用于长期离体维持或扩增人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓系祖细胞的方法及其应用与流程

用于长期离体维持或扩增人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓系祖细胞的方法及其应用
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2021年12月2日提交的、美国非临时专利申请序列号17/540,777和2020年12月4日提交的、美国临时专利申请序列号63/121,419的优先权益，二者通过引用整体并入本文。
技术领域
3.本发明提供了人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞和人普通髓系祖细胞的长期离体维持或扩增的方法及其应用。
4.发明背景
5.人体造血系统包括适应性免疫细胞、先天免疫细胞、巨核细胞和红细胞。所有这些细胞类型均源自人造血干细胞(hhsc)，其分化为普通淋巴祖细胞和普通髓系祖细胞(hcmp)。普通淋巴祖细胞进一步发育为适应性免疫细胞，包括b淋巴细胞和t淋巴细胞；普通髓系祖细胞成熟为巨核细胞-红系祖细胞(hmep)或粒细胞-单核细胞祖细胞(hgmp)。此外，巨核细胞-红系祖细胞可以进一步分化为巨核细胞和成红细胞，最终成熟为血小板和红细胞。另一方面，粒细胞-单核细胞祖细胞成熟为先天免疫细胞，包括单核细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞。单核细胞最终分化为巨噬细胞和树突细胞。
6.不同的细胞在临床实践中发挥着不同的作用，然而，缺乏一种离体大规模扩增和长期维持人体细胞的方法，这阻碍了临床应用。已经报道了一些扩增髓源细胞或其祖细胞的方法，其中大多数使用了许多不同的生长因子组合。然而，在这些方法中只能获得有限的从人体扩增细胞的能力。
7.发明概述
8.本发明提供了一种用于长期离体维持或扩增人红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞和人普通髓系祖细胞的方法及其应用。
9.本发明提供了一种用于长期离体维持或扩增人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓系祖细胞中的一种或多种的方法，其包括以下步骤：
10.在培养基中培养包含人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓系祖细胞中的一种或多种的细胞，其中所述培养基包含选自端锚聚合酶抑制剂(a tankyrase inhibitor)、生长因子、b-raf激酶抑制剂和gsk-3抑制剂中的一种或多种。
11.在至少一个实施方案中，所述端锚聚合酶抑制剂是xav939、az-6102、jw-55、mn-64、tc-e 5001、wiki4、rk-287107、msc2504877或g007-lk中的一种或多种。
12.在至少一个实施方案中，所述端锚聚合酶抑制剂是xav939。
13.在至少一个实施方案中，所述培养基中，端锚聚合酶抑制剂的浓度是0.1μm至900μm。
14.在至少一个实施方案中，所述b-raf激酶抑制剂是gdc-0879、plx4032、l-779450、gsk2118436、l-779450、dabrafenib、raf709、bms-908662、lgx818、plx3603、raf265、
ro5185426、维莫非尼(vemurafenib)、plx8394或sb590885中的一种或多种。
15.在至少一个实施方案中，所述b-raf激酶抑制剂是sb590885。
16.在至少一个实施方案中，所述gsk-3抑制剂是chir99021、chir98014、ly2090314、alsterpaullone、bio-acetoxime、azd1080、2-d08、sb216763、bio、sb415286、tws119、tideglusib、a1070722或ar-a014418中的一种或多种；可选地，所述gsk-3抑制剂是chir99021。
17.在至少一个实施方案中，所述生长因子是干细胞因子(scf)。
18.在至少一个实施方案中，所述培养基中b-raf激酶抑制剂的浓度为0.1μm至70μm，所述培养基中端锚聚合酶抑制剂的浓度为0.1μm至900μm，所述培养基中gsk-3抑制剂的浓度为0.1μm至70μm，并且所述培养基中干细胞因子的浓度为10ng/ml至100ng/ml。
19.在至少一个实施方案中，所述培养基的基础培养基包括dmem/f12、imdm和神经细胞基础培养基(neural basal medium)中的一种或多种。
20.在至少一个实施方案中，所述培养基中的dmem/f12和神经细胞基础培养基的比例为5:1至1:5。
21.在至少一个实施方案中，所述培养基中的imdm和神经细胞基础培养基的比例为5:1至1:5。
22.在至少一个实施方案中，所述培养基中使用的dmem/f12和神经细胞基础培养基的比例为1:1。
23.在至少一个实施方案中，所述端锚聚合酶抑制剂是xav939，所述b-raf激酶抑制剂是sb590885，所述gsk-3抑制剂是chir99021，并且所述生长因子是干细胞因子。
24.在至少一个实施方案中，所述培养基中xav939的浓度为0.1μm至20μm；所述培养基中sb590885的浓度不超过5μm，任选为0.1μm至5μm；所述培养基中chir99021的浓度不超过10μm，任选为0.1μm至10μm；所述培养基中干细胞因子的浓度为10ng/ml至100ng/ml。
