益生菌SEUNEU-107及应用的制作方法

益生菌seuneu-107及应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，特别涉及益生菌seuneu-107及应用。


背景技术：

2.皮肤是人体内最大的器官，总重量大约占个体体重的16%，一方面维持机体稳定，另一方面也是抵御外界不良因素侵扰的第一道防线。有研究表明，如果外界环境导致皮肤屏障中的相关基因异常，就会诱发皮肤疾病。
3.痤疮是一种常见的慢性炎症性皮肤疾病，主要与皮脂分泌过多、毛囊皮脂腺导管堵塞、细菌感染和炎症反应等因素密切相关。研究表明，痤疮丙酸杆菌（propionibacterium acne）被认为引发痤疮的主要病原菌，它可以诱导和活化痤疮炎症的起始环节，并将甘油转换为脂肪酸，导致炎症反应；同时产生蛋白酶、透明质酸酶及趋化因子，使毛囊过度角化，形成痤疮。另一方面，皮肤常驻的表皮葡萄球菌与痤疮丙酸杆菌能够相互拮抗竞争，增加表皮葡萄球菌的数量能够抑制痤疮丙酸杆菌增殖。因此，降低痤疮丙酸杆菌/表皮葡萄球菌的菌群比例，可以有效缓解痤疮炎症，从而通过调节皮肤微生态平衡来维持皮肤健康。
4.敏感肌通常是由于皮肤细胞受损而使皮肤免疫力下降，角质层变薄导致皮肤滋润度不够，最终导致肌肤的屏障功能过于薄弱，无法抵御外界刺激，从而易于产生泛红，发热，瘙痒、刺痛等不适现象的产生。而皮肤屏障的受损，则会进一步导致金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）的定植增殖，导致发炎红肿。皮肤常驻的表皮葡萄球菌（staphylococcus epidermidis）与金黄色葡萄球菌相互拮抗，能够降低后者的增殖。因此降低金黄色葡萄球菌/表皮葡萄球菌的菌群比例，有助于建立皮肤菌群的平衡分布，从而改善敏感肌。
5.益生菌用在化妆品上，可平衡皮肤表皮菌群，修复皮肤屏障。正如文献中报道的，益生菌外用可以治疗特异性皮炎，促进皮肤屏障的修复。同时研究发现益生菌能通过调节巨噬细胞的免疫功能以及吞噬能力来预防和治疗各种炎症疾病，并能有效增加肌肤对营养物质的吸收，增强肌肤的免疫力。
6.因此，提供能够预防和治疗各种炎症疾病的益生菌具有重要的现实意义。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明提供了益生菌seuneu-107及应用，其具有治疗痤疮、鼻窦炎以及改善敏感肌的功能。
8.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了植物乳杆菌（lactobacillus plantarum），保藏编号为cctcc no: m 20211558。
9.在本发明的一些具体实施方案中，上述植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）是活的或死的或经间歇灭菌的，或为裂解物和/或提取物的形式，或为细菌产物的形式或为上清液形式或衍生物形式，所述衍生物形式包括：代谢产物、代谢生物产物、益生素、细胞壁
及其成分、胞外多糖，和含有免疫原性成分的化合物，包括：上清液、灭活菌体。
10.本发明还提供了上述植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）在制备调节菌群、抗炎和/或抗过敏的产品中的应用；所述产品包括微生物制剂、食品、药物或化妆品。
11.本发明还提供了上述植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）在制备改善敏感肌、改善肌肤状况和/或治疗痤疮的产品中的应用；所述产品包括微生物制剂、食品、药物或化妆品。
12.本发明还提供了上述植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）在制备下调细胞炎症因子表达、降低炎症因子释放、抑制致病菌生长、促进益生菌增殖和/或改变菌群比例的产品中的应用；所述产品包括微生物制剂、食品、药物或化妆品。
13.本发明还提供了上述植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）在制备降低细胞一氧化氮生成量，下调细胞il-6、il-8、cox-2、tnf-α、ifn-γ和/或il-4的表达，抑制痤疮丙酸杆菌生长，促进表皮葡萄球菌增殖和/或抑制金黄色葡萄球菌生长的产品中的应用；所述产品包括微生物制剂、食品、药物或化妆品。
