一种农废物总黄酮的提取工艺、抑菌性及其用途

1.本发明涉及农业废物利用技术领域，具体涉及一种茭白苞叶总黄酮的提取工艺及其用途。


背景技术：

2.茭白，古称菰，是一种多年生水生宿根草木植物，属于禾本科菰属，原产于中国和东南亚地区。茭白是一种药食同源的植物，其可食用部分为其膨大的肉质茎。作为食物，茭白的营养价值很高，不仅含有丰富的蛋白质、脂肪、糖类、维生素和矿物质等，还含有多种人体必需的氨基酸；作为药材，茭白味甘微寒，具有祛热、生津、止渴、利尿、除湿、通利的功效，因此有着“水中人参”的美誉。茭白植株高大，生物产量高，茭白苞叶的生物质量占茭白植株总质量的50％～70％，每667m2双季茭当年产生的鲜苞叶就在5000kg以上。照此计算，仅江苏省一年的茭白苞叶鲜质量就在35～49万吨之间。在茭白收获的季节，大量茭白苞叶被遗弃在村道、公路和河边等，成为污染物，有的被直接焚烧造成了严重的环境污染，同时也成了一些病虫害滋生的场所。
3.因此，茭白苞叶资源的综合开发利用是茭白产业当前亟需解决的问题和难题。蒋柏荣等研究人员(中国畜禽种业，2013(7)：3)曾尝试将茭白苞叶作为青储饲料饲喂牛羊等反刍动物，被认为是一种较好的农废物处理措施，然而，只经过牲畜过腹还田，其能量利用率较低，而事实上，农废物同样富含具有开发价值的功能成分，本发明提供了一种茭白苞叶总黄酮(tfzb)的提取工艺、抑菌性及其应用，为茭白苞叶乃至同类农废物资源的高值化利用提供方法和途径。


技术实现要素：

4.本发明的第一个目的是提供一种茭白苞叶总黄酮(tfzb)的提取工艺，通过单因素试验和响应面法筛选出茭白苞叶总黄酮(tfzb)纤维素酶协同超声波辅助醇提取的最佳参数，为同类农废物的功能成分提取提供参考。
5.本发明的第二个目的是提供上述提取方法提取的茭白苞叶总黄酮(tfzb)的用途，其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有较好的抑制作用，极具应用前景。
6.本发明的第三个目的是提供上述提取方法提供的tfzb制备的冷鲜猪肉保鲜剂。
7.根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种茭白苞叶总黄酮(tfzb)的提取工艺，为了达到上述技术目的，具体的技术方案是：
8.一种茭白苞叶总黄酮的提取方法，其包括以下步骤：
9.(1)将收集到的新鲜茭白苞叶洗净后干燥至恒重，粉碎后过筛，将一定量的茭白苞叶粉末浸泡在磷酸氢二钠-柠檬酸水的缓冲液中，然后加入纤维素酶进行酶解。
10.(2)步骤(1)中加酶后，酶解40min～90min；
11.(3)经酶解后，水浴高温灭酶，再加入一定量的无水乙醇和去离子水，进行超声辅助提取；
12.(4)将步骤(3)中的样品超声提取20min～70min。
13.优选地，步骤(1)所述粉碎后过筛的目数为40目；所述磷酸氢二钠-柠檬酸水的缓冲液的ph＝5，固液比为1g/40ml；纤维素酶的加入量为0.30％～0.80％(质量体积比)，进一步优选为0.70％(质量体积比)。
14.纤维素酶的添加量对茭白苞叶总黄酮提取率影响较大。在一定的酶解时间内，随着酶添加量的增加，酶解速率加快，纤维素酶能与更多的底物反应，使黄酮类物质充分暴露，有利于后续的醇提和超声波提取，而过多的酶具有粘附性能，会阻塞黄酮的溶出通道，且酶量的增加还会引起酶之间的竞争乃至抑制。为此，本发明中纤维素酶添加量为0.30％～0.80％，优选0.70％(质量体积比)。
15.优选地，步骤(2)在37℃下酶解60min。随着酶解时间的延长，酶与底物可充分反应，茭白苞叶细胞壁结构在纤维素酶作用下降解，使得黄酮类化合物更容易溶解、扩散到乙醇溶液中，而如果酶解时间过长，部分黄酮类化合物又会因长时间受热被氧化。因此，本发明的酶解时间为40min～90min，优选酶解时间60min。
16.优选地，步骤(3)经酶解后，90℃水浴灭酶10min，再加入一定量的无水乙醇和去离子水调整系统的乙醇终浓度至60v％，最后在55℃、超声功率为300w～800w的条件下进行提取。