25.在至少一个实施方案中，所述培养基进一步包含选自胰岛素、转铁蛋白、hsa、腐胺、孕酮或亚麻酸的一种或多种补充剂。
26.在至少一个实施方案中，所述培养基补充有胰岛素、转铁蛋白、hsa、腐胺、孕酮和亚麻酸。
27.在至少一个实施方案中，人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓系祖细胞源自干细胞；可选地，其源自造血干细胞；进一步可选地，所述造血干细胞为人脐带血单个核细胞形式。
28.在至少一个实施方案中，人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人髓系祖细胞中的任何细胞均能在离体培养基中长期扩增，扩增后获得的细胞在形态上保持不变并具有分化的能力，以及扩增后获得的细胞是cd46

的。
29.本发明还提供了一种对通过权利要求1所述方法获得的人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓系祖细胞中的一种或多种进行基因修饰的方法，其包括以下步骤：
30.使用基因编辑系统、同源重组或定点诱变，对通过权利要求1所述方法扩增的人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓系祖细胞中的一种或多种细胞进行基因工程修饰；可选地，所述基因编辑系统是基于talen或crispr的系统。
31.在至少一个实施方案中，所述基因工程修饰包括置换或破坏现有基因(敲除)，或
改变基因座以包含在该基因座不存在的序列信息(敲入)。
32.在至少一个实施方案中，所述基因工程修饰是用ad35腺病毒操作的。
33.本发明还提供了一种分化通过权利要求1所述方法扩增的人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓系祖细胞中的一种或多种细胞的方法，其包括以下步骤：用分化培养基培养所述人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞及人普通髓系祖细胞。
34.在至少一个实施方案中，所述分化培养基是中性粒细胞分化培养基，其包含rpmi 1640培养基、dmem培养基、10％fbs和20ng/ml的gcsf中的一种或多种。
35.在至少一个实施方案中，所述分化培养基是单核细胞分化培养基，其包含rpmi 1640培养基、dmem培养基、10％fbs和20ng/ml的gm-csf中的一种或多种。
36.在至少一个实施方案中，所述分化培养基是红细胞分化培养基，其包含imdm、胰岛素、全转铁蛋白、il-3、epo和scf中的一种或多种。
37.本发明还提供了一种用于长期离体维持或扩增人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓系祖细胞中的一种或多种的培养基，其包含选自端锚聚合酶抑制剂、生长因子、b-raf激酶抑制剂和gsk-3抑制剂中的一种或多种。
38.在至少一个实施方案中，所述端锚聚合酶抑制剂是xav939、az-6102、jw-55、mn-64、tc-e 5001、wiki4、rk-287107、msc2504877或g007-lk中的一种或多种。
39.在至少一个实施方案中，所述端锚聚合酶抑制剂是xav939。
40.在至少一个实施方案中，所述培养基中端锚聚合酶抑制剂的浓度为0.1μm至900μm。
41.在至少一个实施方案中，b-raf激酶抑制剂是gdc-0879、plx4032、gsk2118436、l-779450、dabrafenib、raf709、bms-908662、lgx818、plx3603、raf265、ro5185426、维莫非尼、plx8394或sb590885中的一种或多种。
42.在至少一个实施方案中，b-raf激酶抑制剂是sb590885。
43.在至少一个实施方案中，gsk-3抑制剂是chir99021、chir98014、ly2090314、alsterpaullone、bio-acetoxime、azd1080、2-d08、sb216763、bio、sb415286、tws119、tideglusib、a1070722或ar-a014418中的一种或多种。
44.在至少一个实施方案中，gsk-3抑制剂是chir99021。
45.在至少一个实施方案中，所述生长因子是干细胞因子(scf)。
46.在至少一个实施方案中，所述培养基中b-raf激酶抑制剂的浓度为0.1μm至70μm，所述培养基中端锚聚合酶抑制剂的浓度为0.1μm至900μm，所述培养基中gsk-3抑制剂的浓度为0.1μm至70μm，并且所述培养基中干细胞因子的浓度为10ng/ml至100ng/ml。
47.在至少一个实施方案中，所述培养基的基础培养基包括dmem/f12、imdm和神经细胞基础培养基。
48.在至少一个实施方案中，所述培养基中的dmem/f12和神经细胞基础培养基的比例为5:1至1:5，可选地，其比例为1:1。
49.在至少一个实施方案中，所述培养基中的imdm和神经细胞基础培养基的比例为5:1至1:5，可选地，其比例为1:1。
50.在至少一个实施方案中，所述端锚聚合酶抑制剂是xav939，所述b-raf激酶抑制剂是sb590885，所述gsk-3抑制剂是chir99021，所述生长因子是干细胞因子。
51.在至少一个实施方案中，所述培养基中xav939的浓度为0.1μm至20μm；所述培养基中sb590885的浓度不超过5μm，任选为0.1μm-5μm；所述培养基中chir99021的浓度不超过10μm，任选为0.1μm-10μm；所述培养基中干细胞因子的浓度为10ng/ml至100ng/ml。
