一种循环肿瘤DNA中HER2基因异常扩增的检测方法及其应用

一种循环肿瘤dna中her2基因异常扩增的检测方法及其应用
技术领域
1.本发明属于临床医学诊断技术领域，具体涉及肿瘤的监测和预后判断，尤其涉及一种循环肿瘤dna中her2基因异常扩增的检测方法及其应用。


背景技术：

2.胃癌(gastric cancer，gc)是消化道恶性肿瘤之一，许多胃癌患者在发现时己处于进展期，5年生存率《10％。目前临床上常用的胃肠肿瘤蛋白标志物如癌坯抗原(cea)、糖类抗原ca-19-9在gc患者中的阳性率《20％，灵敏度和特异度较低，难以满足“精准医疗”的要求，因此，开展胃癌诊断、监测、评价手术疗效及疾病预后的新型生物标志物检测技术及其应用研究具有重要意义。
3.研究表明，在肿瘤进展阶段可释放肿瘤细胞和dna至外周血，形成循环肿瘤dna(ctdna)，其携带有肿瘤特异性遗传学改变的自由基因组片段，与肿瘤发生发展、抵抗性耐药及复发转移等具有相关性，对于肿瘤的诊断、治疗及预后评估具有重要价值，检测肿瘤患者血液中ctdna可以提供快速、高效、相对无创性的“液体活检”。
4.近年来，与胃癌分子靶向治疗及预后评估有关的人表皮生长因子受体-2(her2)过表达的作用越来越受到关注，主要参与肿瘤生长、转移、浸润相关基因的调控，目前研究发现her2在乳腺癌、结肠癌、肺癌、胃癌等多种恶性肿瘤中存在不同程度的基因扩增和/或蛋白过表达，其中，her2胃癌患者中约20％her2表达阳性。
5.在临床治疗中，针对her2阳性的乳腺癌靶向治疗己达成共识，her2过表达与淋巴转移、浸润相关，但her2表达而且与胃癌的临床病理特征之间关系亦无统一的结论，主要原因可能与样本量、免疫组化所用抗体、评分标准、肿瘤异质性等有关。
6.目前，临床应用的her2分型方法主要有基于抗原抗体反应的免疫组化法(ihc，immunohistochemistry)和基于核酸杂交的荧光原位杂交(fish，fluorescence in situ hybridization)。但这两种方法均存在取样量少、结果判断存在主观误差以及检测结果的判断标准不一致等问题。
7.因此，利用数字pcr技术发展一种新的胃癌her2分型和疗效评价方法，对胃癌进行精准分子分型、对靶向药物治疗的动态监测和评估至关重要，是临床肿瘤治疗的发展方向。


技术实现要素：

8.针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种循环肿瘤dna中her2基因异常扩增的检测方法及其应用。所述检测方法能够监测体内循环肿瘤dna中her2基因的扩增情况，通过其扩增情况判断受试对象的健康状态，进而选择合适的治疗方案，达到“精准治疗”的目的。
9.为达此目的，本发明采用以下技术方案：
10.第一方面，本发明提供一种用于扩增人外周血循环肿瘤dna(ctdna)中her2基因的试剂盒，所述试剂盒包括：扩增her2基因的特异性引物对和探针、扩增参比基因的特异性引
物对和探针和标准品。
11.优选地，所述内参基因包括cep17基因。
12.本发明中所述试剂盒用于扩增人外周血循环肿瘤dna中her2基因和参比基因，对循环肿瘤dna中的her2基因进行精准定量，进而确定her2基因和参比基因的拷贝数比值。
13.第二方面，本发明提供一种循环肿瘤dna中her2基因异常扩增的检测方法，所述检测方法包括：
14.(1)合成her2基因和参比基因的特异性扩增引物和检测探针，并分别构建含有所述her2基因和参比基因的质粒作为标准品；
15.(2)采用数字pcr的方法对所述标准品进行定量检测，得到检测循环肿瘤dna中her2基因的反应条件；
16.(3)依据步骤(2)所得的反应条件，检测正常对照样品和胃癌样品中her2基因和参比基因的含量，得到定量检测结果，并将所述her2基因和参比基因的拷贝数比值作为异常扩增的初定判读阈值；
17.(4)比较步骤(3)所得的定量检测结果与临床病理分型结果，并进行敏感性评价和特异性评价，得到异常扩增的最佳判读阈值；
18.(5)检测待测样品循环肿瘤dna中her2基因和参比基因的含量，并根据步骤(4)所述的最佳判读阈值判断所述待测样品循环肿瘤dna中her2基因的扩增情况。