17.超声功率较低时，超声波产生的空化效应小，从而降低了黄酮类化合物的溶出，随着超声功率的增大，提取液各分子动能增加，超声波的空化效应得到加强，使得黄酮溶出速度加快，而超声功率过高，分子运动过于剧烈，加强了黄酮分子和其他成分之间的反应而使黄酮遭到破坏，所以又使得提取率降低。因此，本发明中超声功率确定为300w～800w，优选超声功率为704w。
18.优选地，步骤(4)中超声提取时间47min。随着超声提取时间的延长，茭白苞叶中黄酮类物质逐渐积累增多，但是过长时间的加热提取同样会使一些黄酮类物质遭到破坏。因此，本发明中确定超声提取时间为20min～70min，
19.本发明比较了醇提法(即无酶无超声处理)、纤维素酶辅助醇提法(纤维素酶添加量为0.70％，酶解60min，无超声处理)、超声波辅助醇提法(无酶处理、704w超声处理47min)以及纤维素酶协同超声波辅助醇提法(纤维素酶添加量为0.70％，酶解60min，704w超声处理47min)四种方法下的tfzb提取率及黄酮含量。优选纤维素酶协同超声波辅助醇提法，tfzb提取率及提取物黄酮含量分别为(1.92
±
0.02)％和(150
±
1.25)mg/g。(图1)
20.根据本发明的第二个方面，本发明提供了一种茭白苞叶总黄酮的的用途，其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有较好的抑制作用，具体的技术方案是：
21.(1)采用上述方法提取茭白苞叶总黄酮tfzb，浓缩后冷冻干燥得tfzb粉末，称取一定量的tfzb粉末，加入少量60％乙醇溶液助溶后，再将其配置成不同浓度的tfzb溶液，以大肠杆菌(e.coli atcc 25922)和金黄色葡萄球菌(s.aureus atcc 25923)为测试菌株，测定其对e.coli的mic为2.5mg/ml，对s.aureus的mic为1.25mg/ml。
22.根据本发明的第三个方面，本发明提供上述提取方法提供的tfzb制备的冷鲜猪肉保鲜剂。
23.具体的技术方案为：
24.将新鲜的猪前腿肉去皮，然后将其均匀分割成重量为35g
±
5g的小块，共240个样
本，通过向猪肉样本上喷洒不同的处理液(无菌水、5.0mg/ml的苯甲酸钠溶液、0.5mg/ml的茭白苞叶黄酮溶液、1.0mg/ml的茭白苞叶黄酮溶液)，
25.每种处理液喷洒12个样本(每100平方厘米大约喷洒1ml的液体)，4个储藏时间，3个平行。经上述处理过的猪肉，用食品级塑料保鲜膜(gb/t 10457-2021)密封，于4℃
±
0.5℃冰箱中贮藏，分别在贮藏的第0、3、6、9天取样进行感官评分、ph值、tvb-n含量、metmb％含量、菌落总数的测定。
26.优选的，所述冷鲜猪肉保鲜剂为1.0mg/ml的茭白苞叶黄酮溶液。
27.与现有技术相比，本发明有益效果在于：
28.①
通过纤维素酶协同超声波法辅助醇提取茭白苞叶总黄酮，显著提高了农废物茭白苞叶总黄酮的提取率。
29.②
本发明提供的茭白苞叶总黄酮对大肠杆菌的mic为2.5mg/ml，对金黄色葡萄球菌的mic为1.25mg/ml，可作为环境消杀品使用。
30.③
本发明提供的茭白苞叶总黄酮经配制成溶液后可作为冷鲜猪肉保鲜剂，尤其是当浓度为1.0mg/ml时，其保鲜效果优于5.0mg/ml的苯甲酸钠溶液。
附图说明
31.图1为不同提取方法茭白苞叶总黄酮提取率和黄酮含量图，其中各体系分别为1：醇提法；2：纤维素酶辅助醇提取法；3：超声波辅助醇提取法；4：纤维素酶协同超声波辅助醇提取法对应结果；
32.图2为茭白苞叶提取残渣的电镜观察，其中(a)：醇提法；(b)：纤维素酶辅助醇提取法；(c)：超声波辅助醇提取法；(d)：纤维素酶协同超声波辅助醇提取法对应结果；
33.图3纤维素酶添加量对茭白苞叶总黄酮提取率的影响图；
34.图4酶解时间对茭白苞叶总黄酮提取率的影响图；