52.在至少一个实施方案中，所述培养基进一步包含选自胰岛素、转铁蛋白、hsa、腐胺、孕酮和亚麻酸中的一种或多种补充剂。
53.在至少一个实施方案中，所述培养基补充有胰岛素、转铁蛋白、hsa、腐胺、孕酮和亚麻酸。
54.在至少一个实施方案中，人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓系祖细胞源自脐带血单个核细胞、造血干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞或非胚胎(成体)干细胞。
55.在至少一个实施方案中，人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓系祖细胞中的任一种细胞均可以在离体培养基中长期扩增，扩增后得到的细胞形态保持不变并具有分化能力。
56.通过本发明的长期离体扩增而产生的人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞和人普通髓系祖细胞可以容易地分化为巨噬细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突细胞、血小板和红细胞。此外，其还容易受到基因修饰技术的影响，从而可以在基础科学研究和临床治疗应用中遗传性利用人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞和人普通髓系祖细胞。预期源自基因修饰的人普通髓系祖细胞的基因修饰的巨噬细胞具有增强的抗肿瘤作用，可用于临床治疗癌症，无论是作为单一疗法还是与其它免疫制剂如抗pd-1/pd-l1抗体和嵌合抗原受体t(car-t)细胞的联合疗法。此外，预期源自基因修饰的人成红细胞的基因修饰的红细胞也具有抗病毒作用和抗肿瘤作用，可用于临床治疗不同类型的癌症。
57.所述端锚聚合酶抑制剂或者端锚聚合酶抑制剂与生长因子、b-raf激酶抑制剂和gsk-3抑制剂的组合在扩增来自脐带血细胞的人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞和人普通髓系祖细胞方面具有巨大潜力。人脐带血中的总有核细胞在大约三周内可以扩增50至10000倍，所述细胞在这种培养基中可以维持18代或更多代。
58.附图描述
59.图1是实验组人脐带血单个核细胞的长期培养中，每次细胞传代后总细胞数的图。接种1
×
107个人脐带血单个核细胞，并在第12次传代可达到2.48
×
10
10
个细胞。
60.图2是实验组人脐带血单个核细胞的长期培养中，不同时间点的细胞的常规倒置显微镜明视野像图像。获得的细胞在形态上保持不变。
61.图3是实验组人脐带血单个核细胞的长期培养中，每次细胞传代总细胞数的倍数变化图。每次传代总细胞数的倍数变化可以通过将每次传代结束时收获的细胞的近似数量除以这次传代开始时最初接种到培养物中的近似细胞数量来计算。
62.图4是实验组人脐带血单个核细胞的长期培养中，每次细胞传代后总细胞数的总倍数变化图。每次传代后总细胞数的总倍数变化可以通过将本次传代结束时收获的细胞的近似数量除以在第0代最初接种到培养物中的细胞的近似数量来计算。
63.图5是实验组中扩增的细胞群针对标志物cd36和cd71的流式细胞仪分析图。
64.图6是扩增的细胞群在ad35-egfp重组腺病毒转导之前(左)和之后(右)针对egfp的流式细胞仪分析图。转导后72小时，76.2％的细胞呈gfp阳性。
65.图7是扩增的细胞群在分化前(左)和分化后(右)针对cd66b的流式细胞仪分析图。
66.图8是扩增的细胞群在分化前(左)和分化后(右)针对cd14的流式细胞仪分析图。
67.图9a是人脐带血单个核细胞的培养中在含有不同端锚聚合酶抑制剂的e6培养基中培养的不同实验组在不同时间点的总细胞数图。图9b和9c是人脐带血单个核细胞的培养中在分别去除sb590885或chir99021的e6培养基中培养的不同实验组在不同时间点的总细胞数图。图9d是人脐带血单个核细胞的培养中在具有不同浓度xav939的e6培养基中培养的不同实验组在不同时间点的总细胞数图。
68.图10是扩增的细胞群的单细胞测序分析图。
69.图11是分化13天后去核红细胞的benzidine和giemsa染色的图片(200
×
)。
70.图12是分化12天后成红细胞去核效率的流式细胞仪分析图。
具体实施方式
71.如本文和所附权利要求中所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数所指对象。因此，例如，提及“一种细胞”包括多种细胞，提及“人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞和人普通髓系祖细胞”包括本领域技术人员已知的一种或多种人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞和人普通髓系祖细胞及其等价物等等。
72.此外，除非另有说明，否则使用“或”表示“和/或”。类似地，“包含”、“包含的”、“包括”、“包括的”是可互换的并且不旨在有限制。应进一步理解，在各种实施方案的描述使用术语“包含”的情况下，本领域技术人员将理解，在某些特定情况下，实施方案可以替代地使用“基本上由
…
组成”或“由
…
组成”来描述。
73.除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管许多方法和试剂类似于或等同于本文所述的那些，但本文公开了示例性方法和材料。
74.出于描述和公开所述方法的目的，本文提及的所有出版物通过引用全文并入本文，其可与本文的描述结合使用。此外，对于在一个或多个出版物中出现的与本发明中明确定义的术语相似或相同的任何术语，本发明中明确提供的术语的定义将在所有方面均有限定。
