一种核酸检测的曲线建立方法、检测方法及其试剂盒与流程

1.本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种核酸检测的曲线建立方法、检测方法及其试剂盒。


背景技术：

2.核酸检测在疾病诊断，病源微生物、病毒的检测领域具有极其重要的作用。核酸检测就是对致病微生物的dna或rna的序列进行分析，然后通过分析结果来确诊病情。通过核酸检测就能知道是否存在病毒感染的情况，有助于及时发现病情。目前新冠病毒感染就是通过核酸检测来进行诊断的，如果核酸检测结果呈现阳性，就可以判断感染了新冠病毒。
3.核酸检测需要使用分子生物学方法来实现。核酸检测使用的方法是pcr扩增，步骤比较多。目前为了提高核酸检测的灵敏度，一般采用结合荧光检测法的荧光定量pcr方法，虽然这种检测方法具有较高的检测灵敏度，但是只能在中心实验室开展，且检测时间长，无法在现场进行快速检测，且容易受到杂散光以及样本内自发荧光的干扰，检测灵敏度仍然有限。目前亟需一种能显著缩短检测时间、大幅度提高检测灵敏度和特异性的核酸检测方法，这在全球新冠病毒疫情肆虐的背景下具有极为重要的意义。


技术实现要素：

4.针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种利用时间分辨荧光的核酸快速检测方法及其试剂盒，通过设计可与目标待测物部分互补的两段捕获链，其中第一捕获链与磁球连接，第二捕获链可引发发卡结构时间分辨荧光探针结合，通过磁球可实现目标待测物从样本中分离，再利用替换链在较高温度时与捕获链有高于目标物的结合能力，将磁球及荧光探针替换下，通过测定溶液中的荧光信号，实现对目标物的高灵敏度高特异性快速检测。
5.本发明提供一种核酸检测的曲线建立方法，包括如下步骤：
6.s1：设计第一捕获链、第二捕获链和替换链的序列，所述第一捕获链、第二捕获链均能与目标核酸序列互补配对，替换链可代替目标核酸与第一捕获链、第二捕获链互补配对。替换链在较高温度时与第一捕获链、第二捕获链具有更好的互补配对能力，所以可替换目标核酸序列；
7.s2：获得修饰有第一捕获链的磁球分散液；
8.s3：向步骤s2的修饰有第一捕获链的磁球分散液中加入第二捕获链和一系列不同浓度的目标核酸，混合反应，第一捕获链和第二捕获链结合在目标核酸的不同部位，实现磁球对目标核酸的完全捕获；
9.s4：加入时间分辨荧光发卡核酸探针，第二捕获链与所述时间分辨荧光发卡核酸探针发生链式杂交反应；
10.s5：加入替换链，混合反应，把磁球和时间分辨荧光发卡核酸探针替换下；
11.s6：吸附磁球，回收剩余的溶液部分；
12.s7：检测s6溶液部分的时间分辨荧光强度，建立核酸浓度-荧光强度工作曲线。
13.本发明还提供一种使用所述曲线建立方法所获得的核酸浓度-荧光强度工作曲线来进行核酸快速检测的方法，包括如下步骤：
14.s1：获得修饰有第一捕获链的磁球溶液，所述第一捕获链能够与目标核酸序列互补配对；
15.s2：向步骤s1的修饰有第一捕获链的磁球溶液中加入第二捕获链和待测目标物，混合反应，第一捕获链和第二捕获链结合在待测目标物的核酸的不同部位，实现磁球对目标核酸的完全捕获；
16.s3：加入时间分辨荧光发卡核酸探针，第二捕获链与所述时间分辨荧光发卡核酸探针发生链式杂交反应；
17.s4：加入替换链，混合反应，把磁球和时间分辨荧光发卡核酸探针替换下；
18.s5：吸附磁球，回收剩余的溶液部分；
19.s6：检测s5溶液部分的时间分辨荧光强度，根据所获得的核酸浓度-荧光强度工作曲线计算出待测目标物的核酸浓度。
20.进一步的，所述步骤s1中所述磁球和所述第一捕获链的摩尔比为1:1-1:30。
21.进一步的，所述步骤s1中所述磁球和所述第一捕获链的摩尔比为1:8。这个比值是最优的，比值太低偶联效率低，比值太高会造成成本升高和浪费。
