一种热稳定性高的突变体cblac-mut8漆酶
技术领域：
：1.本技术属于酶工程
技术领域：
：，具体涉及一种热稳定性高的突变体cblac-mut8漆酶。
背景技术：
：：2.漆酶是一类广泛存在的酶，它能氧化多种酚类和非酚类芳香底物，同时还能还原为水，具有广泛的底物特异性和生态友好性（以空气中的分子氧为最终电子受体，仅以副产品的形式释放水），被认为是一种具有广阔应用前景的生物绿色工具。漆酶有单聚体、二聚体或四聚体糖基蛋白。主要来源是真菌漆酶和细菌漆酶，真菌漆酶一般为60-70kda，具有严重的糖基化修饰，最适反应温度一般为30℃-60℃，ph耐受范围在3.5-7.0之间。而细菌漆酶具有底物谱宽，不需要糖基化修饰，热稳定性好，ph耐受性范围宽、耐碱性强等显著优点而被广泛关注。3.漆酶作为一种绿色生物催化剂，在处理耐污染的环境污染物和染料废水方面具有诱人的优势，由于漆酶可以催化大量酚类和非酚类化合物的氧化，同时把分子中的氧分解成水，能够加速水中有机污染物的降解和无害化。4.本发明所涉及的cblac蛋白来源发现于德国一处热泉中的caldicellulosiruptorbescii，该菌是一种厌氧细菌，已报道其生长最适条件为最适生长温度70-80℃，最高可耐受90℃高温，该菌株能够降解结晶纤维素、木聚糖，以及未处理的植物生物质，包括杨树和柳枝稷等潜在的生物能源植物。发明人以隶属duf152家族的cblac漆酶为对象以期提供一种热稳定性高，并能有效处理有机染料的漆酶突变体。技术实现要素：5.本技术的技术目的是提供一种热稳定性高的突变体cblac-mut8漆酶，从而改善野生型cblac漆酶的热稳定性和可溶性表达。基于一个总的发明构思，本发明还包括编码该突变体漆酶的基因、该突变体的制备方法及其应用。6.一种热稳定性高的突变体cblac-mut8漆酶，其氨基酸序列如seqno.3所示。7.编码突变体cblac-mut8漆酶的基因序列，具体如seqno.4所示。8.含有上述基因序列的重组表达载体或重组菌。9.一种获得上述热稳定性高的突变体cblac-mut8漆酶的方法，具体包括以下步骤：1）蛋白序列预测：将cblac漆酶的氨基酸序列利用swiss-model进行结构模拟，将建模结果提交至pross软件进行突变位点预测，得到如seqno.3所示的突变体蛋白序列；2）重组载体构建：根据编码原则合成该蛋白的基因序列，将该基因序列与表达载体进行重组，获得重组载体；3）蛋白表达与纯化：重组载体在细菌受态细胞中过量表达后收集、破碎，40~60℃孵育10~60min，离心收集沉淀，用亲和层析柱纯化，即得突变体cblac-mut8漆酶。10.优选的，cblac漆酶的氨基酸序列如seqno.2所示。11.进一步优选的，编码cblac漆酶的基因序列如seqno.1所示。12.优选的，步骤2）中的表达载体为pet-28a质粒；步骤3）中的细菌受态细胞为大肠杆菌bl21(de3)。13.基于一个总的发明构思，本发明还包括上述突变体cblac-mut8漆酶在降解有机染料中的应用。14.本发明通过设计得到一种热稳定性强的突变体cblac-mut8漆酶；经酶学性质研究，该酶最适温度为60℃，最适ph=4.0。在50℃时，cblac-mut8酶活半衰期达到48h以上；在60℃时，cblac-mut8酶活半衰期也可达到26.6h。而且，与cblac漆酶（wt）相比，50℃时突变体cblac-mut8的催化活性（kcat/km）比wt提高了9.5倍，对于温度的耐受性更强，催化活性更高。15.用突变体cblac-mut8对有机染料进行脱色。结果显示，在60℃条件下利用cblac-mut8对100mg/l孔雀石绿溶液处理4h，孔雀石绿的降解率可达98%以上。利用突变体cblac-mut8脱色后的处理液进行生物培养，结果表明，脱色后处理液对细菌生长无影响，证明该突变体cblac-mut8对有机染料具有优异的脱毒作用，可以实现对有机染料的生物无害化处理。本发明的技术效果与现有技术相比，所得突变体cblac-mut8对孔雀石绿的降解能力强于大多数已报到漆酶，是一种具有很高工业应用前景的漆酶。附图说明16.