75.本领域普通技术人员将理解，本发明不限于本文描述的特定方法、方案和试剂等，并且因此可以变化。本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本公开的范围，本发明的范围仅由权利要求限定。
76.除了在实践实施例中，或在另外指明的情况下，本文使用的所有表示成分的量或反应条件的数字应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。术语“约”当用于描述本公开时，与百分比相关联是指
±
10％。
77.促分裂原活化的蛋白激酶(mek)和糖原合酶激酶3(gsk3)这两种蛋白激酶的抑制，使得小鼠和大鼠胚胎干细胞(esc)能够长期自我更新。基于这一发现，本发明人假设通过抑制负责启动分化的信号传导途径，可以在长期离体培养期间维持许多(如果不是全部)类型的干细胞。正如本发明人所知，不同抑制剂的选择很重要，一些途径抑制剂可能会导致某些种类细胞死亡。在我们之前的研究中，开发了一种名为3i的培养基(补加3i组合物的基础培养基，所述3i组合物即scf sb590885 chir99021)，用于扩增粒细胞-单核细胞祖细胞，使用
其可以有效地扩增小鼠gmp细胞；然而，仅实现了有限的人细胞扩增的能力。在使用人脐带血单个核细胞进行进一步化学筛选后，发现一种可能通过靶向wnt/β-连环蛋白信号传导起作用的端锚聚合酶抑制剂，可促进人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓系祖细胞的扩增；可选地，其可促进人成红细胞扩增。所述端锚聚合酶抑制剂与生长因子、b-raf激酶抑制剂和gsk3抑制剂的组合使得可以产生亮、小、圆形细胞的均匀细胞群，这些细胞可以进一步进行长期细胞扩增。
78.本发明提供了长期离体维持或扩增人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓系祖细胞中的一种或多种的方法，所述方法包括以下步骤：在培养基中培养包括人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓系祖细胞中的一种或多种的细胞，所述培养基包含选自端锚聚合酶抑制剂、生长因子、b-raf激酶抑制剂和gsk-3抑制剂中的一种或多种。
79.本发明还提供了用于长期离体维持或扩增人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓系祖细胞中的一种或多种的培养基，所述培养基包含选自端锚聚合酶抑制剂、生长因子、b-raf激酶抑制剂和gsk-3抑制剂中的一种或多种。
80.在至少一个实施方案中，所述端锚聚合酶抑制剂是xav939、az-6102、jw-55、mn-64、tc-e 5001、wiki4、rk-287107、msc2504877或g007-lk中的一种或多种。
81.在至少一个实施方案中，所述端锚聚合酶抑制剂是xav939。
82.在至少一个实施方案中，所述培养基中端锚聚合酶抑制剂的浓度为0.1μm至900μm。
83.在至少一个实施方案中，b-raf激酶抑制剂是gdc-0879、plx4032、gsk2118436、l-779450、dabrafenib、raf709、bms-908662、lgx818、plx3603、raf265、ro5185426、维莫非尼(vemurafenib)、plx8394或sb590885中的一种或多种；或者，b-raf激酶抑制剂是sb590885。
84.在进一步的实施方案中，gsk-3抑制剂是chir99021、chir98014、ly2090314、alsterpaullone、bio-acetoxime、azd1080、2-d08、sb216763、bio、sb415286、tws119、tideglusib、a1070722或ar-a014418中的一种或多种。
85.在至少一个实施方案中，gsk-3抑制剂是chir99021。
86.在至少个实施方案中，所述生长因子是干细胞因子(scf)。
87.在至少一个实施方案中，所述培养基中b-raf激酶抑制剂的浓度为0.1μm至70μm，培养基中端锚聚合酶抑制剂的浓度为0.1μm至900μm，培养基中gsk-3抑制剂的浓度为0.1μm至70μm，培养基中干细胞因子的浓度为10ng/ml至100ng/ml。
88.在至少一个实施方案中，所述培养基的基础培养基包括dmem/f12和神经细胞基础培养基。所述基础培养基是指氨基酸、维生素、盐和营养素的溶液，其有效支持培养细胞的生长。所述营养素包括可以被细胞代谢的碳源(例如糖类，如葡萄糖)，以及细胞存活所必需的其它化合物。这些化合物是细胞本身因为缺少一种或多种编码合成所述化合物所需蛋白质(例如必需氨基酸)的基因而无法合成的化合物，或者是细胞可以合成的化合物，然而由于其特定的发育状态，编码必需的生物合成蛋白质的基因未能以足够的水平表达。许多基础培养基是哺乳动物细胞培养领域已知的，例如dulbecco's modified eagle media(dmem)、iscove's modified dulbecco's medium(imdm)、rpmi 1640、knockout-dmem(ko-dmem)、dmem/f12和神经细胞基础培养基。或者，可以使用包含比例为5:1至1:5的dmem/f12和神经细胞基础培养基的培养基来培养人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓
系祖细胞。
