稳定性，合成高选择性、高效抑制ctsb活性的多肽保护的金团簇，从而抑制肿瘤细胞外基质降解，对抑制恶性肿瘤的侵袭转移具有潜在的治疗作用。


技术实现要素：

5.本技术提供了一种多肽修饰的金团簇作为生物制剂用于抑制组织蛋白酶b活性，从而抗肿瘤侵袭转移的应用。
6.一种多肽修饰的金团簇，其特征在于，多肽与金团簇结合；通过一步法混合金盐溶液和特定序列多肽，在碱性条件下反应。
7.在一个实施方案中，与多肽结合的金团簇的合成是通过一步法混合金盐溶液和特定序列多肽。多肽的构成是在氮末端或碳末端引入半胱氨酸-半胱氨酸-酪氨酸(ccy)序列用于原位矿化和锚定金团簇。同时引进一段ctsb底物肽序列。另外，引入疏水性颉氨酸(v)和脯氨酸(p)用于促进金团簇与ctsb催化中心的疏水相互作用，引入甘氨酸-甘氨酸(gg)来增强多肽柔性。当多肽结合的金团簇暴露于癌细胞一段时间后，显著抑制了癌细胞分泌的ctsb的活性，使癌细胞侵袭转移能力减弱。
8.多肽包含的氮末端或碳末端的氨基酸可以是半胱氨酸，酪氨酸，精氨酸，赖氨酸，颉氨酸，脯氨酸，甘氨酸的氨基酸；所述多肽包含一个特定的rr的氨基酸序列。所述多肽包含一个特定的gflg的氨基酸序列。所述多肽包含一个特定的alal的氨基酸序列。
9.所述多肽-金团簇是通过一步法混合所述多肽和氯金酸盐溶液，在碱性、37℃条件下反应合成的。其中所述多肽的浓度和所述金团簇浓度小于1000μm。其中所述多肽的浓度和所述金团簇浓度小于100μm。暴露所述多肽-金团簇于肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞高表达的ctsb活性，从而抑制癌细胞的侵袭转移能力。
10.抑制ctsb高表达特定肿瘤细胞类型的侵袭转移能力，包括以下步骤：合成具有一级序列靶向于所述肿瘤细胞类型ctsb活性位点的多肽；生成所述多肽-金团簇；一定浓度的所述多肽-金团簇作用于癌细胞后，通过抑制ctsb的活性抑制所述癌细胞侵袭转移。
11.在一个实验方案中，所述肽h2n-ccyggprrrkrvg-cooh包含ctsb裂解底物肽序列rr。
12.在另一个实验方案中，所述肽h2n-ccyggpgflgkvg-cooh包含ctsb裂解底物肽序列gflg。
13.在另一个实验方案中，所述肽h2n-ccyggpalalkvg-cooh包含ctsb裂解底物肽序列alal。
14.所公开的创新，在各种实施例中，提供一个或多个的至少下述优点。然而，并非所有这些优点都来源于每一个创新点，并且这些优点并不限制各个要求保护的发明。
15.多肽-金团簇通过抑制ctsb的活性显示了其作为抑制癌症侵袭转移的生物治剂的巨大潜力。多肽-金团簇在成为替代金化合物和有机小分子抑制剂，并具有高效ctsb活性抑制能力，具有良好的生物相容性和对癌细胞的侵袭转移抑制方面展现巨大潜力。
附图说明
16.图1a，1b和1c显示了三种多肽-金团簇的荧光激发和发射光谱；图1a是pep
ⅰ‑
au团簇的光谱图；图1b是pep
ⅱ‑
au团簇的光谱图；图1c是pep
ⅲ‑
au团簇的光谱图。
17.图2a，2b和2c显示了不同浓度三种多肽-金团簇抑制ctsb人重组蛋白酶的酶活能力。图2a显示了pep
ⅰ‑
au团簇抑制人重组蛋白ctsb的酶活的荧光动力学分析图谱、ctsb相对活力与金浓度关系图以及金团簇的半抑制浓度ic
50
值；图2b显示了pep
ⅱ‑
au团簇抑制人重组蛋白ctsb的酶活的荧光动力学分析图谱、ctsb相对活力与金浓度关系图以及金团簇的半抑制浓度ic
50
值；图2c显示了pep
ⅲ‑
au团簇抑制人重组蛋白ctsb的酶活的荧光动力学分析图谱、ctsb相对活力与金浓度关系图以及金团簇的半抑制浓度ic
50
值。
18.图3a，3b和3c显示了不同浓度各种多肽-金团簇与三阴性乳腺癌细胞mda-mb-231细胞共培养24h、48h后的细胞存活率。图3a显示出mda-mb-231细胞与pep
ⅰ‑
au团簇共培养的
tyr-gly-gly-pro-ala-leu-arla-leu-lys-val-gly)；
