一种三角褐指藻Myb类转录因子PtMYB3基因及其编码蛋白和应用

一种三角褐指藻myb类转录因子ptmyb3基因及其编码蛋白和应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程领域，尤其是涉及一种三角褐指藻myb类转录因子ptmyb3基因及其编码蛋白和应用。


背景技术：

2.海洋硅藻在全球碳循环中发挥着重要作用。它们可以占据40%的海洋的初级生产力。此外，硅藻中还有很多有价值的物质，比如岩藻黄素。岩藻黄素是一种在硅藻中发现的海洋胡萝卜素，可形成光捕获与叶绿素复合，可捕获、转移和转换光能以进
行
光合作用。作为这种捕光复合物的重要组成部分，岩藻黄素有助于深海海底生活的硅藻捕获足够的蓝光和绿光以维持生存。除了它的光捕获的功能，岩藻黄素已被证明具有一系列其它生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗肥胖、抗糖尿病和抗癌活性。因此，岩藻黄素具有广阔的应用前景。
3.岩藻黄质的合成始于甘油醛3-磷酸(g3p)，通过1-脱氧-d-木黄糖5-磷酸合酶(dxs)、植物烯合酶(psy)、植物烯去饱和酶(pds)、ζ-胡萝卜素去饱和酶(zds)和类胡萝卜素异构酶(crtiso)产生番茄红素。番茄红素在番茄红素β-环化酶(lcyb)的催化下转化为β-胡萝卜素，在β-胡萝卜素羟化酶(bch)或其他同工酶的作用下最终转化为β-隐黄质和玉米黄质。在玉米黄质环氧化酶(zep)的催化下，玉米黄质转化为蒽黄质，然后转化为紫黄质。在紫外黄嘌呤脱氧酶(vde)的存在下，这些转化在强光下是可逆的。最后，紫黄质通过一系列未知的酶促反应生成岩藻黄质。
4.myb类转录因子是一类在微藻中普遍存在且起重要作用的转录因子，比如佐夫色绿藻中czmyb1通过和三酰甘油合成关键酶基因启动子结合调控三酰甘油合成酶基因的表达来介导三酰甘油的合成；三角褐指藻中，myb类转录因子ptpsr受磷胁迫的诱导，其能够与磷代谢相关基因启动子结合，从而调控微藻对磷胁迫的适应。但是，myb类转录因子在微藻岩藻黄素合成过程中的作用还未有报道。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是提供一种可显著提高三角褐指藻岩藻黄素含量的myb类转录因子ptmyb3、编码蛋白及其克隆方法及其过表达重组藻构建方法和应用。
6.本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：1、一种三角褐指藻myb类转录因子ptmyb3基因，该基因核苷酸序列如seq id no：1所示。
7.2、一种三角褐指藻myb类转录因子ptmyb3编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如seq id no：2所示。
8.3、上述三角褐指藻myb类转录因子ptmyb3基因的克隆方法，其特征在于包括如下步骤：（1）提取三角褐指藻总rna并反转录成cdna作为模板；
（2）根据ptmyb3的基因序列设计引物：上游引物序列：5
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atgccttggaccgccgacgaag-3’，下游引物序列：5
’‑ꢀ
tcatgccaggtacttttcaatt-3’;(3) pcr扩增：通过pcr扩增得到ptmyb3基因扩增产物。
9.4、上述三角褐指藻myb类转录因子ptmyb3过表达重组藻构建方法，包括如下步骤：（1）根据ptmyb3的基因序列和ppha-t1载体信息设计引物：上游引物序列：5
’‑
cggggatcctctagagtcgacatgccttggaccgccgacgaag-3’，下游引物序列：5
’‑ꢀ
gatagcacgcttctgaagctttcatgccaggtacttttcaatt-3’，引物两端分别包括载体的序列作为同源臂（划线处）；（2）pcr扩增：通过pcr扩增得到ptmyb3基因载体构建扩增产物；（3）重组质粒的获得：通过同源重组方法，将ptmyb3基因构建进ppha-t1载体中得到重组质粒；（4）过表达ptmyb3重组藻的获得：将重组质粒通过电转化的方法转化进三角褐指藻中，并通过抗生素筛选和表达量检测方式筛选得到阳性过表达ptmyb3的重组藻。
10.优选的，步骤（2）pcr扩增的反应体系为：0.5μl cdna，10μl 2
×
primestar max premix，上、下游引物各0.5μl，8.5μl ddh2o；pcr扩增程序为：变性98℃ 10s，退火55℃ 15s，延伸，72℃ 1min，30个循环；pcr扩增产物用1wt%琼脂糖凝胶电泳纯化回收，得到ptmyb3同源重组产物。
