新冠病毒RBD特异性单克隆抗体和应用的制作方法

新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用
技术领域
1.本发明属于单克隆抗体技术领域，尤其涉及新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用。


背景技术：

2.抗体是由四条多肽链组成的免疫球蛋白分子，四条多肽链包括两条重链(h链)和两条轻链(l 链)。h链由重链可变区(vh)和重链恒定区组成，重链恒定区由三个区ch1、ch2和ch3组成。l 链由l链可变区(vl)和轻链恒定区组成，轻链恒定区由cl区组成。vh和vl可进一步分成称为互补决定区(cdrs)的高变区和称为构架区(fr)交替分布的保守区。
3.目前研究发现：新冠病毒(sars-cov-2)具有四种主要的结构蛋白，分别为刺突蛋白(s蛋白)、核衣壳蛋白(n蛋白)、膜蛋白(m蛋白)和包膜蛋白(e蛋白)，其中s蛋白有两个亚基：s1和 s2，受体结合位点(rbd)位于s1亚基上，其主要功能是识别宿主细胞表面受体，介导与宿主细胞的融合。
4.近期治愈出院的患者血浆中含有高浓度特异性的抗原中和抗体，输入患者体内后，可以中和新冠病原体，介导有效的免疫反应，因此利用恢复期血浆有望为救治感染新冠病毒的患者提供有效的治疗手段，降低死亡率，保障患者生命安全。
5.申请公开号为cn111303280a的中国发明专利申请公开了一种高中和活性抗sars-cov-2全人源单克隆抗体，上述专利提供的是识别区域为s1非rbd区的全人源单克隆抗体，但是由于新冠病毒入侵宿主细胞是通过rbd与宿主细胞的ace2结合，所以上述专利获得的全人源单克隆抗体对病毒的阻断效果有限，并且上述专利是通过标记浆细胞而获得抗体cdna，但是与浆细胞相比，是记忆 b细胞活化后迅速做出反应，所以记忆b细胞能够引发比初次反应更快，也更强烈的体液免疫反应，而浆细胞所引发的体液免疫反应有限。