图1纯化cblac漆酶（wt）及突变体cblac-mut8漆酶的sds-page电泳图；图2不同温度条件下的酶活测定；图3不同ph条件下的酶活测定；图4ph稳定性测定；图5热稳定性测定；图6不同温度条件下的cblac和cblac-mut8漆酶酶动力学曲线；图7cblac漆酶对孔雀石绿的脱色效果；图8cblac漆酶处理不同时间的孔雀石绿降解率对比；图9cblac漆酶处理液培养大肠埃希菌的生长曲线；图10cblac漆酶（wt）和cblac-mut8（突变体）氨基酸序列比对；图1160℃孵育30mincblac（wt）与突变体cblac-mut8酶活对比；图12突变体cblac-mut8漆酶对孔雀石绿的脱色效果；图13突变体cblac-mut8漆酶处理不同时间的孔雀石绿降解率对比；图14突变体cblac-mut8处理液培养枯草芽孢杆菌的生长曲线。具体实施方式17.以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。18.本发明所用大肠埃希菌（escherichiacoil）购自中国微生物保藏中心，保藏号cicc10305；所用枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）购自中国微生物保藏中心，保藏号cicc10275；pet28a质粒、dh5a大肠杆菌感受态细胞、bl21(de3)大肠杆菌感受态细胞为普通市售，现保存于河南农业大学实验室中；酵母粉、胰蛋白胨均购自法国oxoid；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠均购自天津大茂；孔雀石绿购自上海源叶生物有限公司。19.实施例1cblac漆酶的优化表达首先根据cblac漆酶的基因序列（参考ncbi基因序列数据库，基因序列登录号：cp001393.1）进行密码子优化，优化后的基因序列如seqno.1所示。优化前的基因序列属厌氧细菌表达体系，经密码子优化后，基因序列seqno.1适用好氧细菌表达体系。20.以上述基因序列（南京金瑞斯生物科技有限公司合成）为模板，利用pcr试剂盒进行基因扩增，所用引物对具体为：cblac-ndei-f:gtggtggtatcgaaggtaggcatatgggctttgttaaagaaaaccblac-xhoi-r:acaagcttgaattcggatccctcgagctaacgacgaaccatacgcagpcr条件为：98℃，5min；98℃，20s；56℃，30s；72℃，2min30s；72℃，10min；4℃，99min；进行22个循环；扩增完成后，将克隆序列通过限制内切酶链接到pet-28a质粒的ncoi与xhoi间，制备重组质粒pet28a-cblac，并将重组质粒在大肠杆菌bl21(de3)中过量表达；感受态细胞经5000rpm，5min离心收集，于pbs(ph=7.4)高压1000bar破碎后经50℃孵育30min，18000g，30min离心收集，然后利用ni离子亲和柱纯化，得到cblac漆酶。纯化cblac蛋白的sds-page电泳图如图1所示（wt）；从图中可以看出，在30kda位置出现电泳条带，说明获得了纯化的cblac蛋白。经蛋白测序，cblac漆酶的氨基酸序列如seqno.2所示。21.实施例2cblac酶活及酶活性质测定以2,2′‑azino-bis(3-ethylbenzthiazoline)-6-sulfonate(abts,ε420=38,000m-1cm-1)为底物，在20mm醋酸-醋酸钠反应缓冲液体系中进行cblac酶性质及酶活测定；测定结果见图2~图5。结果显示cblac漆酶在60℃的酶活最高，最适ph值为ph4.0；酶活在50℃的半衰期预测10h左右。22.测定50℃条件下cblac的酶促动力学：在1mmcuso4溶液中加入cblac漆酶10u/l，反应体系200μl，反应时间20min；通过测定420nm波长处的吸光值来确定反应速率，所得酶促动力学曲线见图6；可以看出，cblac漆酶的km=2.31，kcat=5.2min-1，kcat/km=2.25。23.以2,2′‑azino-bis(3-ethylbenzthiazoline)-6-sulfonate(abts,ε420=38,000m-1cm-1)为底物，在20mm醋酸-醋酸钠反应缓冲液体系中添加不同的金属离子，添加浓度10mm；不同金属离子存在时，cblac漆酶酶活对比见表1；表1不同金属离子对酶活的影响从上表可以看出，mn离子和zn离子对实施例1所得cblac漆酶活性有一定促进作用，且cblac漆酶对cl离子的耐受性较高，当cl离子浓度达到1000mm时仍能保持28%的酶活性。24.