14.本发明还提供了上述植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）能降低痤疮丙酸杆菌/表皮葡萄球菌的比例和/或降低金黄色葡萄球菌/表皮葡萄球菌的比例。
15.本发明还提供了微生物制剂，具有上述植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）以及可接受的辅料和/或助剂。
16.在本发明的一些具体实施方案中，上述微生物制剂还包括酵母菌、益生芽孢菌、丁酸梭菌、乳杆菌、双歧杆菌和/或放线菌等。
17.本发明还提供了食品，具有上述植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）和/或上述微生物制剂以及可接受的辅料和/或助剂。
18.本发明还提供了药物，具有上述植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）和/或上述微生物制剂以及可接受的辅料和/或助剂。
19.本发明还提供了化妆品，其特征在于，具有上述植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）和/或上述的微生物制剂以及可接受的辅料和/或助剂。
20.在本发明的一些具体实施方案中，上述辅料或助剂包括营养强化剂、甜味调节剂、酸度调节剂、等渗调节剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、增溶剂、助溶剂、防腐剂、矫味剂、着色剂、助悬剂、润湿剂、乳化剂和/或表面活性剂。
21.本发明的菌株有如下效果：1、本发明的seuneu-107经16s rrna鉴定为植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）。
22.2、体外细胞实验表明，本发明的植物乳杆菌seuneu-107具有降低炎症因子释放的作用，能够降低脂多糖（lps）诱导小鼠巨噬细胞raw264.7的一氧化氮（no）生成量44.41%~57.54%。
23.3、体外细胞实验表明，本发明的植物乳杆菌seuneu-107具有下调金黄色葡萄球菌诱导的人永生化角质形成细胞hacat炎症相关因子il-6、il-8和环氧合酶-2基因cox-2表达的作用，基因表达量下调26.00%~91.00%。
24.4、体外实验表明，本发明的植物乳杆菌seuneu-107具有降低痤疮丙酸杆菌/表皮葡萄球菌的比例，从而治疗痤疮的功能。
25.5、体外实验表明，本发明的植物乳杆菌seuneu-107具有降低金黄色葡萄球菌/表皮葡萄球菌的比例，从而改善敏感肌的功能。
26.生物保藏说明生物材料：seuneu-107，分类命名：植物乳杆菌 seuneu-107（lactobacillus plantarum seuneu-107），于2021年12月06日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为cctcc no: m 20211558。
27.本发明中所述seuneu-107即为上述保藏编号为cctcc no: m 20211558的菌株。
附图说明
28.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
29.图1示seuneu-107下调hacat细胞炎症相关因子的表达；图2示seuneu-107下调hnec细胞炎症相关因子的表达。
具体实施方式
30.本发明公开了益生菌seuneu-107及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
31.利用微生态技术开发的益生菌相关产品，能够有效解决如前所述的问题。本发明从延边朝鲜族特色苏子叶中分离鉴定的植物乳杆菌seuneu-107，兼具抗炎、治疗痤疮以及改善敏感肌的作用，在食品、药品、化妆品等领域具有极大的市场潜力。
32.该菌株革兰氏阳性，显微镜下呈杆状；在mrs平板上生长，可形成表面光滑不透明的圆形菌落，白色，边缘整齐；在mrs液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀，最适生长温度37℃。