技术实现要素：

6.为了达到上述目的，本发明提供了新冠病毒rbd特异性单克隆抗体，具体的，抗体的重链氨基酸序列如seq id no:21所示；轻链氨基酸序列可如seq id no:22所示(单抗11-cqts076)。重链氨基酸序列还可如seq id no:23所示；轻链氨基酸序列还可如seq id no:24所示(单抗 12-cqts077)。重链氨基酸序列还可如seq id no:25所示；轻链氨基酸序列还可如seq id no:26 所示(单抗13-cqts078)。重链氨基酸序列还可如seq id no:27所示；轻链氨基酸序列还可如seqid no:28所示(单抗14-cqts079)。重链氨基酸序列还可如seq id no:29所示；轻链氨基酸序列还可如seq id no:30所示(单抗15-cqts080)。重链氨基酸序列还可如seq id no:31所示；轻链氨基酸序列还可如seq id no:32所示(单抗16-cqts081)。重链氨基酸序列还可如seq id no:33 所示；轻链氨基酸序列还可如seq id no:34所示(单抗17-cqts082)。重链氨基酸序列还可如seqid no:35所示；轻链氨基酸序列还可如seq id no:36所示(单抗18-cqts083)。重链氨基酸序列还可如seq id no:37所示；轻链氨基酸序列还可如seq id no:38所示(单抗19-cqts086)。重链氨基酸序列还可如seq id no:39所示；
cov-2试剂或药物中的应用。
22.在实际生产时，可以采用本实施例得到新冠病毒rbd特异性单克隆抗体制备核酸分子，或者制备包含该核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系，或者制备药物组合物，该药物组合物包括上述新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
23.在应用时，本实施例得到新冠病毒rbd特异性单克隆抗体制备的相关产品，可具有如下(b1)
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(b4)中的任一种的用途：(b1)结合新型冠状病毒sars-cov-2；(b2)检测结合新型冠状病毒 sars-cov-2；(b3)结合新型冠状病毒sars-cov-2的s蛋白；(b4)检测新型冠状病毒sars-cov-2 的s蛋白。
24.实施例2-10
25.实施例2-10与实施例1的区别在于：新冠病毒rbd特异性单克隆抗体的氨基酸序列不同，实施例2-10的氨基酸序列如下表所示：
[0026][0027][0028]
以上实施例1-10所提供的新冠病毒rbd特异性单克隆抗体均通过以下方法得到：首先从新冠肺炎康复患者的外周血中分选得到单个rbd特异性记忆b细胞，然后获得rbd特异性记忆b细胞的 mrna，再通过rt-pcr和巢式pcr构建抗体可变区基因表达盒，再将抗体可变区基因表达盒转导入293t细胞表达抗体并收集上清，用elisa法检测上清的rbd特异性，筛选得到新冠病毒rbd特异性单克隆抗体。
[0029]
具体包括以下步骤：
[0030]
s1、采集若干名新冠肺炎康复患者外周血，分离得到pbmc，在-80℃的冰箱中冻存备用。
[0031]
s2、首先采用去死细胞染料(dead dye)去除s1得到的pbmc的死细胞，然后采用cd19、mig-g、 mig-d和s-rbd对pbmc中活的rbd特异性并且结合能力高的记忆b细胞染色标记，筛选出针对rbd特异性记忆b细胞；使用流式细胞分选仪将特异性记忆b细胞分选到96孔
magnet磁板上，用排枪吸弃上清；
[0045]
⑦
wash a清洗：按照8μl/孔加入washing buffer a，来回走板7-8次，使微球充分洗涤，弃上清；
[0046]
⑧
wash b清洗：按照8μl/孔加入washing buffer b，来回走板7-8次，使微球充分洗涤，弃上清，随后按照10μl/孔加入预先配制的逆转录(rt)反应液。试剂配制及反应条件如下述(2)描述。
[0047]
(2)逆转录(rt)(10μl体系)
[0048]
所需配制的试剂如下表1所示：
[0049][0050][0051]
反应条件：42℃for 60min(每20min混合一次)；
[0052]
反应结束后，600
×
g瞬时离心96孔板，然后将96孔板放置于dynamag
tm-96side magnet磁板上，用排枪吸弃上清，随后按照10μl/孔加入预先配制的tdt反应液，试剂配制及反应条件如下述(3)描述。
[0053]
(3)加g尾(tdt)(10μl体系)
[0054]
所需配制的试剂如下表2所示：
[0055]
试剂名称体积h2o6.4μl5
×
tdt buffer2.0μl10mm dgtp0.5μl0.1％bsa1.0μlsamplebeadstdt0.1μl总体积10μl
[0056]
反应条件：37℃for 40min(每20min混合一次)。
[0057]
反应结束，600
×
g瞬时离心96孔板，然后将其放置于dynamag
tm-96side magnet磁板上，用排枪吸弃上清，随后按照10μl/孔加入预先配制的第一轮pcr(1st pcr)反应液，试剂配制及反应条件如下述(4)描述。
[0058]
(4)1st pcr(10μl体系)(引物序列参见引物序列表)
pcr扩增体系如下表5所示：
[0070][0071]
pcr扩增条件为：
①
95℃预变性3min；
②
95℃变性15sec，56℃退火15sec，72℃延伸1min，30cycles；
③
72℃循环外延伸5min，12℃保存。
[0072]
(7)cmv、wpre-γ/κ/l片段扩增及cmv、bcr-vγ/κ/l、wpre-γ/κ/l重叠pcr(overlap pcr) 预连接
[0073]
实验体系如下表6所示：
[0074][0075]
pcr扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性15sec，50℃退火15sec，72℃延伸1.5min，10cycles； 72℃循环外延伸5min，12℃保存。
[0076]
(8)bcr-γorf、bcr-κorf、bcr-l pcr扩增
[0077]
实验体系如下表7所示：
[0078][0079]
[0080]
pcr扩增程序：95℃预变性3min；95℃变性15sec，58℃退火15sec，72℃延伸1.5min，30cycles； 72℃循环外延伸5min，12℃保存。