26.1.1多肽-金团簇的合成
27.三种多肽pepⅰ(cys-cys-tyr-gly-gly-pro-arg-arg-arg-lys-arg-val-gly)，pepⅱ(cys-cys-tyr-gly-gly-pro-gly-phe-leu-gly-lys-val-gly)，和pepⅲ(cys-cys-tyr-gly-gly-pro-ala-leu-arla-leu-lys-val-gly)由北京亚美多肽生物科技有限公司合成，所有玻璃器皿都用王水(3：1体积比的浓盐酸：浓硝酸)浸泡，然后用超纯水和乙醇冲洗，70℃烘箱烘干。
28.三种不同多肽序列的金团簇制备条件，pep
ⅰ‑
au在剧烈搅拌下，25mm,133μl的氯金酸水溶液缓慢滴加到1.25mm，2.65ml的肽溶液中。5min后加入0.5mm，83μl的氢氧化钠溶液，得到的最终体系的ph值为9。然后将混合物继续在37℃下以900rpm/min继续避光搅拌24h，反应结束后在搅拌条件下逐滴加入0.1mm hcl调节ph至中性，室温静置12h。
29.pep
ⅱ‑
au：在剧烈搅拌下，25mm,159μl的氯金酸水溶液缓慢滴加到1.25mm，3.18ml的多肽溶液中。5min后加入0.5mm，398μl的氢氧化钠溶液。然后将混合物继续在37℃下以500rpm/min继续避光搅拌48h。
30.pep
ⅲ‑
au：在剧烈搅拌下，首先将0.5mm，400μl的氢氧化钠溶液缓慢滴加到1.5mm，2.16ml的肽溶液中。然后加入25mm,128μl的氯金酸水溶液。5min后逐滴加入0.5mm，400μl的氢氧化钠溶液。然后将混合物继续在37℃下以500rpm/min继续避光搅拌24h。
31.纯化处理：先将金团簇加入到超滤管中(millipore,ultracel-100k)，3500r离心超滤30min,每10min停下混匀，向里面加入超纯水。收集超滤管外管的金团簇溶液，去除超滤管内管的大颗粒。将上述超滤管外管金团簇溶液加入到ultracel-10k的超滤管，将反应样品浓缩以除去未反应的游离肽，游离氢氧化钠和自由氯金酸。之后3500r离心30min,每10min停下混匀，向里面加入0.01m pbs缓冲溶液。收集超滤管内管的金团簇溶液，并避光储存在4℃中。
32.由此获得的多肽-金团簇在室温或4℃下至少可以稳定三个月存在。
33.图1a，图1b，图1c分别显示了pep
ⅰ‑
au，pep
ⅱ‑
au，pep
ⅲ‑
au团簇特有的激发和发射光谱。图1a显示出了pep
ⅰ‑
au团簇的激发峰在526nm，发射峰在680nm。图1b显示出了pep
ⅱ‑
au团簇的激发峰在498nm，发射峰在647nm。图1c显示出了pep
ⅲ‑
au团簇的激发峰在505nm，发射峰在655nm。所有激发和发射光谱都显示出尖锐的峰。
34.1.2.肿瘤细胞培养
35.人三阴性乳腺癌细胞mda-mb-231是在gibco公司购买的dmem培养基中进行的，并补充购自gibco公司的10％的胎牛血清fbs和1％青霉素，链霉素溶液，在5％co2和37℃湿润的培养基中培养的。
36.1.3.金团簇抑制ctsb活性试管实验
37.ctsb在癌症的发生发展中起到了关键性作用，参与了其中各个阶段，包括癌细胞的产生和发展、肿瘤微血管的形成、癌细胞的侵袭转移等。研究表明，ctsb通过直接降解细胞外基质，或间接激活纤溶酶原激活剂和基质金属蛋白酶，引发蛋白水解级联反应等方式破坏一系列组织屏障，促进癌症细胞向深部组织浸润，从而参与癌症的侵袭转移。前人研究已经表明ctsb在肿瘤侵袭和转移中起到至关重要的作用，并被建议作为抗癌药物开发的新靶点。