33.本发明进一步提供植物乳杆菌seuneu-107的存在形式，其为活的或死的或经间歇灭菌的，或为裂解物和/或提取物的形式，或为细菌产物的形式或为上清液形式或衍生物形式，所述衍生物形式优选自：代谢产物、代谢生物产物、益生素、细胞壁及其成分、胞外多糖，和含有免疫原性成分的化合物，优选自：上清液、灭活菌体。
34.本发明所用原料及试剂均可由市场购得。
35.下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1：seuneu-107的分离于延边朝鲜族特色苏子叶中采样。将样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清划线于mrs固体平板，37℃恒温培养24~48 h后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为seuneu-107。
36.革兰氏染色镜检：菌株seuneu-107为革兰氏染色阳性，显微镜下呈杆状；在mrs平
板上生长，可形成白色、表面光滑圆润不透明圆形小菌落，边缘整齐；在mrs液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。
37.实施例2：seuneu-107的核酸鉴定1、16s rrna基因序列分析：挑取单菌落置mrs液体培养基中，37℃培养过夜后，离心收集菌体，按照dna提取试剂盒步骤进行操作。引物用细菌通用引物27f，1492r，pcr扩增体系为50 μl体系，95℃预变性5 min；94℃ 15 s，57℃ 15 s，72℃ 40 s，35个循环；72℃延伸10min。
38.2、结果pcr产物测序结果与genbank中已发表的标准序列进行同源性比较（blastn）后得出seuneu-107菌株为植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）。
39.实施例3：seuneu-107降低raw264.7细胞no生成量1、seuneu-107菌液制备将seuneu-107用mrs培养基培养过夜，检测od
600
，调整菌液浓度至od
600
=0.2，离心后，菌体121℃高压灭菌30 min得菌体，离心发酵液用0.22 μm滤膜过滤得上清液。
40.2、raw264.7细胞制备将raw264.7细胞消化后以2
×
105/孔接种至24孔板，5%二氧化碳培养箱37℃培养过夜。
41.3、seuneu-107添加及lps刺激将上清液5%、灭活菌体10%分不同组加入培养过夜的raw264.7细胞中，2 h后添加0.5 ml浓度为0.2 μg/ml的lps溶液，诱导raw264.7细胞发炎，20 h后取细胞培养上清液，按照碧云天no检测试剂盒所述方法进行标准曲线绘制，计算样品中no的浓度及抑制率。
42.4、结果如表1所示：结果显示seuneu-107具有抗炎作用，能够降低lps诱导的raw264.7细胞no生成量，与lps对照组相比上清液降低57.54%，灭活菌体降低44.41%。
43.实施例4：seuneu-107下调hacat细胞炎性因子的表达1、seuneu-107样品制备将seuneu-107用mrs培养过夜，检测od
600
，调整菌液浓度至od
600
=0.2，离心后，菌体121℃高压灭菌30 min得菌体，离心上清用0.22 μm滤膜过滤得上清液。
44.2、hacat细胞制备将hacat细胞消化后以2
×
10
5 cells/孔接种至24孔板，5%二氧化碳培养箱37℃培养过夜。
45.3、金黄色葡萄球菌制备及添加金黄色葡萄球菌接入营养肉汤培养基，37℃摇床培养过夜，用mem无血清培养基调
整菌液浓度至od
600
=6，每孔100 μl添加入培养过夜的hacat细胞中，刺激细胞产生炎症因子，3 h后弃去细胞培养基，pbs清洗5次，每孔重新加入1 ml的mem无血清培养基。
46.4、seuneu-107样品添加将seuneu-107上清液以5%加入金黄色葡萄球菌刺激过的hacat细胞中，每组3个复孔，培养过夜。
47.5、qpcr法检测细胞炎症因子mrna相对表达倍数将上述细胞弃去培养基后，用rna提取试剂盒提取rna，检测rna浓度及纯度，将所有样品调整至1 μg，用反转录试剂盒、sybr green qpcr试剂盒进行rt-pcr及qpcr，以不添加菌株上清液和灭活菌体的处理组为对照，其基因表达量为1，计算炎症因子基因相对表达倍数f。
48.公式：f=2-δδct