[0081]
扩增后，采用琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析得到的抗体可变区基因大小是否正确，实验结果如图4所示，marker在中间位置，条带在5000bp处。
[0082]
bcr-γorf和bcr-κ/orf乙醇沉淀：bcr-γorf和bcr-κorf的pcr产物各取30μl置于8 连管中，再加入120μl无水乙醇，6μl醋酸钠溶液，充分混匀，-80℃静置30min；10000rpm，离心20min，弃上清，依次用200μl的70％乙醇和无水乙醇各漂洗一次，于56℃乙醇充分挥发，加入40μl无菌水，振荡，使沉淀充分溶解，检测抗体可变区基因的浓度。
[0083]
s3和s4所用到的leader引物参见如下的引物序列表一：
[0084]
[0085]
[0086][0087]
s3和s4所用到的所用到j-region引物参见如下的引物序列表二：
[0088]
primeridsequenceighj_01gatgggcccttggtggagggtgaggagacggtgaccagggtgccctggccccagtighj_02gatgggcccttggtggagggtgaggagacagtgaccagggtgccacggccccagaighj_03gatgggcccttggtggagggtgaagagacggtgaccattgtcccttggccccagaighj_04gatgggcccttggtggagggtgaggagacggtgaccgtggtcccttgcccccagaigkj_01gatggtgcagccacagttcgtttgatttccaccttggtcccttggccgaacgtccigkj_02gatggtgcagccacagttcgtttgatttccaccttggtcccttggccgaacgtccigkj_03gatggtgcagccacagttcgtttgatatccactttggtcccagggccgaaagtgaigkj_04gatggtgcagccacagttcgtttgatctccaccttggtccctccgccgaaagtgaigkj_05gatggtgcagccacagttcgtttaatctccagtcgtgtcccttggccgaaggtgaiglj_01ggggcagccttgggctgacctaggacggtgaccttggtcccagttccgaagacatiglj_02ggggcagccttgggctgacctaggacggtcagcttggtccctccgccgaataccaiglj_03ggggcagccttgggctgacctaaaatgatcagctgggttcctccaccaaatacaaiglj_04ggggcagccttgggctgacctaggacggtcagctcggtcccctcaccaaacaccciglj_05ggggcagccttgggctgacctaggacggtcagctccgtcccctcaccaaacaccciglj_06ggggcagccttgggctgaccgaggacggtcaccttggtgccactgccgaacacatiglj_07ggggcagccttgggctgaccgaggacggtcagctgggtgcctcctccgaacacagiglj_08ggggcagccttgggctgaccgagggcggtcagctgggtgcctcctccgaacacag
[0089]
s5、将s4得到的抗体可变区基因表达盒转导入293t细胞48小时内表达抗体并收集上清，用elisa法检测上清的rbd特异性，筛选rbd特异性全人源单克隆抗体。
[0090]
(a)使用pbs稀释抗原(终浓度2μg/ml)，10μl/孔，包被384孔elisa板4℃过夜或37℃包被2h(本实施例优选4℃过夜)。note：加完后瞬时离心保证液体在底部。
[0091]
实验体系如下表8所示：
[0092][0093][0094]
(b)配制pbst(0.05％tween 20，cat#tb220)：1l的pbs加入0.5ml的tween 20；
[0095]
pbst机洗板子(thermoscientific wellwash versa)或者手洗(机洗完的板子依然要手动拍板/使用微孔板离心机(mpc-p25)离心1min，使板子看不见有水和气泡)。
[0096]
封闭：80μl的5％bsa(biofroxx，cat.no:4240gr100)(pbst配制)加入上述洗好的板子里，放置于37℃的孵育箱孵育1h。pbst机洗板子或者手洗。
[0097]
(c)加样及标准品。其中，标准品：10μl/well原浓度1μg/ml，梯度稀释为250ng/ml、125ng/ml、 62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.63ng/ml、7.81ng/ml、3.9ng/ml和1.95ng/ml。(封闭液稀释)；样品：转染抗体基因的细胞上清液。阴性对照/空白孔：封闭液10μl/well。
[0098]
在37℃孵育30min。pbst机洗板子或者手洗。
[0099]
(d)加二抗，加入的浓度为10μl/well，然后在37℃下孵育30min。
[0100]
实验体系如下表9所示：
[0101]
二抗名称货号原浓度终浓度稀释比goat-anti-human igg-alpa188081.5mg/ml0.3μg/ml1:5000goat pab to hu igg-alpab985320.5mg/ml0.25μg/ml1:2000
[0102]
pbst机洗板子或者手洗。10μl/well的pnpp(对硝基苯磷酸二钠)，使用(thermoscientific muttiskango)检测5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min和 60min的od(450mm)值。50mg的pnpp粉末(thermo，prod#34045) 40ml的ddh2o 10ml的 diethanol aminesubstrate buffer(5x)，pnpp避光4℃储存。
[0103]
实验结果如图5所示，od值大于0.1为阳性。
[0104]
以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。