19.本发明中，所述检测方法在检测循环肿瘤dna中her2基因的扩增情况中具有重要的应用价值，所得her2基因的扩增情况能够反映待测对象(包括人和动物)中循环肿瘤dna的情况，进而对待测对象的生理状况进行判断；因此，所述检测方法不仅可以判断胃癌患者的预后情况，在胃癌药物的研发阶段(该检测方法可以检测动物的her2基因的扩增情况)也具有重要的使用价值。
20.作为本发明优选的技术方案，步骤(3)中所述胃癌样品为经免疫组化、fish确诊her2表达情况的胃癌组织的外周血循环肿瘤dna。
21.优选地，步骤(4)中所述临床病理分型结果包括ihc分型结果和/或fish分型结果。
22.优选地，步骤(5)所述待测样品循环肿瘤dna的提取方法包括：
23.取外周静脉血并加入抗凝剂，采用qiaamp通过裂解、结合、洗涤和洗脱，获得纯化和浓缩游离的循环肿瘤dna。
24.优选地，步骤(5)中所述判断的标准为：
25.所述her2基因和参比基因的拷贝数比值小于等于最佳判读阈值，则所述her2基因未出现异常扩增；
26.所述her2基因和参比基因的拷贝数比值大于最佳判读阈值，则所述her2基因出现异常扩增。
27.本发明中，以正常对照和胃癌患者her2基因和参比基因的拷贝数比值为初步的检测标准，并分别在健康人血中定量添加nci-n87或mkn-45等癌细胞，排除不同细胞的特异性因素，提高检测方法的准确度和灵敏度，得到最终的最佳判读阈值；将检测结果与最佳判读阈值相比较，进而判断受试样品中her2基因的扩增情况。
28.同时，本发明中，为了进一步验证所述检测方法的准确性，将所得检测结果与ihc联合fish检测相比较，所得结果的一致性检验用kappa值表示，得到kappa＞0.75，说明两法
检验一致性好。
29.第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的试剂盒或如第二方面所述的检测方法在制备用于诊断、治疗或预后检测胃癌的药物或装置中的应用。
30.第四方面，本发明还提供一种检测循环肿瘤dna中her2基因异常扩增的装置，其特征在于，所述装置包括：扩增单元、检测单元和分析单元；
31.其中，所述扩增单元包括如第一方面所述的试剂盒。
32.优选地，所述检测单元使用数字pcr方法对her2基因的拷贝数进行定量检测。
33.优选地，所述分析单元用于分析所述her2基因与参比基因的拷贝数比值，并将所述拷贝数比值与最佳判读阈值比较，得到待测样品循环肿瘤dna中her2基因的扩增情况。
34.本发明所提供的检测方法以及构建该检测方法的技术路线，为胃癌的诊断、治疗以及预后等提供了更为精准的分型方法。
35.本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
36.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
37.(1)本发明中，利用数字pcr技术开发出一种ctdna her2基因拷贝数变异的定量检测方法，并将其应用于胃癌的精准诊治和胃癌药物的研发中，能够指导胃癌her2阳性患者的靶向药物个体化治疗，并为肿瘤复发监测、预后判断等提供更为精准、无创的分子分型新方法，对于肿瘤精准医学临床应用而言具有重要的意义；
38.(2)本发明结合分子生物学、肿瘤学、检验医学等相关理论和技术，采用分子生物学的最新技术，利用双荧光digital pcr技术同时定量her2基因和参比基因，解决荧光定量pcr定量cnv时定量不准的问题，构建her2基因异常扩增检测新方法，有利于形成一套完整的基于digital pcr整套实验方案和标准；
39.(3)本发明利用数字pcr技术，确立胃癌患者外周血ctdna的her2基因异常扩增阈值，分析胃癌患者术前术后ctdna的her2基因异常扩增变化与肿瘤者复发时长、治疗反应性的关系，以期为指导胃癌患者靶向用药、肿瘤复发早期诊断以及预后判断等提供更为简便、无损伤和便于动态监测的新方法。
附图说明
40.图1为本发明中所述检测方法的构建路径分析图。
具体实施方式
41.下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