38.本实验采用k147-100试剂盒进行ctsb活性抑制剂筛选。ctsb抑制剂筛选试剂盒利用ctsb酶切afc-偶联的多肽，释放易于被荧光仪或者荧光酶标仪定量的afc(ex/em＝400/505nm)。当存在ctsb的特异性抑制剂时，底物的酶切将会减少或者终止，表现为afc荧光的减弱或彻底消失。因此通过荧光强度变化差异可以计算出ctsb的活力水平。首先将人重组ctsb稀释于100mm磷酸缓冲溶液(ph＝6)，加入ctsb试剂包含0.1％peg 8000，5mm半胱氨酸，和1.5mm edta，用于ctsb酶的激活。然后取一系列浓度梯度的不同类型的多肽-金团簇与ctsb纯蛋白混合，将黑色衬底的96孔板置于冰上孵育15min。然后每孔加入50μl ctsb特异性荧光底物z-rr-afc，终浓度为100μm。同时以不同浓度的抑制剂与荧光底物混合作为对照组排除金团簇自发荧光等干扰因素。于37℃酶标仪测试反应体系ex＝400nm，em＝505nm处荧光动力学曲线。通过公式计算ctsb活性抑制率，并以此建立ctsb相对活性与金团簇种类及其浓度之间的关系，然后使用graph pad prism软件计算ic
50
值。金团簇按照金原子浓度梯度分别设置为0、0.1、1、5、10、100、200、500、1000μm。
39.图2a，2b，2c显示出三种多肽-金团簇试管实验抑制ctsb活性对金浓度具有浓度依赖性。图2a显示pep
ⅰ‑
au团簇对ctsb活性的半抑制浓度ic
50
为11.02
±
1.17μm(按金原子浓度计量)；图2b显示pep
ⅱ‑
au团簇对ctsb活性的半抑制浓度ic
50
为22.55
±
3.05μm(按金原子浓度计量)；图2c显示pep
ⅲ‑
au团簇对ctsb活性的半抑制浓度ic
50
为31.64
±
2.74μm(按金原子浓度计量)。三种不同多肽序列的金团簇在试管实验中均对人重组ctsb活性有显著的抑制作用。但是多肽链中靶向肽段序列的不同引起的抑制剂与半胱氨酸蛋白酶活性位点的亲和力存在差异，导致了在相同金浓度下不同的酶活抑制效率。其中，pep
ⅰ‑
au的ic
50
最小，说明ctsb对pepⅰ序列更具底物偏好性，使更多的金与催化活性位点中的半胱氨酸结合从而显著抑制ctsb活性。
40.1.4.mda-mb-231细胞cck-8毒性实验
41.采用细胞计数试剂盒cck-8测定各种多肽-金团簇的抗肿瘤细胞增殖作用。将mda-mb-231肿瘤细胞培养于96孔板中，细胞密度为每孔1
×
104个细胞。然后将细胞放在37℃、5％co2细胞培养箱中培养，在培养基中孵育过夜后，然后与含有不同浓度金团簇的(金的原子浓度为：0、0.1、1、2.5、5、10、20、30μm)培养基分别共孵24h、48h。每个实验组含有五个平行样品。共孵结束后吸出培养基然后用pbs每孔洗三遍。随后向每个含有100μl培养基孔中加入10μlcck-8溶液在培养箱中孵育2h。然后设置酶标仪参数在450nm测每孔的吸光度。所有数据平行测三次，以没有处理过的细胞吸光度值为参比。记录数据并计算细胞的最终活度。
42.图3a，3b和3c中显示出了三种多肽-金团簇处理mda-mb-231细胞24h后的细胞存活率。图3a显示出了30μm的pep
ⅰ‑
au团簇处理mda-mb-231细胞24h后的细胞存活率保持在85％以上，48h后细胞活力仍能保持在80％以上；图3b显示出了30μm的pep
ⅱ‑
au团簇处理mda-mb-231细胞24h后的细胞存活率保持在95％以上，48h后细胞活力仍能保持在90％以上；图3c显示出了30μm的pep
ⅲ‑
au团簇处理mda-mb-231细胞24h后的细胞活力保持在100％左右，48h后细胞活力仍能保持在95％以上。说明这种团簇类抑制剂对ctsb活性起到有效抑制作用的同时对mda-mb-231细胞未产生明显的细胞毒性，具有良好的生物相容性。
43.1.5.金团簇抑制mda-mb-231细胞分泌的ctsb活性
44.浸润性癌细胞显示ctsb的溶酶体定位从核周到外周区域改变，ctsb分泌到细胞外
间隙。活化的ctsb除了自身参与胞外基质成分的降解外，还能激活蛋白水解级联反应，最终生成能够降解多种胞外基质成分的物质，继而为癌细胞的移动打开通道，促进肿瘤细胞向深部组织浸润。为了评估金团簇对mda-mb-231细胞外ctsb活性的抑制能力，取处于对数生长期状态良好的mda-mb-231细胞，通过pbs缓冲液洗涤，胰蛋白酶消化，完全培养基重悬，细胞计数，调整细胞密度为1
