一种耐热核酸降解酶表达载体、构建方法及其应用与流程

1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种耐热核酸降解酶表达载体、构建方法及其应用。


背景技术：

2.随着新型冠状病毒检测市场需求的激增，pcr技术得到大范围的普及推广，全国各地也陆续建立起大量的pcr检测实验室。然而，在实验室日常运行中，经常会遇到核酸气溶胶污染的问题。核酸气溶胶污染，即dna/rna气溶胶污染，是实验室中极易出现的一种空气污染。通常情况下，空气与液体的液面摩擦、离心机离心、剧烈摇动反应管、pcr开盖、移液器反复吸样、污染物外泄等情况均会产生核酸气溶胶从而造成污染，但污染来源更多的是样本间的交叉感染。
3.核酸污染会造成pcr检测结果假阳性，造成检测结果不准确或无法判断，且核酸污染，尤其是阳性质粒引起的污染，很难自然降解清除，部分实验室甚至1个月也难以有效清除污染，上述情况严重影响了实验室的正常运行以及检测工作的正常开展。
4.核酸污染物主要为构建的含有靶基因序列的dna质粒和高拷贝数量的dna扩增产物。dnase i酶(deoxyribonuclease i)中文名称为脱氧核糖核酸酶i，是一种可以消化单链或双链dna产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。dnase i可在同一位点剪切dna双链，形成平末端，或1-2个核苷酸突出的粘末端。
5.目前，以dnase i酶为主要核酸降解因子，采用酶解法可以高效清除环境及物表的核酸污染物，用于预防或者清除核酸气溶胶污染。但是dnase i酶需要保存在-20℃以下，且不耐热，室温条件容易失活，65℃加热10分钟很快失活，并不利于该酶的保存及应用，极大地限制了其实际的应用范围。
6.因此，如何才能够提高dnase i酶的耐热稳定性，使之能够满足核酸污染清除剂的运输、保存和使用要求，成为亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

7.针对现有技术中的上述问题，本发明的目的之一在于提供一种耐热核酸降解酶表达载体，可以表达具有耐热属性以及高效的核酸内切酶活性的dnase i酶，从而提高dnase i酶的热稳定性以及在环境中的适应性。
8.本发明的目的之二在于提供一种耐热核酸降解酶表达载体的构建方法，其能够有效构建得到满足热稳定性要求的耐热核酸降解酶表达载体。
9.本发明的目的之三在于提供一种耐热核酸降解酶表达载体的应用。
10.为了实现上述目的，本发明的耐热核酸降解酶表达载体所采用的技术方案是：
11.一种耐热核酸降解酶表达载体，所述表达载体是在酿酒酵母载体上引入重组dnase i酶基因构建而成，所述重组dnase i酶基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
12.本发明的耐热核酸降解酶表达载体中包含核苷酸序列如seq id no.1所示的重组
dnase i酶基因，该基因是本发明首次克隆到的具有耐热属性的重组dnase i酶基因，开放阅读框序列长度为1119bp。酶耐热性分析结果表明，含有该重组基因的表达载体能够有效提高dnase i酶的热稳定性以及dnase酶在环境中的适应性，同时有助于提高酶活性，增强核酸污染的清除效率，有效解决pcr实验室核酸气溶胶污染去除所用酶的保存、运输和使用问题。
13.本发明的耐热核酸降解酶表达载体的构建方法，包括以下步骤：
14.1)获取dnase i酶基因的完整核苷酸序列，然后去掉1-66bp位点的核苷酸；
15.2)获取taq dna聚合酶中核苷酸区域为2127-2495bp的标签基因，然后采用标签基因串联步骤1)去掉1-66bp位点核苷酸后得到的dnase i酶基因序列，再进行密码子优化，优化后通过化学合成方法合成得到重组dnase i酶基因；
16.3)将重组dnase i酶基因序列构建到酿酒酵母载体上得到耐热核酸降解酶表达载体。
17.taq dna聚合酶是由水生嗜热菌(thermus aquatics)yt-1菌株中分离得到。本发明通过对taq dna聚合酶的三维结构分析以及应用实验验证，确认taq dna聚合酶核苷酸序列2127-2495bp位置369bp的核苷酸序列区域是与taq dna聚合酶耐热性有关、且能够与dnase i酶有效适配并促进dnase i酶耐热活性改善的标签基因。