42.以下实施例中，若无特殊说明，所以的试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用的实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
43.本发明所述的检测方法依据图1所示的技术路线构建得到，具体包括步骤如下：
44.s1、依据digital pcr建立定量检测her2的体系
45.基于digital pcr技术的ctdna her2基因异常扩增定量检测体系建立，首先通过pubmed查询her2和cep17参比基因的序列信息，设计引物，从人基因组中调取相关序列，构建质粒，制成标准品；
46.再用primer3软件针对这her2基因和cep17参比基因设计引物和探针，并用荧光定量pcr进行验证；
47.s2、优化her2的检测体系
48.利用digital pcr仪将反应体系分成若干个独立的反应体系，使每个液滴中含有少于1个拷贝的目的基因，在设定好的反应条件下完成扩增反应；
49.用验证后的引物在dpcr体系对1.2倍倍比稀释标准品进定量，优化反应条件，构建dpcr定量检测her2基因异常扩增方法；
50.s3、建立从外周血标本中提取ctdna的流程和方法
51.抽取外周静脉edta抗凝血5ml，采用qiaamp通过裂解、结合、洗涤和洗脱4步，获得纯化和浓缩游离的dna。通过比较不同方法的提取效率和提取产物的纯度，找出最佳核酸提取方法。
52.s4、确定外周血ctdna中her2基因异常扩增的阈值
53.提取健康对照、经免疫组化、fish确诊her2表达情况胃癌患者的外周血ctdna，用建立的dpcr定量方法对提取的ctdna中的her2基因和cep17参比基因进行定量检测分析，用两者的比值来确定是否为her2阳性，即两者比值为1为阴性，两者比值大于1为阳性，以此初定判读阈值；
54.针对己有ihc和fish的her2分型结果的胃癌病例，将dpcr检测ctdna的her2基因定量检测结果与临床病理ihc，fish的her2分型结果比较，进行敏感性、特异性评价，调整确定最佳判读阈值；
55.s5、监测胃癌患者ctdna的her2基因异常扩增动态
56.开展中晚期胃癌患者术前术后ctdna的her2基因异常扩增动态监测，选取进展期胃癌患者，分别于术前、术后一个月及每隔3个月检测外周血ctdna的her2；
57.s6、确定定量检测her2拷贝数变异在胃癌进展监测中的应用可行性
58.探讨定量检测her2拷贝数变异在胃癌进展监测中的应用可行性，分析外周血ctdna的her2基因异常扩增动态变化与胃癌患者复发时长、治疗反应性的关系；同时，与患者同期影像结果比对，探讨定量检测her2拷贝数变异在胃癌精准治疗中的临床应用前景。
59.实施例1
60.本实施例用于构建her2基因的定量检测体系。具体步骤如下：
61.(1)利用软件针对her2基因和cep17基因设计引物和taqman探针，测定不同引物和探针的特异性和灵敏度；
62.设计并合成引物，对her2基因和cep17基因进行扩增，同时构建质粒作为标准品。
63.(2)利用digital pcr仪将20μl反应体系分成20,000个独立的反应体系，使每个液滴中含有少于1个拷贝的目的基因，完成扩增反应后，用液滴读取仪读取每个液滴的荧光值利用泊松分布计算出初始样本中目的基因的拷贝数；
64.通过her2基因与cep17基因拷贝数的比值来确定her2基因发生异常扩增定量检测；
65.(3)用验证后的引物在dpcr体系对1.2倍倍比稀释标准品进定量，对digital pcr反应条件进行优化包括液滴生成条件、反应温度、以及反应液中各组分浓度；
66.(4)通过分别在健康人血定量添加nci-n87和mkn-45癌细胞，考察所述检测方法对不同细胞的检测灵敏度和特异性，最终得到her2基因异常扩增的最佳判读阈值。
67.实施例2
68.本实施例中用于计算构建所述检测方法所需的样本量。本发明为基于digital pcr技术的ctdna her2基因异常扩增检测在胃癌精准诊治中的应用研究，属于单个诊断试验。