11.优选的，步骤（3）具体为将ppha-t1双酶切产物与ptmyb3同源重组产物进行同源重组反应，反应体系为：2μl ppha-t1双酶切产物，2μl ptmyb3 pcr同源重组产物，2μl exnase ii，4μl 5
×
ce ii buffer，10μl ddh2o，37℃反应30min；将同源产物进行大肠杆菌转化，鉴定获得含有ppha-t1-ptmyb3阳性菌质粒。
12.优选的，步骤（4）具体将ppha-t1-ptmyb3质粒用scai进行质粒线性化处理，酶切体系为：26μl ppha-t1-ptmyb3，1μl scai，3μl 10
×
fastdigest buffer，37℃酶切3小时，酶切产物用胶回收试剂盒进行清洗回收；将密度为2
×
109cell/ml的100
µ
l重悬三角褐指藻细胞与4
µ
g线性化ppha-t1-ptmyb3质粒和40
µ
g鲑精dna，在冰上孵育至少10min后进行电穿孔，电穿孔后细胞立即转移到含有10ml f/2培养液的试管中，在低光强下孵育24h，再转移到正常光强下培养24h，然后3000g离心10min收集细胞并用0.6ml f/2培养液重悬细胞，经过博来霉素筛选得到初步阳性藻；再经表达量检测方式筛选得到阳性过表达pthsf1的重组藻。
13.5、上述三角褐指藻myb类转录因子ptmyb3在提高三角褐指藻中岩藻黄素含量方面的应用。
14.与现有技术相比，本发明的优点在于：1、首次证实了过表达三角褐指藻中myb类转录因子ptmyb3能够促进岩藻黄素的含量；2、过表达ptmyb3能够为工业化利用三角褐指藻产岩藻黄素提供新的藻种。
附图说明
15.图1为线性化ppha-t1-ptmyb3载体结构图，注：pthsf1的表达受fcpa启动子驱使，博来霉素抗性基因sh ble的表达受fcpb启动子驱使，载体在大肠杆菌中的筛选抗生素为氨苄青霉素（amp），载体线性化所用的酶为scai；
图2为过表达ptmyb3重组藻中抗生素基因sh ble鉴定，注：t1至t5为经过ptmyb3过表达重组藻的五个不同株系，vector表示转入ppha-t1载体的转基因三角褐指藻，wt为野生型藻株，五个过表达株系和空载体在sh ble片段大小位置均出现条带；图3 为ptmyb3过表达重组藻中ptmyb3基因表达情况分析，注：柱子上的星号表示统计分析上有显著差异（t检验，p《0.05），wt表示野生型三角褐指藻，vector表示转入ppha-t1载体的转基因三角褐指藻，1#至5#表示转入ppha-t1-ptmyb3载体的转基因三角褐指藻的不同株系，其中3#和5#较其他转基因藻株表达量更高；图4为过表达ptmyb3重组藻的生长曲线，注：wt表示野生型三角褐指藻，vector表示转入ppha-t1载体的转基因三角褐指藻，3#和5#表示转入ppha-t1-ptmyb3载体的转基因三角褐指藻的不同株系，共测量8天，纵坐标计数单位为cells/ml；图中线条最右侧从上往下依次为vector株，wt株、5#株和3#株；图5为过表达ptmyb3重组藻中岩藻黄素含量色谱图分析，注：岩藻黄素峰值位于14 min，峰面积表示含量。wt表示野生型三角褐指藻，3#和5#表示转入ppha-t1-ptmyb3载体的转基因三角褐指藻的不同株系；图6为过表达ptmyb3重组藻中岩藻黄素含量分析，注：柱子上的星号表示统计分析上有显著差异（t检验，p《0.05），wt表示野生型三角褐指藻，3#和5#表示转入ppha-t1
‑ꢀ
ptmyb3载体的转基因三角褐指藻的不同株系，3#和5#两个过表达株系的岩藻黄素含量均显著高于野生型藻株；图7为过表达ptmyb3重组藻中岩藻黄素合成相关基因表达，注：ptmyb3过表达重组藻中岩藻黄素合成相关基因表达分析：psy：hytoene synthase；zds：ζ-carotene desaturase；lycb：lycopene-β-cyclase；crtiso : carotenoid isomerase；柱子上的星号表示统计分析上有显著差异（t检验，p《0.05），wt表示野生型三角褐指藻，3#和5#表示转入ppha-t1
‑ꢀ
ptmyb3载体的转基因三角褐指藻的不同株系。
具体实施方式
16.以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
17.具体实施例一三角褐指藻热激转录因子ptmyb3基因克隆与序列分析1、提取对数期三角褐指藻（藻浓度为1
×
10
6 cells/ml）总rna并反转录成cdna作为模板。
18.2、根据genebank中ptmyb3的基因序列设计引物：上游引物序列：5
’‑ꢀ
atgccttggaccgccgacgaag
ꢀ‑3’
；下游引物序列：5
’‑ꢀ
tcatgccaggtacttttcaatt
ꢀ‑3’
。