89.在至少一个实施方案中，所述端锚聚合酶抑制剂是xav939，b-raf激酶抑制剂是sb590885，gsk-3抑制剂是chir99021，生长因子是干细胞因子。人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓系祖细胞可以在包含多种因子和剂的组合的培养基中生长和扩增，所述因子和剂包括但不限于生长因子(例如scf)、端锚聚合酶抑制剂(例如xav939)、b-raf激酶抑制剂(例如sb590885)和gsk-3抑制剂(例如chir99021)。
90.在至少一个实施方案中，所述培养基中xav939的浓度为0.1μm至20μm；培养基中sb590885的浓度不超过5μm、0.1μm-5μm；培养基中chir99021的浓度不超过10μm、0.1μm-10μm；培养基中干细胞因子的浓度为10ng/ml至100ng/ml。
91.在至少一个实施方案中，所述培养基可以补充有一种或多种另外的剂，所述剂包括但不限于胰岛素、转铁蛋白、hsa、腐胺、孕酮、亚麻酸。所述基础培养基可补充有多种其它生物剂，这些生物剂支持基本未分化状态下的干细胞的生长。
92.在至少一个实施方案中，人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓系祖细胞源自脐带血单个核细胞、造血干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞或非胚胎(成体)干细胞。干细胞是能分化为其它细胞类型的细胞，包括具有特定专化功能的细胞(例如，组织特异性细胞、实质细胞及其祖细胞)。祖细胞(即“专能的”)是可以产生不同终末分化细胞类型的细胞，以及能够产生各种祖细胞的细胞。产生生物体的一些或多种(但不是全部)细胞类型的细胞通常被称为“多能”干细胞，其能分化为成熟生物体内的任何细胞类型，但是在不重编程的情况下这些干细胞不能去分化为其来源细胞。应当理解，“专能”干细胞/祖细胞(例如人普通髓系祖细胞(hcmp))具有比多能干细胞更窄小的分化潜能。在衍生为hcmp之前，本文公开的干细胞可以通过使用多种基因工程技术进行基因修饰，例如基因治疗、基因编辑系统、同源重组等。这种修饰的干细胞可以提供增强的治疗(例如参见nowakowski et al.,acta neurobiol exp(wars)73(1):1-18(2013))。
93.在至少一个实施方案中，本发明的人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓系祖细胞源自脐带血单个核细胞。脐带血是新生儿出生后留在胎盘和脐带中的血液。脐带血由全血中的所有元素组成。脐带血含有红细胞、白细胞、血浆、血小板，还含有丰富的造血干细胞。可以使用本领域教导的多种分离方法从脐带血中分离造血干细胞，包括chularojmontri et al.,j med assoc thai 92(3):s88-94(2009)中教导的那些。此外，来自多个供应商的商业试剂盒可用于从人脐带血中分离cd34

细胞(即造血干细胞)，所述供应商包括stemcell technologies、thermo fisher scientific、zen-bio等。
94.在至少一个实施方案中，本发明的人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓系祖细胞源自造血干细胞(hsc)。hsc可以很容易地从脐带血和骨髓中分离出来。这种分离方案为本领域已知，通常使用cd34

作为分离hsc的细胞选择标记(例如参见lagasse et al.,nat med.6:1229-1234(2000))。
95.在至少一个实施方案中，本发明的人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓系祖细胞源自胚胎干细胞(esc)。esc是源自人类胚胎的未分化的内细胞团的干细胞。胚胎干细胞是多能的，这意味着其能够生长(即分化)为以下三个主要胚层的所有衍生物：外胚层、内胚层和中胚层。此外，在特定条件下，胚胎干细胞能自身无限繁殖。
96.在至少一个实施方案中，本发明的人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人普通
髓系祖细胞源自诱导多能干细胞(ips或ipsc)。ipsc是一种多能干细胞，其通过选择性基因表达(内源基因)或通过异源基因转染从非多能细胞中获得。日本京都大学的shinya yamanaka团队描述了诱导多能干细胞。yamanaka已经鉴定了在胚胎干细胞中特别活跃的基因，并使用逆转录病毒用选择的这些基因转染小鼠成纤维细胞。最终，分离出对多能干细胞的产生至关重要的四个关键多能性基因：oct-3/4、sox2、c-myc和klf4。通过针对fbx15

细胞的抗生素选择来分离细胞。该小组与来自harvard、mit和university of california,los angeles的另外两个独立研究小组一起发表了一项研究，表明小鼠成纤维细胞成功重编程为ips，甚至产生了存活的嵌合体。
97.在至少一个实施方案中，本发明的人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓系祖细胞源自非胚胎(成体)干细胞。非胚胎干细胞可以自我更新，并可以分化以产生组织或器官的部分或全部主要特化细胞类型。非胚胎干细胞在生物体中的主要作用是维持和修复其所在的组织。科学家还使用术语成体干细胞(somatic stem cell)代替非胚胎干细胞，其中成体是指机体的细胞(不是生殖细胞、精子或卵子)。已经在许多器官和组织中鉴定出了非胚胎干细胞，包括脑、骨髓、外周血、血管、骨骼肌、皮肤、牙齿、心脏、肠道、肝脏、卵巢上皮和睾丸。非胚胎干细胞被认为存在于每个组织的特定区域(称为“干细胞生态位(stem cell niche)”)。在活动物中，非胚胎干细胞可在需要时进行长时间分裂，并可产生具有特定组织特征形状和特化结构和功能的成熟细胞类型。多能性(pluripotency)将胚胎干细胞与成人中发现的非胚胎干细胞区分开来；胚胎干细胞可以在体内产生所有类型的细胞，而成体干细胞是专能(multipotent)的，只能产生有限数目的细胞类型。