实施例3cblac漆酶对孔雀石绿降解效果的考察配制孔雀石绿母液500mg/l；将母液加入20mm醋酸-醋酸钠缓冲体系，使缓冲体系中孔雀石绿浓度为50mg/l；调节ph值4.0，加入cblac漆酶40u/l，于50℃处理24h，考察cblac漆酶对孔雀石绿染料的降解效果。cblac漆酶对孔雀石绿的脱色效果见图7，从图中可以看出，经cblac漆酶在ph4.0，50℃处理后，处理液在618nm处最大吸收峰明显下降，表明孔雀石绿被降解。不同处理时间缓冲液中孔雀石绿的降解率对比结果如图8所示，可以看出孔雀石绿在12h已基本被降解完全。25.将上述利用cblac漆酶降解孔雀石绿后的处理液用以培养细菌。按照体积比1:1将处理液加入液体lb培养基中，接入大肠埃希菌，测定一定时间内菌体生长曲线（图9）；上述试验以仅用lb培养基培养为对照组（control），每个条件设置三个平行。从图9可以看出用稀释的处理液培养大肠埃希菌，菌体生长曲线与对照组相似。而加入50mg/l孔雀石绿的样品组，菌体生长受到严重抑制；上述结果证明，经cblac漆酶处理孔雀石绿后，并不产生抑制细菌生长的物质，因而能够实现对孔雀石绿的生物无害化处理。26.实施例4cblac的酶学改造及突变体cblac-mut8的制备实施例1~3结果表明，利用cblac漆酶能够实现对孔雀石绿的生物无害化处理，且cblac漆酶的使用量小，处理效果高。27.但是根据对cblac漆酶的研究发现，cblac漆酶的表达大部分为包涵体，酶活性较低，热稳定性较差，为了提高cblac漆酶热稳定性和可溶性表达，利用swiss-model结构模拟（pdb）结构提交至pross软件对cblac漆酶氨基酸序列进行突变位点预测，得到突变体cblac-mut8漆酶序列，具体氨基酸序列如seqno.3所示。预测的突变体cblac-mut8氨基酸序列与cblac漆酶（wt）比对如图10，图中—代表a螺旋，→代表β折叠片，可以看出，突变体与野生型相比其突变位点共17个。28.根据突变体氨基酸序列得到cblac-mut8漆酶的基因序列，具体如seqno.4所示。以该基因序列（南京金瑞斯生物科技有限公司合成）为模板，并通过限制内切酶链接到pet-28a质粒的ncoi与xhoi间，得到重组质粒pet28a-cblac-mut8；在实验室将重组质粒导入大肠杆菌dh5a中，37℃，12h后提质粒测序（北京擎科生物科技有限公司）；将质粒在大肠杆菌bl21(de3)中过量表达，细胞经5000rpm，5min离心收集，在pbs(ph=7.4)高压1000bar条件下破碎后经50℃孵育30min，18000g，30min离心，用co 亲和柱纯化，得到cblac-mut8纯酶。所得纯化突变体cblac-mut8的sds-page电泳图见图1。29.实施例5突变体cblac-mut8与cblac（wt）酶活测定与对比以2,2′‑azino-bis(3-ethylbenzthiazoline)-6-sulfonate(abts,ε420=38,000m-1cm-1)为底物，在20mm醋酸-醋酸钠反应缓冲液体系中进行突变体cblac-mut8的酶活及酶性质测定。60℃孵育30min后，cblac（wt）与突变体cblac-mut8两种粗酶活性对比见图11。可以看出60℃孵育30min，wt酶活显著降低，而突变体cblac-mut8活性基本无损失。30.两种酶的最适温度、ph值和稳定性测定见图2~图6。从图2可以看出，两种酶均在60℃时酶活最高，但是其他温度条件下，突变体cblac-mut8的酶活更高。从图3可以看出，两种酶的最适ph值均为4.0。从图4和图5可以看出，与野生型wt相比，突变体cblac-mut8的ph稳定性更高，且对于温度的耐受力更强。31.分别测定50℃和60℃条件下突变体cblac-mut8酶动力学：用终浓度酶10u/l，在1mmcuso4、不同浓度abts条件下反应20min，测定酶促反应速率，用graphpadprism8拟合酶动力学曲线。上述酶促动力学曲线与50℃时cblac漆酶（wt）动力学曲线为对照（图6）。可以看出，50℃时cblac漆酶的km=2.31，kcat=5.2min-1；同为50oc时，突变体cblac-mut8的km=1.46mm，kcat=31.2min-1。当60oc时cblac-mut8的km=1.56mm，kcat=204.1min-1。经计算可得50℃条件下突变体cblac-mut8的催化活性（kcat/km）较wt提高了9.46倍。32.