6、结果如图1、表2所示：结果显示seuneu-107能够下调金黄色葡萄球菌诱导的hacat炎性因子il-6、il-8、cox-2基因表达量降低，表达量下调26.00%-91.00%。因此，seuneu-107具有抗炎作用。
49.seuneu-107下调hacat细胞炎症因子相关基因表达的结果见图1。
50.实施例5：seuneu-107改变菌群比例治疗痤疮的作用1、植物乳杆菌seuneu-107菌液制备：将活化的植物乳杆菌seuneu-107菌液以mrs液体培养基培养于37℃培养箱静置培养16~18 h，检测并调整od
600
=2.0，121℃，30 min灭活，离心取上清液，0.22 μm滤膜过滤，得待测样品。
51.2、皮肤菌群菌液制备：将痤疮丙酸杆菌cgmcc 1.5003和表皮葡萄球菌cgmcc 1.4260分别以bhi培养基37℃培养18 h，检测并调整od
600
=0.2。
52.3、添加上清液影响痤疮相关菌群生长实验将灭活上清液以10%分别加入两种菌液中，培养至对数期，分别测定两种菌液浓度（od
600
），以未添加上清液的菌液为对照，计算两种菌液的相对浓度，以痤疮丙酸杆菌/表皮葡萄球菌相对浓度比值评价对皮肤菌群生长影响。
53.4、结果如表3所示：
结果显示seuneu-107对痤疮丙酸杆菌有显著抑制作用，而对表皮葡萄球菌有一定促进增殖作用。seuneu-107能够明显改变皮肤菌群比例，从而达到治疗痤疮的目的。
54.实施例6：seuneu-107下调hnec鼻黏膜细胞炎性因子的表达1、seuneu-107样品制备将seuneu-107用mrs培养过夜，检测od
600
，调整菌液浓度至od
600
=0.2，离心后，121℃，30 min灭活，离心取上清液，0.22 μm滤膜过滤，得待测样品。
55.2、hnec鼻黏膜细胞制备将hnec细胞消化后以1
×
10
6 cells/孔接种至6孔板，5%二氧化碳培养箱37℃培养过夜。
56.3、lps制备及添加将hnec细胞培养过夜后更换无血清培养基，lps用dmem无血清培养基调整浓度至0.1 μg/ml，每孔500 μl添加入hnec细胞中，刺激细胞产生炎症因子，6 h后弃去细胞培养基，每孔重新加入2.5 ml的dmem无血清培养基继续培养至过夜。
57.4、seuneu-107样品添加将seuneu-107上清液以10%加入lps刺激过的hnec细胞中，每组3个复孔，培养过夜。
58.5、qpcr法检测细胞炎症因子mrna相对表达倍数将上述细胞弃去培养基后，用rna提取试剂盒提取rna，检测rna浓度及纯度，将所有样品调整至1 μg，用反转录试剂盒、sybr green qpcr试剂盒进行rt-pcr及qpcr，以不添加菌株上清液和灭活菌体的处理组为对照，其基因表达量为1，计算炎症因子基因相对表达倍数f。
59.公式：f=2-δδct
6、结果如图2、表4所示：表4 seuneu-107下调hnec细胞炎症相关因子的表达结果显示seuneu-107能够下调lps诱导的hnec炎性因子tnf-α、ifn-γ、il-4基因表达量。因此，seuneu-107具有抗炎作用。
60.seuneu-107下调hnec鼻黏膜细胞炎症因子相关基因表达结果见图2。
61.实施例7：seuneu-107改变菌群比例改善敏感肌的作用1、植物乳杆菌seuneu-107菌液制备：将活化的植物乳杆菌seuneu-107菌液以mrs液体培养基培养于37℃培养箱静置培养16~18 h，检测并调整od
600
=2.0，121℃，30 min灭活，离心取上清液，0.22 μm滤膜过滤，得待测样品。
62.2、敏感肌相关菌群菌液制备：将金黄色葡萄球菌cgmcc 1.8721和表皮葡萄球菌cgmcc 1.4260分别以bhi培养基37℃培养18 h，检测并调整od
600
=0.2。
63.3、添加上清液影响敏感肌相关菌群生长实验将灭活上清液以10%分别加入两种菌液中，培养至对数期，分别测定两种菌液浓度（od
600
），以未添加上清液的菌液为对照，计算两种菌液的相对浓度，以金黄色葡萄球菌/表皮葡萄球菌相对浓度比值评价对敏感肌相关菌群生长影响。
64.4、结果如表5所示：表5 seuneu-107对敏感肌相关菌群生长影响结果显示seuneu-107对皮肤主要病原菌金黄色葡萄球菌有显著抑制作用，而对表皮葡萄球菌有一定促进增殖作用。seuneu-107能够改变皮肤菌群比例，从而有效改善敏感肌菌群。
65.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。