98.在至少一个实施方案中，人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓系祖细胞中的任一种细胞均能在离体培养基中长期扩增，扩增后获得的细胞在形态上保持不变并且具有分化能力，扩增后得到的细胞为cd46

。与先前的起始细胞群相比，可以获得4-、10-、20-、50-、100-、1000-或更多倍扩增的人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞和人普通髓系祖细胞的细胞群。每次传代的扩增程度可以通过将培养结束时收获的细胞的近似数量除以最初接种到培养物中的细胞的近似数量来计算。当受到生长环境的几何形状的限制或出于其它原因时，可以任选地将细胞传代到类似的生长环境中以进一步扩增。总的扩增是每次传代中所有扩增的积(product)。当然，没有必要在每次传代中保留所有扩增的细胞。例如，如果细胞在每次培养中扩增两倍，但每次传代仅保留约50％的细胞，然后将大约相同数目的细胞继续扩增。但是经过四次培养，称这些细胞已经扩增了16倍。细胞可以通过本领域已知的低温冷冻技术储存。在合适的条件下，扩增的细胞群中的细胞将有50％、70％或更多处于未分化状态。
99.本发明还提供了一种对通过上述方法扩增的人红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓系祖细胞中的一种或多种细胞进行基因修饰的方法，包括以下步骤：使用基因编辑系统、同源重组或定点诱变将通过上述方法扩增的人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓系祖细胞中的一种或多种细胞进行基因工程修饰；或者所述基因编辑系统是基于talen或crispr的系统。基因修饰的另一个可选实例是使用病毒载体或非病毒载体。如本文所示，本发明的细胞对基因修饰技术敏感，从而使得可以在基础科学研究和临床治疗应用中使用人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞和人普通髓系祖细胞。因此，扩增的、基因修饰的的人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞和人普通髓系祖细胞可以很容易地应用于
广泛的临床应用中。
100.在至少一个实施方案中，所述基因工程修饰包括置换或破坏现有基因(敲除)，或改变基因座以包含在该基因座处不存在的序列信息(敲入)。
101.在至少一个实施方案中，所述基因工程修饰是用ad35腺病毒操作。
102.本发明进一步提供了一种用于分化通过权利要求1的方法扩增的人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓系祖细胞中的一种或多种细胞的方法，包括以下步骤：用分化培养基培养人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞和人普通髓系祖细胞。人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓系祖细胞被分化为髓系血细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞到血小板和树突细胞。
103.在至少一个实施方案中，本文公开的方法进一步包括通过用中性粒细胞分化培养基培养细胞，将本发明的人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓系祖细胞分化为中性粒细胞和单核细胞，所述培养基包含rpmi1640、dmem、10％fbs和g-csf中的一种或多种。
104.在至少一个实施方案中，巨噬细胞分化培养基包含rpmi 1640、dmem、10％fbs和gm-csf中的一种或多种。
105.应当理解，用新鲜培养基连续地或以周期性间隔、通常每1至3天更换用过的培养基是有益的。使用新鲜培养基的一个优势是能调整条件，使细胞比根据一些技术在饲养细胞上培养或在条件培养基中培养时更均匀、更快速地进行扩增。
[0106]“生长因子”是指有效促进干细胞生长的物质，除非作为补充物添加到培养基中，否则其不是基础培养基的组分。生长因子包括但不限于干细胞因子(scf)、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、酸性成纤维细胞生长因子(afgf)、表皮生长因子(egf)、胰岛素样生长因子-i(igf-i)、胰岛素样生长因子-ii(igf-ii)、血小板衍生生长因子-ab(pdgf)和血管内皮细胞生长因子(vegf)、激活素-a、wnt和骨形态发生蛋白(bmp)、细胞因子、趋化因子、形态发生素(morphogens)、中和抗体、其它蛋白质和小分子。也可将外源生长因子加入根据本公开的培养基中以帮助维持人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓系祖细胞的培养物处于基本上未分化的状态。可以如本文别处所述或使用细胞培养领域的技术人员已知的技术来鉴定这些因子及其有效浓度。在至少一个实施方案中，人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人髓系普通祖细胞在包含人scf作为生长因子的培养基中培养。