35.图5超声功率对茭白苞叶总黄酮提取率的影响图；
36.图6超声时间对茭白苞叶总黄酮提取率的影响图；
37.图7响应面等高线图；
38.图8不同处理组冷鲜猪肉贮藏过程中ph值变化图；
39.图9不同处理组冷鲜猪肉贮藏过程中感官评分变化图；
40.图10不同处理组冷鲜猪肉贮藏过程中tvb-n值变化图；
41.图11不同处理组冷鲜猪肉贮藏过程中metmb％值变化图；
42.图12不同处理组冷鲜猪肉贮藏过程中菌落总数变化图。
43.其中图3～图6中在各平均数间，凡有一个标记相同字母的即为差异不显著(p》0.05)，凡具不同标记字母的即为差异显著(p《0.05)。图8～图12中a、b、c、d表示在相同的储藏时间内，凡有一个标记相同字母的即为差异不显著(p》0.05)，凡具不同标记字母的即为差异显著(p《0.05)。a、b、c、d表示同一个处理中，凡有一个标记相同字母的即为差异不显著(p》0.05)，凡具不同标记字母的即为差异显著(p《0.05)。
具体实施方式
44.茭白苞叶于2021年5-6月在中国江苏常熟东南开发区周边的菜市场、农田道旁收
集，冷鲜猪肉由大唐农业发展有限公司提供，分析纯芦丁标准品购于上海源叶生物科技有限公司，其他化学纯化学药品及纤维素酶均购于上海生工生物工程股份有限公司，试验用菌种保存于中国江苏常熟理工学院生物与食品工程学院微生物学实验室。所有实验均为三平行，数据表达为均值
±
sd，数据的统计分析采用t-检验或anova分析，p《0.05认为存在统计学差异。
45.实施例1茭白苞叶总黄酮的提取工艺(醇提法)
46.将收集到的新鲜茭白苞叶洗净后干燥至恒重，粉碎后过40目筛，将一定量的茭白苞叶粉末浸泡在磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(ph＝5，固液比1g/40ml)中，再加入一定量的无水乙醇和去离子水调整系统的乙醇终浓度至60％(体积比)，80℃提取60min后，冷却、浓缩、离心得总黄酮粗提液。取一定量的黄酮粗提液测定其中的总黄酮含量，计算求得总黄酮提取率为(0.35
±
0.01)％。黄酮粗提液经冷冻干燥后，称取1.0g，溶解后测定其中的黄酮含量，粗提物中总黄酮含量为(132
±
1.04)mg/g(图1)。
47.提取率计算公式为：
[0048][0049]
其中：c为茭白苞叶黄酮粗提液中总黄酮浓度(mg/ml)
[0050]
v为粗提液的体积(ml)
[0051]
m为茭白苞叶粉末质量(mg)
[0052]
总黄酮含量计算公式为：
[0053][0054]
其中：c为粗提物溶解液中总黄酮浓度(mg/ml)
[0055]
v为溶解液体积(ml)
[0056]
m为粗提物冻干粉质量(g)
[0057]
实施例2茭白苞叶总黄酮的提取工艺(酶辅助醇提取)
[0058]
将收集到的新鲜茭白苞叶洗净后干燥至恒重，粉碎后过40目筛，将一定量的茭白苞叶粉末浸泡在磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(ph＝5，固液比1g/40ml)中，然后加入0.4％(质量体积比)的纤维素酶，37℃酶解60min后，90℃水浴灭酶10min，再加入一定量的无水乙醇和去离子水调整系统的乙醇终浓度至60％(体积比)，最后在80℃提取60min后，冷却、浓缩、离心得总黄酮粗提液。取一定量的黄酮粗提液测定其中的总黄酮含量，计算求得总黄酮提取率为(0.49
±
0.01)％，粗提物中总黄酮含量为(133
±
1.21)mg/g(图1)。
[0059]
实施例3茭白苞叶总黄酮的提取工艺(超声辅助醇提取)
[0060]
将收集到的新鲜茭白苞叶洗净后干燥至恒重，粉碎后过40目筛，将一定量的茭白苞叶粉末浸泡在磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(ph＝5，固液比1g/40ml)中，再加入一定量的无水乙醇和去离子水调整系统的乙醇终浓度至60％，最后在55℃、超声功率为700w的条件下，超声处理50min后，冷却、浓缩、离心得总黄酮粗提液。取一定量的黄酮粗提液测定其中的总黄酮含量，计算求得总黄酮提取率为(1.32