实施例6突变体cblac-mut8对孔雀石绿的降解效果配制孔雀石绿母液500mg/l；将母液加入20mm醋酸-醋酸钠缓冲体系，使缓冲体系中孔雀石绿浓度为分别为50mg/l和100mg/l；调节ph值4.0；加入cblac-mut8漆酶，添加量为40u/l，于60℃处理4h，考察cblac-mut8对孔雀石绿染料的降解效果；cblac-mut8对孔雀石绿的脱色效果见图12。33.从图中可以看出，经cblac-mut8在ph4.0、60℃处理后，618nm处最大吸收峰明显下降，证明孔雀石绿被降解。不同处理时间的缓冲液中孔雀石绿的降解率对比见图13。可以看出，当孔雀石绿浓度为100mg/l时，cblac-mut8处理4h即可对孔雀石绿的降解率达98%以上。34.实施例7突变体cblac-mut8降解孔雀石绿的处理液对微生物生长的影响利用突变体cblac-mut8降解孔雀石绿后的处理液进行生物培养，考察处理液的无害化效果。35.按照1:1将处理液加入液体lb培养基中，分别接种枯草芽孢杆菌，测定一定时间内菌体生长曲线（图14）；以不添加处理液的培养为空白组，以添加100mg/l孔雀石绿的培养为对照组；可以看出，添加cblac-mut8的处理液培养枯草芽孢杆菌，菌体生长曲线与空白组相似；而加入100mg/l孔雀石绿的对照组菌体生长受到严重抑制。说明经cblac-mut8降解孔雀石绿后，并不产生抑制细菌生长的物质，证明该突变体对有机染料具有优异的脱毒作用，能够实现对孔雀石绿的生物无害化处理。36.结论与分析为了进一步揭示本发明所得突变体cblac-mut8对孔雀石绿的降解效果，将本技术的脱色效果与现有已知漆酶的脱色效果进行比对。已知漆酶的数据参照下列文献，具体对比结果见表2；表2突变体cblac-mut8与现有已知漆酶对孔雀石绿染料降解效果对比从上表可以看出，所得突变体cblac-mut8对孔雀石绿的降解能力强于大多数已报到漆酶。而且，该酶的最适温度为60℃，对热稳定性高：与cblac漆酶（wt）相比，60℃时酶活半衰期提高至26.6h，是一种具有很高工业应用前景的漆酶。37.参考文献：1.characterizationofahighlythermostableandorganicsolvent-tolerantcopper-containingpolyphenoloxidasewithdye-decolorizingabilityfromkurthiahuakuiilam0618t2.functionalexpressionenhancementofbacilluspumiluscota-laccasemutantwlfthroughsite-directedmutagenesis,enzymeandmicrobialtechnology109(2018)11-19.3.high-levelexpressionofabacteriallaccase,cueofromescherichiacolik12inpichiapastorisgs115anditsapplicationonthedecolorizationofsyntheticdyes,enzymeandmicrobialtechnology103(2017)34-414.cloningandfunctionalanalysisofanewlaccasegenefromtrametessp.48424whichhadthehighyieldoflaccaseandstrongabilityfordecolorizingdifferentdyes,bioresourtechnol102(3)(2011)3126-37.5.malachitegreendecolourizationanddetoxificationbythelaccasefromanewlyisolatedstrainoftrametessp,63(5)(2009)600-606.6.biodegradation,enhancedbiodegradationanddetoxificationofmalachitegreenbytrichodermaasperellumlaccase:degradationpathwayandproductanalysis.(2017)258-268.当前第1页12当前第1页12
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：1.本技术属于酶工程