22.进一步的，所述步骤s2中所述第二捕获链的终浓度为10-100nm，所述步骤s3中所述时间分辨荧光发卡核酸探针的终浓度为10-100nm，所述步骤s4中所述替换链的终浓度为10-100nm。
23.进一步的，所述步骤s2中所述第二捕获链的终浓度为50nm，所述步骤s3中所述时间分辨荧光发卡核酸探针的终浓度为50nm，所述步骤s4中所述替换链的终浓度为50nm，时间分辨荧光发卡核酸探针是绝对过量的，但是浓度过高会导致后续步骤中很难洗掉未结合的探针，浓度过低不能有效放大信号，故所述第二捕获链、时间分辨荧光发卡核酸探针和替换链的终浓度都是实验验证的最优选择。
24.进一步的，所述步骤s3中所述时间分辨荧光发卡核酸探针的荧光基团为镧系螯合物长寿命荧光染料。
25.进一步的，所述步骤s3中所述时间分辨荧光发卡核酸探针的荧光基团为铽离子的配合物，所述铽离子的配合物为l4tb，所述l4tb中的铽离子与配体结合，所述配体的结构式为：
26.普通的铽(tb)材料，没有做络合物保护，光强很弱且稳定性较差，l4tb荧光基团中的tb有所述结构式的配体保护，tb与所述结构式的配体结合，更加稳定，故使用l4tb作为荧光基团可以提高荧光强度并且增强光稳定性。
27.进一步的，所述步骤s4的反应温度高于步骤s2的反应温度。
28.本发明还提供一种核酸快速检测试剂盒，其特征在于，包括以下成份：磁球、第一捕获链、第二捕获链、替换链、时间分辨荧光发卡核酸探针和缓冲液，所述第一捕获链、第二捕获链和替换链均与目标核酸序列互补配对，所述第二捕获链与所述时间分辨荧光发卡核酸探针发生链式杂交反应，替换链可代替目标核酸与第一捕获链、第二捕获链互补配对。
29.进一步的，所述时间分辨荧光发卡核酸探针的荧光基团为镧系螯合物长寿命荧光染料。
30.本发明还提供所述的检测试剂盒在新型冠状病毒核酸检测上的应用。
31.进一步的，所述第一捕获链的序列为：catcaggagatgc。
32.进一步的，所述第二捕获链的序列为：ctggatgatgatgagatgagaatgccacgtacaggtggaacct。
33.进一步的，所述替换链的序列为：caggtggaacctcatcaggagatgc。
34.综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
35.1.本发明利用结合磁球的快速富集和高效分离能力直接捕获样本内的目标核酸片段，并通过杂交链反应放大荧光信号达到高灵敏度检测。
36.2.本发明的方法可以显著缩短核酸检测的时间，普通核酸检测方法至少需要4小时，而本发明的流程可以缩短到1小时以内。
37.3.本发明的方法具有很高的特异性，可以大量富集痕量的目标核酸。
38.4.本发明的试剂盒可以用于新型冠状病毒核酸的快速检测。
附图说明
39.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
40.图1为本发明的工作曲线建立方法的流程示意图。
41.图2为本发明的核酸检测方法的流程示意图。
42.图3为本发明的第一捕获链及2和目标核酸的结合示意图。
43.图4为实施例1中以新冠病毒为例的第一捕获链及2和目标核酸的结合示意图。
44.图5为本发明检测新冠病毒核酸的工作曲线。
45.图6为本方法检测目标物及对照物的特异性验证，其中，1为空白缓冲液，2为目标检测物(浓度1nm)，3/4/5均为普通流感病毒dna(浓度1μm)。
具体实施方式
46.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
47.时间分辨荧光(time resolved fluorescence，trf)检测技术是基于稀土配合物特殊的荧光性质建立起来的，是目前最灵敏的微量分析技术，其灵敏度高达10-12