[0107]“b-raf激酶抑制剂”是指阻断称为b-raf的蛋白质的物质。b-raf是一种帮助控制细胞生长和信号传导的激酶。其可能以突变(改变)的形式存在于某些类型的癌症中，包括黑色素瘤和结直肠癌。一些b-raf激酶抑制剂用于治疗癌症。b-raf激酶抑制剂的实例包括但不限于gdc-0879、plx4032、gsk2118436、l-779450、dabrafenib、raf709、bms-908662、lgx818、plx3603、raf265、ro5185426、维莫非尼(vemurafenib)、plx8394和sb590885中的一种或多种。在一个具体实施方案中，本文公开的方法包括使用b-raf激酶抑制剂sb590885。
[0108]“端锚聚合酶抑制剂”是指阻断称为端锚聚合酶的蛋白质的物质。端锚聚合酶，也称为端锚聚合酶1，是一种在人体中由tnks基因编码的酶。其抑制terf1与端粒dna的结合。端锚聚合酶通过介导axin1与axin2(β-连环蛋白破坏复合物的2个关键组分)的聚adp核糖基化(par化)，作为wnt信号传导途径的激活物。聚adp核糖基化的靶蛋白被rnf146识别，
rnf146介导其泛素化和随后的降解。端锚聚合酶还介导blzf1与casc3的par化，然后是rnf146的招募和随后的泛素化。端锚聚合酶介导terf1的par化，从而有助于调节端粒长度。端锚聚合酶通过介导hepacam2/miki的par化而参与前中期的中心体成熟。还可调节囊泡运输并调节slc2a4/glut4囊泡的亚细胞分布。端锚聚合酶可以通过numa1的par化参与纺锤体极(spindle pole)组装。刺激26s蛋白酶体活性。然而，端锚聚合酶抑制剂的任何作用机制均不限制本发明。端锚聚合酶抑制剂的实例包括但不限于xav939、az-6102、jw-55、mn-64、tc-e 5001、wiki4、rk-287107、msc2504877和g007-lk。在一个具体实施方案中，本文公开的方法包括使用端锚聚合酶抑制剂xav939。
[0109]
如本文所用，“gsk-3抑制剂”是指抑制糖原合酶激酶3作用的化合物或小分子。糖原合酶激酶3是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其介导磷酸分子加入丝氨酸和苏氨酸氨基酸残基上。在哺乳动物中，gsk-3由两个已知基因编码，即gsk-3α(gsk3a)和gsk-3β(gsk3b)。gsk-3最近已是许多研究的主题，因为其与许多疾病有关，包括ii型糖尿病(2型糖尿病)、阿尔茨海默病、炎症、癌症和双相情感障碍。gsk-3活跃于许多中枢细胞内信号传导途径，包括细胞增殖、迁移、葡萄糖调节和细胞凋亡。gsk-3还被证明调节免疫和迁移过程。gsk-3参与先天免疫应答中的许多信号传导途径，包括促炎细胞因子和白细胞介素的产生。gsk-3还与细胞增殖和凋亡途径密切相关。gsk-3已被证明可磷酸化β-连环蛋白，从而将其靶向降解。gsk-3抑制剂的实例包括但不限于chir99021、chir98014、ly2090314、alsterpaullone、bio-acetoxime、azd1080、2-d08、sb216763、bio、a1070722和ar-a014418。在一个具体实施方案中，本文公开的方法包括使用gsk抑制剂chir99021。
[0110]“长期离体维持或扩增”的表述表示超过2周的离体维持或扩增，例如3、4、5、6、7、8、9、10周或甚至更长时间。
[0111]
以下实施例旨在示例说明而非限制本公开。尽管以下实施例是可以使用的实施例类型，但是可以替代地使用本领域技术人员已知的其它程序。
[0112]
实施例中使用的材料是可商购的。
[0113]
实施例1：3i x组合物促进细胞扩增
[0114]
为了确定端锚聚合酶对于人成红细胞、人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓系祖细胞的长期扩增是否重要，将1
×
107个人脐带血单个核细胞接种在补充有3i x组合物(5μm chir99021 0.5μm sb590885 50ng/ml scf 0.5μm xav939)的e6培养基中作为实验组，或接种于e6培养基中作为空白组，或接种于补充有3i组合物(5μm chir99021 2μmsb590885 50ng/ml scf)的e6培养基中仅作为对照组。补充有胰岛素、转铁蛋白、hsa、腐胺、孕酮和亚麻酸的dmem/f12和神经细胞基础培养基(以1:1的比例混合)的基础培养基在本公开中被称为e6培养基。
[0115]
结果：20天后(第7次传代)，对照组中几乎一半的细胞死亡。相比之下，实验组细胞可繁殖60天以上，第12次传代时可达到2.48
×
10
10
个细胞(见图1和表1)。获得的细胞在形态上保持不变(如图2所示)。对于培养基中不含任何3i x组合物成分的空白组，细胞数随着时间的推移急剧减少，从第0天的1.19
×
106个细胞/ml至第1代时的1.90
×
105个细胞/ml，直至第2代达到2.30
×
104个细胞/ml。
[0116]
表1：每次传代后的细胞总数
[0117]
传代数对照组的细胞数实验组的细胞数
01.00e 071.00e 0710.21e 070.51e 0720.21e 070.81e 0730.66e 071.67e 0741.42e 077.96e 0751.91e 072.05e 0861.93e 076.18e 0870.66e 071.58e 098-2.59e 099-3.01e 0910-7.34e 0911-1.64e 1012-2.48e 10