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：，具体涉及一种热稳定性高的突变体cblac-mut8漆酶。
背景技术：
：：2.漆酶是一类广泛存在的酶，它能氧化多种酚类和非酚类芳香底物，同时还能还原为水，具有广泛的底物特异性和生态友好性（以空气中的分子氧为最终电子受体，仅以副产品的形式释放水），被认为是一种具有广阔应用前景的生物绿色工具。漆酶有单聚体、二聚体或四聚体糖基蛋白。主要来源是真菌漆酶和细菌漆酶，真菌漆酶一般为60-70kda，具有严重的糖基化修饰，最适反应温度一般为30℃-60℃，ph耐受范围在3.5-7.0之间。而细菌漆酶具有底物谱宽，不需要糖基化修饰，热稳定性好，ph耐受性范围宽、耐碱性强等显著优点而被广泛关注。3.漆酶作为一种绿色生物催化剂，在处理耐污染的环境污染物和染料废水方面具有诱人的优势，由于漆酶可以催化大量酚类和非酚类化合物的氧化，同时把分子中的氧分解成水，能够加速水中有机污染物的降解和无害化。4.本发明所涉及的cblac蛋白来源发现于德国一处热泉中的caldicellulosiruptorbescii，该菌是一种厌氧细菌，已报道其生长最适条件为最适生长温度70-80℃，最高可耐受90℃高温，该菌株能够降解结晶纤维素、木聚糖，以及未处理的植物生物质，包括杨树和柳枝稷等潜在的生物能源植物。发明人以隶属duf152家族的cblac漆酶为对象以期提供一种热稳定性高，并能有效处理有机染料的漆酶突变体。技术实现要素：5.本技术的技术目的是提供一种热稳定性高的突变体cblac-mut8漆酶，从而改善野生型cblac漆酶的热稳定性和可溶性表达。基于一个总的发明构思，本发明还包括编码该突变体漆酶的基因、该突变体的制备方法及其应用。6.一种热稳定性高的突变体cblac-mut8漆酶，其氨基酸序列如seqno.3所示。7.编码突变体cblac-mut8漆酶的基因序列，具体如seqno.4所示。8.含有上述基因序列的重组表达载体或重组菌。9.一种获得上述热稳定性高的突变体cblac-mut8漆酶的方法，具体包括以下步骤：1）蛋白序列预测：将cblac漆酶的氨基酸序列利用swiss-model进行结构模拟，将建模结果提交至pross软件进行突变位点预测，得到如seqno.3所示的突变体蛋白序列；2）重组载体构建：根据编码原则合成该蛋白的基因序列，将该基因序列与表达载体进行重组，获得重组载体；3）蛋白表达与纯化：重组载体在细菌受态细胞中过量表达后收集、破碎，40~60℃孵育10~60min，离心收集沉淀，用亲和层析柱纯化，即得突变体cblac-mut8漆酶。10.优选的，cblac漆酶的氨基酸序列如seqno.2所示。11.进一步优选的，编码cblac漆酶的基因序列如seqno.1所示。12.优选的，步骤2）中的表达载体为pet-28a质粒；步骤3）中的细菌受态细胞为大肠杆菌bl21(de3)。13.基于一个总的发明构思，本发明还包括上述突变体cblac-mut8漆酶在降解有机染料中的应用。14.本发明通过设计得到一种热稳定性强的突变体cblac-mut8漆酶；经酶学性质研究，该酶最适温度为60℃，最适ph=4.0。在50℃时，cblac-mut8酶活半衰期达到48h以上；在60℃时，cblac-mut8酶活半衰期也可达到26.6h。而且，与cblac漆酶（wt）相比，50℃时突变体cblac-mut8的催化活性（kcat/km）比wt提高了9.5倍，对于温度的耐受性更强，催化活性更高。15.用突变体cblac-mut8对有机染料进行脱色。结果显示，在60℃条件下利用cblac-mut8对100mg/l孔雀石绿溶液处理4h，孔雀石绿的降解率可达98%以上。利用突变体cblac-mut8脱色后的处理液进行生物培养，结果表明，脱色后处理液对细菌生长无影响，证明该突变体cblac-mut8对有机染料具有优异的脱毒作用，可以实现对有机染料的生物无害化处理。本发明的技术效果与现有技术相比，所得突变体cblac-mut8对孔雀石绿的降解能力强于大多数已报到漆酶，是一种具有很高工业应用前景的漆酶。附图说明16.