g/ml，时间分辨荧光检测技术利用镧系金属螯合物作为荧光基团，利用其超长荧光寿命(毫秒级)，结合时间门控检测技术可以有效的隔绝杂散光以及样本自发荧光的干扰(纳秒级荧光寿命)，极大的降低背景荧光，有效的提高信噪比，实现超灵敏检测。然而目前普通的铽(tb)材料，没有做络合物保护，光强很弱且稳定性较差，本发明中使用的l4tb荧光基团中的tb有配体保护，tb与配体结合，更加稳定，故使用l4tb作为荧光基团可以提高荧光强度并且增强光稳定性。
48.磁球分离技术是利用包裹了很多超顺磁纳米颗粒的高分子微球(微米尺度)，其表面修饰的生物分子可以与样本中的生物分子特异性相互作用，在磁场的作用下磁球聚集在一侧，可以非常简便的换液、洗脱，不需要任何离心操作，有效富集样本里痕量生物分子用于后续的检测，可用于现场快速检测。
49.本发明的方法结合上述磁球分离与时间分辨荧光检测技术，充分利用磁球可快速分离和富集痕量核酸，通过后续的杂交链式反应，大幅提高磁球表面特异性吸附的时间分辨荧光探针的浓度，从而放大荧光信号，提高检测灵敏度和特异性并缩短检测时间，利用本发明的方法制成的试剂盒可用于新冠病毒核酸的快速检测。
50.本发明的方法包括如下步骤，
51.一、绘制核酸浓度-荧光强度工作曲线，流程如图1所示，具体步骤如下：
52.(1)设计第一捕获链、第二捕获链和替换链的序列，三者均与目标待测物的核酸序列部分互补配对。第一捕获链、第二捕获链能分别与待测物的核酸序列的一部分互补结合，结合后第一捕获链、第二捕获链和待测核酸可以形成一个三元复合结构。
53.(2)磁球用缓冲液冲洗后，加入第一捕获链，振荡反应后加入反应缓冲液再冲洗，去掉未结合的游离第一捕获链，获得修饰有第一捕获链的磁球分散液。
54.(3)加入第二捕获链，同时加入一系列不同浓度的目标核酸，与修饰有第一捕获链的磁球均匀混合后反应，此时第一捕获链和第二捕获链都结合到目标核酸序列上，从而实现磁球对环境中目标核酸的完全捕获，第一捕获链及2和目标核酸的结合如图3所示。
55.(4)用反应缓冲液将磁球反复冲洗，去掉多余的未结合的目标待测物和第二捕获链，加入时间分辨荧光发卡核酸探针，振荡反应，第二捕获链与所述时间分辨荧光发卡核酸探针发生链式杂交反应，用反应缓冲液反复清洗磁球，检测上清液的荧光信号，直至不再检测出荧光信号，此步清洗的目的是为了去掉游离的未被结合的时间分辨荧光发卡核酸探针。
56.(5)加入替换链，升高反应温度，因为替换链在较高温度时与目标核酸的结合能力比第一捕获链和第二捕获链更强，可以将目标核酸上结合的连接有磁球的第一捕获链和连接有荧光探针的第二捕获链替换下来。
57.(6)利用磁铁吸引磁球到试验管侧壁，回收剩余的溶液部分。将磁球吸附回收后，检测上清液中的荧光信号。通过检测不同浓度目标核酸下的荧光强度，建立核酸浓度-时间分辨荧光强度工作曲线。
58.二、待测目标物的浓度检测，流程如图2所示：
59.获得步骤(6)中的工作曲线后，重复上述步骤(2)-(6)的操作步骤，将步骤(3)中一
系列不同浓度的目标核酸替代为待测目标物，检测上清液中的时间分辨荧光信号强度，即可依据工作曲线根据待测目标物的荧光强度计算出目标物的浓度。
60.以下实施例以新冠病毒的核酸检测为例，说明本发明的方法实际操作的步骤和使用方法。
61.实施例1本发明的方法可以实现新冠病毒核酸的快速检测
62.具体包括如下步骤：
63.一、绘制核酸浓度-荧光强度工作曲线
64.(1)设计第一捕获链、第二捕获链和替换链的序列，第一捕获链、第二捕获链均与新冠病毒cdna的序列部分互补配对，新冠病毒cdna的序列为gcaucuccugaugagguuccaccug，第一捕获链的序列为：catcaggagatgc-生物素，第二捕获链的序列为：ctggatgatgatgagatgagaatgccacgtacaggtggaacct，替换链在较高温度时与第一捕获链、第二捕获链具有更好的互补配对能力，可替换检测目标序列，替换链的序列为caggtggaacctcatcaggagatgc。