[0118]
在表1中，由于培养细胞的死亡，没有获得对照组的进一步数据。
[0119]
实验组的细胞扩增可以维持到18代以上，然后逐渐停止生长(见图3和图4)。细胞数在第18次传代时增加了约104倍(如图4所示，培养72天)。
[0120]
因此，端锚聚合酶抑制剂促进细胞扩增并允许源自脐带血的细胞的长期扩增。
[0121]
实施例2：培养的细胞的单细胞测序结果
[0122]
在第7次传代，单细胞rna测序证实在实验组中总细胞的81.9％是成红细胞，实验组中总细胞的11.1％是人巨核细胞-红系祖细胞，实验组中总细胞的2.3％是人普通髓系祖细胞。
[0123]
实施例3：流式细胞仪分析表明大多数细胞是成红细胞
[0124]
cd36和cd71是成红细胞的经典表面标志物。流式细胞仪分析表明，实验组中总细胞的85.0％是cd36阳性的，实验组总细胞的55.95％是cd71阳性的(见图5)。
[0125]
实施例4：所述细胞可以用ad35腺病毒高效转导
[0126]
cd46充当b组腺病毒(包括腺病毒血清型ad35)的受体。具有cd46表达的细胞可以用ad35腺病毒高效转导。
[0127]
为了确定培养物中的细胞是否是cd46阳性的，用抗cd46-pe染色第8次传代的扩增的细胞群中的细胞。细胞的流式细胞仪分析显示，这些细胞中有98.8％是cd46阳性的，表明这些细胞可以用ad35腺病毒高效转导。
[0128]
为确定培养物中的人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓系祖细胞是否是cd46阳性的，对第8次传代的扩增的细胞群中的cd36和cd71双阴性细胞进行facs分选，然后用抗cd46-pe染色。分选的cd36和cd71双阴性细胞的流式细胞仪分析表明，这些细胞中有96.6％是cd46阳性的。这个结果表明，人巨核细胞-红系祖细胞或人普通髓系祖细胞是cd46阳性的，可以用ad35腺病毒高效转导。
[0129]
用ad35-egfp重组腺病毒转导第8次传代的细胞。转导后72小时，76.2％的细胞呈gfp阳性，感染复数(moi)为1000(如图6所示)。这些结果表明，这些细胞对ad35介导的基因操作敏感。
[0130]
实施例5：流式细胞仪分析显示所述细胞具有分化为中性粒细胞和单核细胞的能
力
[0131]
将人脐带血单个核细胞在补加了3i x组合物(同实施例1)的e6培养基中培养至第5次传代，然后转为分化培养基，所述分化培养基包括：rpmi1640培养基，10％fbs和20ng/ml gcsf。3天后，收集细胞并针对cd66b表达进行流式细胞仪分析。cd66b是人中性粒细胞的经典表面标志物。流式细胞仪分析表明，当用gcsf处理3天时，58.1％的细胞是cd66b阳性的(如图7所示)。
[0132]
将人脐带血单个核细胞在补加了3i x组合物(同实施例1)的e6培养基中培养至第5次传代，然后转为分化培养基进行分化8天，所述分化培养基包括：rpmi1640培养基，10％fbs和20ng/ml gm-csf。然后，收集细胞并进行流式细胞仪分析以测量cd14的表达。cd14是人单核细胞的经典表面标志物。流式细胞仪分析表明，当用gm-csf处理7天时，75.1％的细胞是cd14阳性的(如图8所示)。
[0133]
实施例6：不同的端锚聚合酶抑制剂可以促进细胞扩增
[0134]
将2
×
106个人脐带血单个核细胞在补加了3i组合物(同实施例1)的e6培养基中培养，作为对照组；将2
×
106个人脐带血单个核细胞在补加了3i x组合物(同实施例1)的e6培养基中培养，作为实验组，其中x为端锚聚合酶抑制剂，在不同的实验组中采用不同的端锚聚合酶抑制剂，它们选自jw55、rk-287107、wiki4、xav939或tc-e5001。
[0135]
不同实验组在第5次传代、第14天的扩增细胞数显著大于对照组(如图9a所示)。此外，在没有sb590885(如图9b)或chir99021(如图9c)的情况下，细胞可以维持，但扩增的细胞数明显低于3i x组。当xav939的浓度在0.2μm至2μm之间时，扩增的细胞数大致相同(如图9d所示)。
[0136]
此外，本发明人研究了去除sb590885、去除chir99021或采用不同浓度的xav939对细胞扩增的影响。细胞计数结果分别见表2、3和4。
[0137]
其中，不同的端锚聚合酶抑制剂可以促进细胞扩增。
[0138]
其中，端锚聚合酶抑制剂与gsk-3抑制剂和b-raf激酶抑制剂一起可以促进细胞扩增。
[0139]
浓度至少在0.2μm和2μm之间的xav939可以促进细胞扩增。
[0140]
表2：去除sb590885组的细胞总数
[0141][0142]
在表2中，由于培养细胞的死亡，没有获得e6 scf chir99021 xav组的进一步数据。
[0143]
表3：去除chir99021组的细胞总数
[0144][0145]
表4：不同浓度xav939组的细胞总数
[0146][0147]
实施例7：培养的细胞可以分化为去核红细胞
[0148]
培养的细胞在分化13天后可以分化为去核红细胞。简而言之，将由脐带血纯化的单个核细胞在e6 3i xav条件下扩增11天；然后将细胞在含有epo il3 scf的分化培养基中培养7天以扩增成红细胞。在第8至10天，从培养基中去除il3；在第11至12天，除去scf，在仅含有epo的培养基中培养细胞以增强成红细胞的去核。在第13天，将去核红细胞用benzidine和giemsa染色(如图11所示)，以及用cd235a和draq5进行流式细胞术(如图12所示)。去核红细胞cd235a draq5-的百分比约为细胞群的60％。