图1纯化cblac漆酶（wt）及突变体cblac-mut8漆酶的sds-page电泳图；图2不同温度条件下的酶活测定；图3不同ph条件下的酶活测定；图4ph稳定性测定；图5热稳定性测定；图6不同温度条件下的cblac和cblac-mut8漆酶酶动力学曲线；图7cblac漆酶对孔雀石绿的脱色效果；图8cblac漆酶处理不同时间的孔雀石绿降解率对比；图9cblac漆酶处理液培养大肠埃希菌的生长曲线；图10cblac漆酶（wt）和cblac-mut8（突变体）氨基酸序列比对；图1160℃孵育30mincblac（wt）与突变体cblac-mut8酶活对比；图12突变体cblac-mut8漆酶对孔雀石绿的脱色效果；图13突变体cblac-mut8漆酶处理不同时间的孔雀石绿降解率对比；图14突变体cblac-mut8处理液培养枯草芽孢杆菌的生长曲线。具体实施方式17.以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。18.本发明所用大肠埃希菌（escherichiacoil）购自中国微生物保藏中心，保藏号cicc10305；所用枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）购自中国微生物保藏中心，保藏号cicc10275；pet28a质粒、dh5a大肠杆菌感受态细胞、bl21(de3)大肠杆菌感受态细胞为普通市售，现保存于河南农业大学实验室中；酵母粉、胰蛋白胨均购自法国oxoid；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠均购自天津大茂；孔雀石绿购自上海源叶生物有限公司。19.实施例1cblac漆酶的优化表达首先根据cblac漆酶的基因序列（参考ncbi基因序列数据库，基因序列登录号：cp001393.1）进行密码子优化，优化后的基因序列如seqno.1所示。优化前的基因序列属厌氧细菌表达体系，经密码子优化后，基因序列seqno.1适用好氧细菌表达体系。20.以上述基因序列（南京金瑞斯生物科技有限公司合成）为模板，利用pcr试剂盒进行基因扩增，所用引物对具体为：cblac-ndei-f:gtggtggtatcgaaggtaggcatatgggctttgttaaagaaaaccblac-xhoi-r:acaagcttgaattcggatccctcgagctaacgacgaaccatacgcagpcr条件为：98℃，5min；98℃，20s；56℃，30s；72℃，2min30s；72℃，10min；4℃，99min；进行22个循环；扩增完成后，将克隆序列通过限制内切酶链接到pet-28a质粒的ncoi与xhoi间，制备重组质粒pet28a-cblac，并将重组质粒在大肠杆菌bl21(de3)中过量表达；感受态细胞经5000rpm，5min离心收集，于pbs(ph=7.4)高压1000bar破碎后经50℃孵育30min，18000g，30min离心收集，然后利用ni离子亲和柱纯化，得到cblac漆酶。纯化cblac蛋白的sds-page电泳图如图1所示（wt）；从图中可以看出，在30kda位置出现电泳条带，说明获得了纯化的cblac蛋白。经蛋白测序，cblac漆酶的氨基酸序列如seqno.2所示。21.实施例2cblac酶活及酶活性质测定以2,2′‑azino-bis(3-ethylbenzthiazoline)-6-sulfonate(abts,ε420=38,000m-1cm-1)为底物，在20mm醋酸-醋酸钠反应缓冲液体系中进行cblac酶性质及酶活测定；测定结果见图2~图5。结果显示cblac漆酶在60℃的酶活最高，最适ph值为ph4.0；酶活在50℃的半衰期预测10h左右。22.测定50℃条件下cblac的酶促动力学：在1mmcuso4溶液中加入cblac漆酶10u/l，反应体系200μl，反应时间20min；通过测定420nm波长处的吸光值来确定反应速率，所得酶促动力学曲线见图6；可以看出，cblac漆酶的km=2.31，kcat=5.2min-1，kcat/km=2.25。23.以2,2′‑azino-bis(3-ethylbenzthiazoline)-6-sulfonate(abts,ε420=38,000m-1cm-1)为底物，在20mm醋酸-醋酸钠反应缓冲液体系中添加不同的金属离子，添加浓度10mm；不同金属离子存在时，cblac漆酶酶活对比见表1；表1不同金属离子对酶活的影响从上表可以看出，mn离子和zn离子对实施例1所得cblac漆酶活性有一定促进作用，且cblac漆酶对cl离子的耐受性较高，当cl离子浓度达到1000mm时仍能保持28%的酶活性。24.