±
0.02)％，粗提物中总黄酮含量为(142
±
1.25)mg/g(图1)。
[0061]
实施例4茭白苞叶总黄酮的提取工艺(酶协同超声辅助醇提取)
[0062]
将收集到的新鲜茭白苞叶洗净后干燥至恒重，粉碎后过40目筛，将一定量的茭白苞叶粉末浸泡在磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(ph＝5，固液比1g/40ml)中，然后加入0.7％的纤维素酶，37℃酶解60min后，90℃水浴灭酶10min，再加入一定量的无水乙醇和去离子水调整系统的乙醇终浓度至60％，最后在55℃、超声功率为700w的条件下，超声处理50min后，冷却、浓缩、离心得总黄酮粗提液。取一定量的黄酮粗提液测定其中的总黄酮含量，计算求得总黄酮提取率为(1.84
±
0.02)％，粗提物中总黄酮含量为(149
±
1.15)mg/g(图1)。
[0063]
以实施例4为基础，单因素实验法研究了纤维素酶用量、酶解时间、超声功率及时间对茭白苞叶提取率的影响分别见图3～6。
[0064]
实施例1-4中四种方法提取后的苞叶残渣经60℃烘干至恒重，用镊子取适量残渣于解离后的云母片上，喷金镀膜后在扫描电镜下观察发现，采用醇提法提取tfzb时，苞叶细胞骨架相对完好，乙醇对骨架纤维结构的破坏较小(图2a)；引入酶解和超声波技术后，茭白苞叶细胞骨架遭到破坏，一些纤维结构断裂，细胞骨架上出现大小不一的孔径(图2b,2c)；在醇提基础上将酶解和超声波技术联用时，苞叶细胞骨架被严重破坏，骨架上出现均匀的较大的孔径，导致了固相和液相接触面积的增大，且溶剂的穿透力也增大，细胞内的黄酮等成分溶出彻底，使得溶出量增加。优选纤维素酶协同超声波辅助醇提法。(图2d)
[0065]
实施例5茭白苞叶总黄酮的提取工艺(响应面优化酶协同超声)
[0066]
在实施例4的基础上，采用design-expert v8.0.6.1软件中的box-behnken方法设计试验。选取纤维素酶用量(x1)、酶解时间(x2)、超声功率(x3)和超声时间(x4)4个变量为自变量，以茭白苞叶黄酮提取率为响应值，每一个自变量的低、中、高试验水平分别为-1、0、1进行编码，根据box-behnken方法设计的试验组合进行试验，编码及结果见表1，方差分析结果见表2。通过design-expert v8.0.6.1软件分析，获得茭白苞叶黄酮提取率对编码自变量的二次多项回归方程。
[0067]
y＝1.92 0.027x
1-0.037x2 0.014x
3-0.10x4 7.5
×
10-3
x1x
2-2.5
×
10-3
x1x3 0.035x1x
4-0.055x2x
3-0.085x2x
4-0.040x3x
4-0.28x
12-0.41x
22-0.36x
32-0.18x
42
[0068]
由表2和图7等高线图可知，模型的p《0.0001，说明模型变量与4个自变量之间的线性关系极显著，即此方法是可靠的。失拟项p＝0.2046》0.05，不显著，说明该方程的拟合情况良好，可以用其进行茭白苞叶黄酮提取率的预测和分析。r2＝0.9755，说明只有2.45％的试验不能用次方程确定，在试验中没有其他显著因素的影响，条件是合适的。对模型y＝f(x1,x2,x3,x4)进行方差分析，一次项x4，二次项x
12
、x
22
、x
32
、x
42
对试验响应值有极显著的影响，一次项x2和交互项x2x4(图7d)对响应值有显著的影响，其余项不显著，即超声时间和酶解时间及两者交互作用对茭白苞叶提取率影响较大。
[0069]
表1 box-behnken方法设计的试验组合与结果
[0070][0071]
表2响应面模型方差分析
[0072]
[0073][0074]