19.3、pcr扩增：通过pcr扩增得到ptmyb3基因扩增产物，pcr扩增的反应体系为：0.5μl cdna，10μl 2
×
primestar max premix（pcr扩增试剂盒：2
×
primestar max premix购自宝成生物公司），上、下游引物各0.5μl，8 .5μl ddh2o；pcr 扩增程序为：变性98℃ 10s，退火55℃ 15s，延伸，72℃ 1min，30个循环。
20.4、将pcr扩增产物用1wt% 琼脂糖凝胶电泳纯化回收后与pmd19-t载体连接，经pcr进一步验证后测序，获得ptmyb3基因，其核苷酸序列如seqidno：1所示：atgccttggaccgccg
acgaagacgacctcatccgtcggcacgtacaaagacacggactcaagggctggaccttgctggctaaagaacgcatgccgggccgtcgaggaaaacagtgccgcgaacgatggatcaatcagttggatccggacattgatcggacgggctggaggttcccggaagatctctttctattgcaaggtctgacccgatggggtccgaaatgggctttgattgccaaacagttgcccggacgcccggaaaataacgccaagaatcgcttcaacgcatacctgcatcccaaaattgaaaagtacctggcatga。
21.三角褐指藻热激转录因子ptmyb3编码的蛋白质，其氨基酸序列如seqidno：2所示：mpwtadeddlirrhvqrhglkgwtllakermpgrrgkqcrerwinqldpdidrtgwrfpedlfllqgltrwgpkwaliakqlpgrpennaknrfnaylhpkiekyla。
[0022] 具体实施例二ptmyb3过表达重组藻获得1、根据ptmyb3的基因序列和ppha-t1载体信息设计引物：上游引物序列：5
’‑
cggggatcctctagagtcgacatgccttggaccgccgacgaag-3’，下游引物序列：5
’‑ꢀ
gatagcacgcttctgaagctttcatgccaggtacttttcaatt-3’，引物两端分别包括载体的序列作为同源臂（划线处）。
[0023]
2、pcr扩增：通过pcr扩增得到ptmyb3同源重组产物，pcr扩增的反应体系为：0.5μl cdna，10μl 2
×
primestar max premix（pcr扩增试剂盒：2
×
primestar max premix购自宝成生物公司），上、下游引物各0.5μl，8.5μl ddh2o；pcr扩增程序为：变性98℃ 10s，退火55℃ 15s，延伸，72℃ 1min，30个循环；pcr扩增产物用1wt%琼脂糖凝胶电泳纯化回收。
[0024]
3、载体构建：将ppha-t1用sali和hindiii进行双酶切，酶切体系为：25μl ppha-t1，1μl sali，1μl hindiii，3μl 10
×
fastdigest buffer（thermo scientific），37℃酶切3小时，酶切产物用胶回收试剂盒进行清洗回收。
[0025]
将ppha-t1双酶切产物与ptmyb3同源重组产物进行同源重组反应，反应体系为：2μl ppha-t1双酶切产物，2μl ptmyb3 pcr同源重组产物，2μl exnase ii，4μl 5
×
ce ii buffer，10μl ddh2o，37℃反应30min。将同源产物进行大肠杆菌转化，鉴定获得含有ppha-t1
ꢀ‑
ptmyb3阳性菌质粒。
[0026]
4、三角褐指藻转化：提取ppha-t1-ptmyb3质粒，并用scai进行质粒线性化处理（图1），酶切体系为：26μl ppha-t1-ptmyb3，1μl scai，3μl 10
×
fastdigest buffer（thermo scientific），37℃酶切3小时，酶切产物用胶回收试剂盒进行清洗回收。
[0027]
三角褐指藻生长到对数期密度为4
×
106ꢀ‑5×
10
6 cell/ml，在4℃下3000g离心10min收集总共2
×
108个细胞，用1ml 375mm的山梨醇（无菌冷冻）重悬藻细胞3次，最后重悬到100
µ
l 375mm的山梨醇中使藻的最终密度为2
×
109cell/ml，放在冰上待用。将100
µ
l重悬藻细胞与4
µ
g（0.2
µ
g/
µ
l）的线性化ppha-t1
ꢀ‑
ptmyb3质粒和40
µ
g（10
µ
g/
µ
l）鲑精dna（95℃以上的水浴煮沸1min变性），在冰上孵育至少10min，然后转移放入2mm电穿孔比色皿中，使用bio-rad的电穿孔仪进行电穿孔。将电穿孔系统调整为指数衰减，0.5kv场强，25μf电容和400欧姆并联电阻。电穿孔后细胞立即转移到含有10ml f/2培养液的15ml 试管中，在低光强（30μmol.m-2