实施例3cblac漆酶对孔雀石绿降解效果的考察配制孔雀石绿母液500mg/l；将母液加入20mm醋酸-醋酸钠缓冲体系，使缓冲体系中孔雀石绿浓度为50mg/l；调节ph值4.0，加入cblac漆酶40u/l，于50℃处理24h，考察cblac漆酶对孔雀石绿染料的降解效果。cblac漆酶对孔雀石绿的脱色效果见图7，从图中可以看出，经cblac漆酶在ph4.0，50℃处理后，处理液在618nm处最大吸收峰明显下降，表明孔雀石绿被降解。不同处理时间缓冲液中孔雀石绿的降解率对比结果如图8所示，可以看出孔雀石绿在12h已基本被降解完全。25.将上述利用cblac漆酶降解孔雀石绿后的处理液用以培养细菌。按照体积比1:1将处理液加入液体lb培养基中，接入大肠埃希菌，测定一定时间内菌体生长曲线（图9）；上述试验以仅用lb培养基培养为对照组（control），每个条件设置三个平行。从图9可以看出用稀释的处理液培养大肠埃希菌，菌体生长曲线与对照组相似。而加入50mg/l孔雀石绿的样品组，菌体生长受到严重抑制；上述结果证明，经cblac漆酶处理孔雀石绿后，并不产生抑制细菌生长的物质，因而能够实现对孔雀石绿的生物无害化处理。26.实施例4cblac的酶学改造及突变体cblac-mut8的制备实施例1~3结果表明，利用cblac漆酶能够实现对孔雀石绿的生物无害化处理，且cblac漆酶的使用量小，处理效果高。27.但是根据对cblac漆酶的研究发现，cblac漆酶的表达大部分为包涵体，酶活性较低，热稳定性较差，为了提高cblac漆酶热稳定性和可溶性表达，利用swiss-model结构模拟（pdb）结构提交至pross软件对cblac漆酶氨基酸序列进行突变位点预测，得到突变体cblac-mut8漆酶序列，具体氨基酸序列如seqno.3所示。预测的突变体cblac-mut8氨基酸序列与cblac漆酶（wt）比对如图10，图中—代表a螺旋，→代表β折叠片，可以看出，突变体与野生型相比其突变位点共17个。28.根据突变体氨基酸序列得到cblac-mut8漆酶的基因序列，具体如seqno.4所示。以该基因序列（南京金瑞斯生物科技有限公司合成）为模板，并通过限制内切酶链接到pet-28a质粒的ncoi与xhoi间，得到重组质粒pet28a-cblac-mut8；在实验室将重组质粒导入大肠杆菌dh5a中，37℃，12h后提质粒测序（北京擎科生物科技有限公司）；将质粒在大肠杆菌bl21(de3)中过量表达，细胞经5000rpm，5min离心收集，在pbs(ph=7.4)高压1000bar条件下破碎后经50℃孵育30min，18000g，30min离心，用co 亲和柱纯化，得到cblac-mut8纯酶。所得纯化突变体cblac-mut8的sds-page电泳图见图1。29.实施例5突变体cblac-mut8与cblac（wt）酶活测定与对比以2,2′‑azino-bis(3-ethylbenzthiazoline)-6-sulfonate(abts,ε420=38,000m-1cm-1)为底物，在20mm醋酸-醋酸钠反应缓冲液体系中进行突变体cblac-mut8的酶活及酶性质测定。60℃孵育30min后，cblac（wt）与突变体cblac-mut8两种粗酶活性对比见图11。可以看出60℃孵育30min，wt酶活显著降低，而突变体cblac-mut8活性基本无损失。30.两种酶的最适温度、ph值和稳定性测定见图2~图6。从图2可以看出，两种酶均在60℃时酶活最高，但是其他温度条件下，突变体cblac-mut8的酶活更高。从图3可以看出，两种酶的最适ph值均为4.0。从图4和图5可以看出，与野生型wt相比，突变体cblac-mut8的ph稳定性更高，且对于温度的耐受力更强。31.分别测定50℃和60℃条件下突变体cblac-mut8酶动力学：用终浓度酶10u/l，在1mmcuso4、不同浓度abts条件下反应20min，测定酶促反应速率，用graphpadprism8拟合酶动力学曲线。上述酶促动力学曲线与50℃时cblac漆酶（wt）动力学曲线为对照（图6）。可以看出，50℃时cblac漆酶的km=2.31，kcat=5.2min-1；同为50oc时，突变体cblac-mut8的km=1.46mm，kcat=31.2min-1。当60oc时cblac-mut8的km=1.56mm，kcat=204.1min-1。经计算可得50℃条件下突变体cblac-mut8的催化活性（kcat/km）较wt提高了9.46倍。32.