18.进一步的，本发明研究发现，含有1-66bp位点处核苷酸的dnase i酶基因，并不利于实现重组dnase i酶蛋白表达量和酶活性的有效提升，因而本发明针对性地去掉了1-66bp位点处核苷酸序列，得到了处理后的dnase i酶基因，然后运用基因工程技术及酵母表达系统，通过共表达taq dna聚合酶标签基因串联dnase i酶基因，获得可以高效表达重组dnase i酶蛋白的酿酒酵母，从而获得了具有耐热属性以及高效的核酸内切酶活性的重组dnase i酶。
19.本发明通过实验验证证实，采用本发明的耐热核酸降解酶表达载体，得到的重组dnase i酶可以耐受60℃高温加入30分钟，酶活性不变，在75℃，10min条件下，酶活性仍然能保留80％，极大地满足了dnase i酶的热稳定性以及环境保存和运输要求。
20.其中，步骤1)中，获取dnase i酶基因的完整核苷酸序列，具体可以是，通过genbank(登陆号为m60606.1)查询，获取dnase i酶完整基因序列。
21.具体地，步骤2)中，所述标签基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
22.进一步地，所述密码子优化采用dnaworks工具。密码子优化需要结合酿酒酵母的密码子偏好性进行，通过密码子优化过程以提高翻译效率。
23.重组dnase i酶基因的化学合成方法采用现有技术中常见的化学合成方法即可。优选地，所述化学合成方法为固相亚磷酰胺三酯法。
24.优选地，步骤3)中，将重组dnase i酶基因序列构建到酿酒酵母载体上的过程是：将重组dnase i酶基因序列与酿酒酵母gal1启动子、adh1终止子构建到质粒上得到耐热核酸降解酶表达载体。
25.本发明的耐热核酸降解酶表达载体的应用，具体是表达载体在制备用于核酸气溶胶污染物去除的耐热核酸降解酶中的应用。
26.本发明采用耐热核酸降解酶表达载体能够表达得到具有优良热稳定性的重组dnase i酶，解决了酶解法核酸污染清除制剂的保存、运输问题，提高了dnase i酶在环境中
的适应性，延长了酶活性时间，提高了核酸污染的清除效率。后续应用时具体可以采用该酶处理高效空气过滤器(hepa)，用于清除环境中的核酸气溶胶污染物。
附图说明
27.图1为本发明实施例1和对比例1表达所得重组酶活性对比；
28.图2为本发明实施例1表达所得重组dnase i酶和野生dnase i酶的耐热性对比。
具体实施方式
29.以下结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，但不构成对本发明的任何限制。以下实施例中涉及的生物原料和操作技术如无特别说明，均为现有技术中的常规原料和技术。
30.实施例1
31.本实施例的耐热核酸降解酶表达载体，是在酿酒酵母载体上引入重组dnase i酶基因构建而成，所述重组dnase i酶基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
32.实施例2
33.本实施例的耐热核酸降解酶表达载体的构建方法，对实施例1耐热核酸降解酶表达载体的构建进行说明，包括以下步骤：
34.1)获取dnase i酶基因的完整核苷酸序列，然后去掉1-66bp位点的核苷酸(完整的牛胰腺dnase i酶基因序列如seq id no.3所示，genbank登陆号为m60606.1)；
35.2)获取taq dna聚合酶中核苷酸区域为2127-2495bp的标签基因(标签基因的核苷酸序列如seq id no.2所示)，然后采用标签基因串联步骤1)去掉1-66bp位点核苷酸后得到的dnase i酶基因序列，结合酿酒酵母的密码子偏好性，采用dnaworks工具进行密码子优化以提高翻译效率，优化后通过亚磷酰胺三酯法化学合成方法合成得到重组dnase i酶基因；亚磷酰胺三酯法化学合成方法参考以下现有技术进行：reese c b.oligo-and poly-nucleotides:50years of chemi-cal synthesis[j].organic&biomolecular chemistry,2005,3(21):3851-3868。