65.(2)磁球用缓冲液(ph＝7.4，25mm hepes)冲洗三次后，按照磁球：第一捕获链为1:1-1:30的摩尔比加入第一捕获链，优选为1:8，室温振荡反应1h后加入反应缓冲液再冲洗三次，去掉未结合的游离第一捕获链，获得修饰有第一捕获链的磁球，反应缓冲液ph为7.4，包含25mm hepes、0.15m nacl和5mm mgcl2的缓冲溶液。
66.(3)加入第二捕获链，第二捕获链的终浓度为10-100nm，优选为50nm，同时分别加入一系列待测核酸，待测核酸为浓度0.02-0.8nm的新冠病毒cdna，第二捕获链和待测核酸与修饰有第一捕获链的磁球均匀混合后，37℃反应1h，此时第一捕获链和第二捕获链都结合到新冠病毒cdna序列上，从而实现磁球对环境中新冠病毒cdna序列的完全捕获，第一捕获链及2和新冠病毒cdna序列的结合如图4所示。
67.(4)用反应缓冲液将磁球反复冲洗3次，去掉多余的未结合的目标待测物和第二捕获链，加入终浓度为10-100nm的时间分辨荧光发卡核酸探针h1及h2，优选为50nm，所用探针h1和h2的核酸序列为：h1：hn
2-tacgtggcattctcatctcatcatcatccaggcgtgggcgtactggatgatgatgagatgag；h2：hn
2-ctggatgatgatgagatgagaatgccacgtactcatctcatcatcatccagtacgcccacgc，核酸序列亦可以选用其他序列，并不限定为以上h1和h2序列。h1和h2序列上连接有时间分辨荧光基团，为镧系螯合物长寿命荧光染料。本实施例中选用效果更优的铽离子的配合物l4tb，其配体结构式为：
68.普通的铽(tb)材料，没有做络合物保护，光强很弱且稳定性较差，本发明中使用的l4tb荧光基团中的tb有配体保护，tb与配体结合，更加稳定，故使用l4tb作为荧光基团可以提高荧光强度并且增强光稳定性。
69.室温振荡反应1h，第二捕获链可引发时间分辨荧光发卡核酸探针h1及h2结合，用
反应缓冲液反复清洗磁球，间隔时间收集上清液，检测上清液的荧光信号至不再检测出荧光信号，说明体系中不再存在游离的未被结合的时间分辨荧光发卡核酸探针。
70.(5)加入终浓度为10-100nm的替换链，优选为50nm，45℃反应30min，替换链在较高温度时与目标核酸的结合能力比第一捕获链和2更强，可以将新冠病毒cdna序列上结合的连接有磁球的第一捕获链和连接有荧光探针的第二捕获链替换下来。
71.(6)利用磁铁吸引磁球到试验管侧壁，回收溶液部分，检测上清液中的荧光信号。通过检测0.02-0.8nm的一系列不同浓度新冠病毒cdna在上述操作步骤后的荧光强度，建立核酸浓度-时间分辨荧光强度工作曲线，工作曲线如图5所示，横坐标为新冠病毒cdna的浓度，纵坐标为100-500μs荧光强度，图5显示工作曲线呈现标准线性曲线的形态，说明新冠病毒cdna的浓度与荧光强度具有明显的正相关性，所以可以依据上述工作曲线根据待测目标物的荧光强度计算出目标物的浓度。
72.二、待测目标物的浓度检测
73.获得步骤(6)中的工作曲线后，重复上述步骤(2)-(6)的操作步骤，将步骤(3)中一系列不同浓度的目标核酸替代为待测目标物，检测上清液中的荧光信号强度，即可依据工作曲线根据待测目标物的荧光强度计算出目标物的浓度。
74.实施例2本方法检测目标物及对照物的特异性验证