实施例6突变体cblac-mut8对孔雀石绿的降解效果配制孔雀石绿母液500mg/l；将母液加入20mm醋酸-醋酸钠缓冲体系，使缓冲体系中孔雀石绿浓度为分别为50mg/l和100mg/l；调节ph值4.0；加入cblac-mut8漆酶，添加量为40u/l，于60℃处理4h，考察cblac-mut8对孔雀石绿染料的降解效果；cblac-mut8对孔雀石绿的脱色效果见图12。33.从图中可以看出，经cblac-mut8在ph4.0、60℃处理后，618nm处最大吸收峰明显下降，证明孔雀石绿被降解。不同处理时间的缓冲液中孔雀石绿的降解率对比见图13。可以看出，当孔雀石绿浓度为100mg/l时，cblac-mut8处理4h即可对孔雀石绿的降解率达98%以上。34.实施例7突变体cblac-mut8降解孔雀石绿的处理液对微生物生长的影响利用突变体cblac-mut8降解孔雀石绿后的处理液进行生物培养，考察处理液的无害化效果。35.按照1:1将处理液加入液体lb培养基中，分别接种枯草芽孢杆菌，测定一定时间内菌体生长曲线（图14）；以不添加处理液的培养为空白组，以添加100mg/l孔雀石绿的培养为对照组；可以看出，添加cblac-mut8的处理液培养枯草芽孢杆菌，菌体生长曲线与空白组相似；而加入100mg/l孔雀石绿的对照组菌体生长受到严重抑制。说明经cblac-mut8降解孔雀石绿后，并不产生抑制细菌生长的物质，证明该突变体对有机染料具有优异的脱毒作用，能够实现对孔雀石绿的生物无害化处理。36.结论与分析为了进一步揭示本发明所得突变体cblac-mut8对孔雀石绿的降解效果，将本技术的脱色效果与现有已知漆酶的脱色效果进行比对。已知漆酶的数据参照下列文献，具体对比结果见表2；表2突变体cblac-mut8与现有已知漆酶对孔雀石绿染料降解效果对比从上表可以看出，所得突变体cblac-mut8对孔雀石绿的降解能力强于大多数已报到漆酶。而且，该酶的最适温度为60℃，对热稳定性高：与cblac漆酶（wt）相比，60℃时酶活半衰期提高至26.6h，是一种具有很高工业应用前景的漆酶。37.参考文献：1.characterizationofahighlythermostableandorganicsolvent-tolerantcopper-containingpolyphenoloxidasewithdye-decolorizingabilityfromkurthiahuakuiilam0618t2.functionalexpressionenhancementofbacilluspumiluscota-laccasemutantwlfthroughsite-directedmutagenesis,enzymeandmicrobialtechnology109(2018)11-19.3.high-levelexpressionofabacteriallaccase,cueofromescherichiacolik12inpichiapastorisgs115anditsapplicationonthedecolorizationofsyntheticdyes,enzymeandmicrobialtechnology103(2017)34-414.cloningandfunctionalanalysisofanewlaccasegenefromtrametessp.48424whichhadthehighyieldoflaccaseandstrongabilityfordecolorizingdifferentdyes,bioresourtechnol102(3)(2011)3126-37.5.malachitegreendecolourizationanddetoxificationbythelaccasefromanewlyisolatedstrainoftrametessp,63(5)(2009)600-606.6.biodegradation,enhancedbiodegradationanddetoxificationofmalachitegreenbytrichodermaasperellumlaccase:degradationpathwayandproductanalysis.(2017)258-268.当前第1页12当前第1页12
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