[0036]
3)将重组dnase i酶基因序列与酿酒酵母gal1启动子和adh1终止子构建到质粒上形成耐热核酸降解酶表达载体。
[0037]
实施例3
[0038]
本实施例的耐热核酸降解酶表达载体的的应用，具体是表达载体在制备用于核酸气溶胶污染物去除的耐热核酸降解酶中的应用。
[0039]
具体应用时：采用耐热核酸降解酶表达载体获得重组dnase i酶蛋白的方法是：通过pcr扩增出带有同源重组臂的重组dnase i酶基因表达载体作为修复模板，将重组dnase i酶基因表达载体通过同源重组的方式插入到酿酒酵母多拷贝的ty2逆转录转座子中，实现基因多拷贝表达。将修复模板和pcas-ty2质粒共转化酿酒酵母中，利用缺ura的平板进行克隆筛选。筛选出单克隆菌株，通过qpcr方法鉴定拷贝数，挑取高拷贝菌株接种于ypd液体培养基中，30℃过夜培养至od600nm达到3.0，即得到所需重组dnase i酶蛋白。
[0040]
重组蛋白的纯化过程具体是：取1l酿酒酵母培养物，6000rpm转速条件下离心10min，收集沉淀。沉淀用50l buffer w(iba)重悬，然后用高压匀浆机破碎酵母细胞，
17000rpm 4℃离心60分钟，取上清液用0.45μm滤膜过滤，然后用strep-tactin xt gravity-flow柱(iba)进行融合蛋白亲和纯化，即得高纯度重组dnase i酶蛋白。
[0041]
对比例1
[0042]
本对比例的耐热核酸降解酶表达载体，与实施例1所述表达载体以及实施例2所述表达载体的构建方法基本相同，区别仅在于：本对比例步骤1)中采用含有1-66bp位点处核苷酸序列的完整dnase i酶基因序列，后续步骤与实施例2相同。
[0043]
实验例1
[0044]
重组dnase i酶活性测定：
[0045]
本发明构建的耐热核酸降解酶表达载体(本发明)与对比例1的耐热核酸降解酶表达载体，二者均含有耐热标签蛋白，唯一区别在于是否含有dnase i酶基因序列前66bp的核苷酸序列。采用实施例3所述方法获得对应的纯化蛋白，通过bca方法测定蛋白浓度，然后稀释至相同浓度(10mg/l)，分别测定二者的酶活性，比较酶活性区别。
[0046]
采用标准方法测定酶活性单位。反应体系和操作步骤为：在25℃恒温条件下，取两支试管，均加入3ml底物dna溶液(4mg鲑鱼精蛋白dna加50ml超纯水溶解，再加入10ml 1.0mol/l、ph为5.0的乙酸溶液和10ml浓度为0.05m硫酸镁溶液混匀备用)，向其中一支加入1ml对比例1表达得到的dnase i酶蛋白溶液，另一支加入1ml与对比例1相同浓度的实施例1表达得到的重组dnase i酶蛋白溶液。使用紫外分光光度计，采用1cm光径的石英比色杯别测定260nm处的吸光度值(a值)，共读4min。其中，酶活指的是：在25℃，每分钟使260nm光吸收增加0.001的酶量为一个酶活单位(u)。结果如图1所示。
[0047]
由图1可知，本发明的耐热核酸降解酶表达载体表达得到的重组dnase i酶，相较于对比例1酶活性提高72％左右，可见本发明的表达载体构建方法能够显著提高dnase i的酶活性，获得具有高效的核酸内切酶活性的dnase i酶，增强核酸污染的清除效率。
[0048]
实验例2
[0049]
重组dnase i酶和野生dnase i酶耐热性分析：在最适ph条件下，将适当稀释过的相同浓度的实施例1所得重组dnase i酶以及野生型dnase i酶，在不同温度条件下保温10分钟，然后恢复至最适用温度(25℃)，测定残余酶活力。酶活力测定方法同实施例1，耐热性实验结果如图2所示。
[0050]
由图2可知，本发明所得重组dnase i酶比未重组的野生型dnase i酶，具有更高的温度耐受性。在75℃，10min条件下，酶活性仍能保留80％；而野生型dnase i酶，则在75℃条件下完全失活。由此有效说明本发明提供的耐热核酸降解酶表达载体，能够表达得到兼具优良的耐热属性以及高效的核酸内切酶活性的dnase i酶，有效提高dnase i酶的热稳定性以及在环境中的适应性。
[0051]
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。