通过回归方程优化，给出的茭白苞叶黄酮提取的最佳工艺条件为纤维素酶添加量0.703％，酶解时间59.820min，超声功率703.700w，超声时间47.139min，考虑到实际操作可行性，将最佳提取条件修正为纤维素酶添加量0.7％，酶解时间60min，超声功率704w，超声时间47min，在该条件下，进行3次重复验证实验，测得黄酮提取率的平均值为(1.922
±
0.024)％，粗提物中总黄酮含量为(150
±
1.25)mg/g(图1)。
[0075]
实施例6茭白苞叶总黄酮的抑菌性
[0076]
称取2.0g实施例5修正后的最佳提取条件提取的茭白苞叶黄酮粉末，用少量60v％乙醇助溶后，再加蒸馏水使其终浓度为20mg/ml。向无菌的96孔板的第2-10孔中分别加入100ul的无菌牛肉膏蛋白胨液体培养基，在孔1和孔2中加入100ul配置好的20mg/ml的茭白苞叶总黄酮溶液，混匀孔2，从中吸取100ul加入到孔3，混匀孔3，再从中吸取100ul加入到孔4，依次2倍稀释下去，直至加到孔10，混匀后从中吸出100ul弃去，再向1-10孔内加入100ul菌液(处于对数生长期的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌液)，这样96孔板1-10孔中tfzb终浓度依次为10000、5000、2500
……
39.0625、19.53125ug/ml，每个处理重复3次，然后将其立即置于酶标仪中测定每孔od
600
值并记录好数据，再将96孔板置于37℃恒温恒湿培养箱中培养24h，再次测定此细胞板各孔od
600
值，记录数据后计算各孔培养前后od
600
差值，即δod
600
，能使培养前后0≤od
600
≤0.05的tfzb溶液最低浓度即可判定为最低抑制浓度(mic)。
[0077]
以革兰氏阴性菌大肠杆菌(atcc 25922)和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(atcc 25923)为试验菌株，茭白苞叶黄酮在不同质量浓度下的δod
600
分别见下表3。
[0078]
表3茭白苞叶黄酮不同质量浓度下大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌悬液的δod
600
[0079][0080]
由表3中的数据可知，当茭白苞叶黄酮质量浓度为2.5mg/ml时，大肠杆菌菌悬液的δod
600
为0.048《0.05，当茭白苞叶黄酮质量浓度为1.25mg/ml时，金黄色葡萄球菌的δod
600
为0.040《0.05，由此可知，茭白苞叶黄酮对大肠杆菌的mic为2.5mg/ml，对金黄色葡萄球菌的mic为1.25mg/ml。
[0081]
实施例7冷鲜猪肉保鲜剂的制备
[0082]
称取茭白苞叶总黄酮粉末，用少量的60v％乙醇水溶液助溶后，再用蒸馏水将其配置成0.5mg/ml和1mg/ml两个浓度，即得到两种不同浓度的茭白苞叶总黄酮喷洒液。
[0083]
将新鲜的猪前腿肉去皮，然后将其均匀分割成重量为35g
±
5g的小块，共240个样本，通过向猪肉样本上喷洒不同的处理液(无菌水、5.0mg/ml的苯甲酸钠溶液、0.5mg/ml的茭白苞叶总黄酮溶液、1.0mg/ml的茭白苞叶总黄酮溶液)，
[0084]
每种处理液喷洒12个样本(每100平方厘米大约喷洒1ml的液体)，4个储藏时间，3个平行。经上述处理过的猪肉，用食品级塑料保鲜膜(gb/t 10457-2021)密封，于4℃
±
0.5℃冰箱中贮藏，分别在贮藏的第0、3、6、9天取样进行感官评分、ph值、挥发性盐基态氮(tvb-n)含量、高铁肌红蛋白百分(metmb％)含量、菌落总数的测定，结果发现，按保鲜效果排序：1.0mg/ml的茭白苞叶黄酮溶液》5.0mg/ml的苯甲酸钠溶液》0.5mg/ml的茭白苞叶黄酮溶液》无菌水。
[0085]
上述实施例为本发明优选地实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。