.s-1
）下孵育24h，在转移到正常光强下培养24h，然后3000g离心10min收集细胞并用0.6ml f/2培养液重悬该细胞，平均涂布于3个含有75
µ
g/ml的博来霉素的固体培养基上，15-25d后出现藻落，可进行下一步处理。图2为过表达ptmyb3重组藻中抗生素基因sh ble鉴定，注：t1至t5为经过ptmyb3过表达重组藻的五个不同株系，vector表示转入ppha-t1载体的转基因三角褐指藻，wt为野生型藻株，由图2可知五个过表达株系和空载体在sh ble
片段大小位置均出现条带，说明转基因藻中抗生素基因sh ble已经成功表达，初步说明转基因成功。
[0028]
5、ptmyb3过表达阳性藻鉴定转基因藻细胞在含有50
µ
g/ml博来霉素的选择性液体f/2培养基中正常摇动培养（150r/min）作为预培养物以达到对数期。取50ml对数期藻液在4℃以4000
×
g离心5min并弃去上清液，得到的沉淀物在液氮中快速冷冻。在液氮中研磨成冷冻粉末，并使用rneasy plant mini kit（qiagen inc.，valencia，ca，usa）/total rna kit i/mirna isolation kit提取总rna。使用primescript
®ꢀ
rt reagent kit (perfect real time) (takara bio, otsu, japan)逆转录了500ng的rna成cdna。将cdna样品用te缓冲液稀释至80ng/
µ
l并储存于-20℃。使用2x sybr green i pcr master mix（applied biosystems, ca, usa ）在lightcycler 96 real-time pcr 系统（roche，basel，switzerland）上进行qrt-pcr。使用的正向引物和反向引物在（表1）中，热循环条件如下：95℃变性2min，40 cycles of 95℃ for 5 s，60℃ for 30 s；and 95℃ for 5s，65℃ for 5s，95℃ for 5s。每个qrt-pcr样品有三个重复，actin基因用于内参，基因表达分析采用2-δδct
的方法分析。
[0029]
表1 本专利中所用到的定量pcr引物由图3 ptmyb3过表达重组藻中ptmyb3基因表达情况可知，转入ppha-t1-ptmyb3载体的转基因三角褐指藻的不同株系较对照组要显著升高，其中3#和5#较其他转基因藻株表达量更高。
[0030]
图4为过表达ptmyb3重组藻的生长曲线，由图4可知，过表达ptmyb3藻株生长情况与对照组相似，说明ptmyb3不调控微藻的生长。
[0031]
具体实施例三ptmyb3过表达藻中岩藻黄素含量根据kwon等人的方法并加以修改。收集10ml在对数初期的转基因粗液体并用血球计数板记下每株转基因藻的密度，4℃下4000
×
g离心10min，弃去上清液。加入10ml乙醇充分混匀，并在24-30℃通过超声（新芝牌超声仪）1h提取岩藻黄素。过滤上清液（0.22
µ
m）用于hplc分析。全程在黑暗条件下进行。由g1312a二元泵、g1367b自动进样器、g1315d pda检测器和g1316a柱温箱组成的agilent 1200 hplc系统（agilent technologies，美国）用于岩
藻黄质定量。流动相，即甲醇和水，以0.7 ml min-1
的流速洗脱在35℃。ymc类胡萝卜素柱（250 mm长
×
4.6 mm内径；5μm 粒径；waters，美国）用于在以下梯度程序下进行分离：甲醇从90%增加到100%持续20分钟，保持在100%接下来的5分钟，降低到90% 5分钟，然后保持在90% 5分钟。注入样品溶液(10 μl)，并在445nm处记录色谱图。基于浓度范围为0.5
–
50μg ml-1
的校准曲线对岩藻黄质进行定量。
[0032]
图5和图6结果显示， 3#和5#两个ptmyb3过表达株系的岩藻黄素含量均显著高于野生型藻株。
[0033]
设计岩藻黄素合成相关基因的定量pcr引物（引物见表1），进行定量pcr检测基因表达，图7基因表达结果显示，ptmyb3过表达藻株中岩藻黄素合成相关基因的表达也显著高于对照组（psy：hytoene synthase；zds：ζ-carotene desaturase；lycb：lycopene-β-cyclase；crtiso : carotenoid isomerase）。这些结果表明ptmyb3过表达能够提高三角褐指藻中岩藻黄素的含量。
[0034]
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。