×
105个/ml。取100μl接种于紫外杀菌30min后的黑色衬底96孔板。外围每孔加100μl pbs减少培养基蒸发。在co2恒温培养箱中培养24h后，每孔取90μl于新的96孔板，加入10μl不同浓度金团簇(0、0.1、1、5、10、100、200μm)冰上孵育15min，然后每孔加入50μl ctsb特异性荧光底物z-rr-afc，终浓度为100μm。在酶标仪中，37℃条件下对荧光降解产物(ex＝400nm；em＝505nm)的形成进行了监测。
45.图4a，4b和4c显示出用三种多肽-金团簇抑制mda-mb-231细胞外ctsb活性。图4a显示出200μm pep
ⅰ‑
au团簇对mda-mb-231细胞外ctsb活性抑制率可达到70.7
±
3.9％；图4b显示出200μm pep
ⅱ‑
au团簇对mda-mb-231细胞外ctsb活性抑制率可达到63.4
±
2.7％；图4c显示出200μm pep
ⅲ‑
au团簇对mda-mb-231细胞外ctsb活性抑制率可达到57.3
±
4.6％。说明三种由ctsb底物肽修饰的金团簇抑制剂均对mda-mb-231细胞外分泌活化的ctsb具有明显的抑制作用，且与体外试管实验中三种抑制剂的半数抑制浓度相对应。其中pep
ⅰ‑
au团簇ic
50
值最低，在mda-mb-231细胞外ctsb活性抑制实验中也表现出了最优的结果。进一步说明修饰多肽序列的差异影响了金团簇与ctsb活性位点半胱氨酸的结合能力而导致抑制效率的差异。
46.1.6.金团簇与mda-mb-231细胞共孵育的细胞划痕实验
47.研究发现ctsb在各种恶性肿瘤中均有过表达的情况，例如乳腺癌、胃癌、肺癌、膀胱癌等。其表达水平的升高、活性的增强对肿瘤侵袭和转移有很大的促进作用，被认为是许多癌症的生物标志物。为了评估金团簇对ctsb高表达的mda-mb-231的细胞迁移的抑制能力，首先将mda-mb-231细胞均匀接种在六孔板上，使其呈现单分散层。第二天用500μl的枪头的尖头垂直于底面在六孔板中划一条直线，并用pbs冲洗两次去除细胞碎片。然后加入含有金团簇(金原子浓度：20μm)的2ml无血清培养基dmem孵育处理细胞24h，同时设置pbs、peptide处理的细胞作为对照组。随后弃去原培养基，用pbs清洗2次后将细胞用3.7％的多聚甲醛固定30min，用pbs冲洗两次，然后用0.1％的结晶紫染液染色10min。最后用pbs洗干净，用倒置荧光显微镜拍照观察，测量伤口宽度。
48.图5a，5b和5c显示出用pbs处理(左)，pep-au团簇处理(中)、peptide处理(右)mda-mb-231细胞后的伤口愈合实验。在图5a，5b和5c中，对照组pbs和peptideⅰ、ⅱ和ⅲ处理后划痕处的伤口距离明显小于三种不同pep-au团簇抑制剂处理组。说明mda-mb-231细胞经pep-au团簇共孵育24h后，癌细胞ctsb活性得到有效抑制，从而达到抑制癌细胞转移能力的效果。
49.序列表
50.《110》北京工业大学
51.《120》一种多肽修饰的金团簇及通过抑制组织蛋白酶b活性抗肿瘤侵袭转移的应用
52.《160》3
53.《210》1
54.《211》13
55.《212》prt
56.《213》“人工序列”57.《400》1
58.cys-cys-tyr-gly-gly-pro-arg-arg-arg-lys-arg-val-gly
59.《210》2
60.《211》13
61.《212》prt
62.《213》人工序列
63.《400》2
64.cys-cys-tyr-gly-gly-pro-gly-phe-leu-gly-lys-val-gly
65.《210》3
66.《211》13
67.《212》prt
68.《213》“人工序列”69.《400》3
70.cys-cys-tyr-gly-gly-pro-ala-leu-arla-leu-lys-val-gly