69.以病理fish结果为金标准，选择胃癌患者组和健康对照组进行研究，评价检测试验对胃癌her异常扩增表达分型的诊断价值，包括灵敏度和特异度。
70.样本量的计算依据如下：
71.(1)首先，选定置信度1-α；一般情况下，默认选取检验水准：α＝0.05(双侧)，即1-α＝0.95。
72.(2)根据既往文献或预实验的结果，设定四个参数，包括：
73.1)预计该方法诊断患者的灵敏度：73％；
74.2)灵敏度的容许误差：5％；
75.3)预计该方法诊断非患者的特异度：93％；
76.4)特异度的容许误差：10％。
77.(3)分别估算灵敏度所需要的样本量(n实验，即患者组的样本量)和特异度所需要的样本量(n对照，即非患者组的样本量)，由于患者和非患者采用相等样本量，因此两组研究对象均取上述最大值。
78.(4)诊断试验的样本例数计算公式为：
79.n＝(μα/δ)2
×
(1-p灵敏度)
×
p特异度；
80.其中，参数μα，因α＝0.05，μα＝zα/2＝1.960；
81.δ：判断界值，根据预试验及相关文献估计，综合取灵敏度或特异度的1/5～1/10，本发明中取δ＝0.l。
82.p：根据预试验及相关文献估计，p灵敏度＝0.73，p特异度＝0.93。
83.代入公式计算求出样本量：n试验组＝75，n对照组＝25例，患者组和非患者对照组采用2:1的样本量，故需要纳入75例患者和37例健康对照，共112例研究对象。
84.实施例3
85.本实施例中选择tnm分期诊断为iii、iv期的进展期胃癌患者纳入动态监测研究。
86.本实施例中所有胃癌患者组织病理均进行ihc和fish检测。所有患者均行术前、术后血浆标本采集。对照组为健康成人志愿者，并通过标准的肘静脉穿刺采集血浆。
87.患者的基本临床信息数据、肿瘤复发监测及后续管理均详细记录。根据实体瘤疗效评价标准(recist)，采用ct等影像学检查记录治疗反应；根据uicc分类标准确定肿瘤的病理类型。
88.根据《胃癌her2检测指南(2016版)》，组织标本先进行ihc检测，ihc评分为3 ，则判读为her2阳性；同时，对于her2阳性病例将给予曲妥珠单抗治疗；
89.ihc评分为0和1 则判读为阴性；
90.ihc评分为2 时则需采用fish进行检测，进一步明确her2表达分型情况。
91.使用本发明所述的检测方法对进展期胃癌患者的ctdna的her2基因的扩增动态进行检测和分析，具体步骤如下：
92.(1)根据外周血标本中提取循环肿瘤dna的流程和方法，抽取外周静脉血，加入edta抗凝血剂，采用qiaamp通过裂解、结合、洗涤和洗脱4步，获得纯化和浓缩游离的dna；
93.(2)分别于术前、术后一个月及每隔3个月检测外周血ctdna的her2基因异常扩增动态变化，并详细记录同期ct等影像学及治疗反应性等临床特征信息；
94.其中，所得的数据使用的数据管理与统计方法包括：
95.1、应用spss统计软件，ihc联合fish检测与ddpcr检测her2结果的一致性检验用kappa值表示：
96.当kappa＞0.75时，认为两法检验一致性好。
97.2、her2基因扩增与病理学指标的相关性用spearman相关分析，并计算两者相关系数r和p值；
98.3、血浆ctdna的her2基因扩增阳性比值与临床病理因素的关系分析采用x2或fisher精确检验。
99.本发明中所有进行的统计学检验，除了配对试验，均进行双侧检验，p值《0.05表示差异有统计学意义。
100.(3)分析外周血ctdna的her2基因异常扩增动态变化与胃癌患者复发时长、治疗反应性的关系；并与患者同期影像结果比对，探讨定量检测her2拷贝数变异在胃癌精准治疗中的临床应用前景。
101.综上所述，本发明所述的检测方法利用数字pcr技术，定量检测ctdna her2基因拷贝数，并以正常状态下所得到的拷贝数与参比基因的比值作为判断阈值，同时对判断阈值进行特异性和灵敏度优化得到最佳判读阈值，根据定量检测结果与最佳判读阈值判断her2基因的扩增情况，将其应用于胃癌的精准诊治中，能够指导胃癌her2阳性患者的靶向药物个体化治疗，对于肿瘤精准医学临床应用而言具有重要的意义。
102.申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。