75.为了验证本发明的方法具有很高的特异性，进行了如下对比试验。采用实施例1中的方法，设计的第一捕获链及第二捕获链链都是新冠病毒cdna序列的部分互补序列，替换链在较高温度时与第一捕获链、第二捕获链具有更好的互补配对能力，可替换检测目标序列，序列信息同实施例1中的序列。分5个组进行实验，组1为不加入待测核酸序列的阴性对照组，只加入缓冲溶液，组2加入的待测核酸为浓度为1nm的新冠病毒核酸，组3/4/5分别加入浓度为1μm的普通流感病毒dna，组3所用的普通流感病毒dna序列为gccauaggaaauugcccaauaugggug，组4所用的普通流感病毒dna序列为cucggcuuugagggggccuga，组5所用的普通流感病毒dna序列为cauucuguuucucaacuuaagaggg，按照实施例1的步骤进行操作，分别对以上5组的时间分辨荧光的强度进行检测，结果如图6所示，1为空白缓冲液组，2为新冠病毒核酸组(浓度1nm)，3/4/5均为普通流感病毒dna组(浓度为1μm)，纵坐标为时间分辨荧光强度的数值(100-500μs)，结果显示新冠病毒核酸组的时间分辨荧光强度为19227，是组1和组3/4/5的十倍以上，说明本发明的方法具有非常高的特异性，只会富集配对的核酸序列，而序列不相同或仅具有部分相似的核酸序列不会被富集和检测到，本发明充分利用磁球可快速分离和富集痕量核酸，通过后续的杂交链式反应，大幅提高磁球表面特异性吸附的时间分辨荧光探针的浓度，从而放大荧光信号，提高了检测灵敏度和特异性。
76.实施例3本发明的试剂盒进行核酸快速检测的方法
77.本发明的试剂盒包括磁球、第一捕获链、第二捕获链、替换链、时间分辨荧光发卡核酸探针和缓冲液，还可包含水。第一捕获链、第二捕获链能分别与待测物的核酸序列的一部分互补结合，结合后第一捕获链、第二捕获链和待测核酸可以形成一个三元复合结构。其中第一捕获链、第二捕获链和替换链均以干粉形式提供，使用时加水溶解为需要的浓度。
78.具体使用过程包括如下步骤：
79.(1)按照磁球：第一捕获链为1:8的摩尔比加入第一捕获链，用第一捕获链修饰磁
球，用缓冲液冲洗三次，洗掉未结合的游离第一捕获链，缓冲液ph为7.4，包含25mm hepes、0.15m nacl和5mm mgcl2的缓冲溶液。
80.(2)加入第二捕获链和待测核酸，第二捕获链的终浓度为50nm，37℃反应1h，从而实现磁球对环境中目标待测物的完全捕获，用缓冲液将磁球反复冲洗3次，去掉多余的未结合的目标待测物和第二捕获链。
81.(3)加入终浓度为50nm的时间分辨荧光发卡核酸探针1及2，室温振荡反应1h，第二捕获链可引发时间分辨荧光发卡核酸探针1及2结合，用反应缓冲液反复清洗磁球至洗脱液中不再检测出荧光信号，此步清洗的目的是为了去掉游离的未被结合的时间分辨荧光发卡核酸探针。
82.(4)加入终浓度为50nm的替换链，45℃反应30min，替换链在较高温度时与目标核酸的结合能力比第一捕获链和第二捕获链更强，可以将新冠病毒cdna序列上结合的连接有磁球的第一捕获链和连接有荧光探针的第二捕获链替换下来。
83.(5)利用磁铁吸引磁球到试验管侧壁，回收溶液部分，检测上清液中的时间分辨荧光信号。通过检测一系列不同浓度新冠病毒cdna在上述操作步骤后的荧光强度，建立核酸浓度-时间分辨荧光强度工作曲线，而后可以依据工作曲线根据待测目标物的时间分辨荧光强度计算出目标物的核酸浓度。
84.综上，本发明提供了一种核酸检测的曲线建立方法、检测方法及通过该方法实现核酸快速检测的试剂盒，本发明的曲线建立方法结合磁球分离与时间分辨荧光检测技术，充分利用磁球可快速分离和富集痕量核酸，通过后续的杂交链式反应，大幅提高磁球表面特异性吸附的时间分辨荧光探针的浓度，从而放大荧光信号，建立核酸浓度-时间分辨荧光强度工作曲线，之后基于工作曲线可以根据待测目标物的荧光强度计算得出待测目标物的核酸浓度。此外，本发明中使用的l4tb荧光基团中的tb有配体保护，tb与配体结合，更加稳定，故使用l4tb作为荧光基团可以提高荧光强度并且增强光稳定性。基于以上发明构思，本发明的方法提高检测灵敏度和特异性的同时还能缩短检测时间，普通核酸检测方法至少需要4小时，而本发明的流程可以缩短到1小时以内。实验结果也证实通过该方法实现核酸快速检测的试剂盒可用于新冠病毒核酸的快速检测。
85.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。