一株巴士链球菌及其在生物合成儿茶素衍生物中的应用的制作方法

1.本发明涉及一株巴士链球菌(streptococcus pasteurianus)，本发明还涉及该巴士链球菌在生物合成儿茶素衍生物中的应用以及一种儿茶素衍生物的生物合成方法，属于微生物领域。


背景技术：

2.儿茶素是从茶叶等天然植物中提取出来的一类酚类活性物质，具有多种药理活性，可用于抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、保护心脑血管疾病等方面。
3.目前研究表明儿茶素经口摄入后大部分到达小肠并被小肠上皮细胞初步吸收。小肠吸收的儿茶素进入血液后通过门静脉进入肝脏，在肝脏中被ⅱ相反应酶代谢成硫酸盐结合物和甲基衍生物。儿茶素及其ⅱ相衍生物能够参与到胆汁排泄中，通过肝胆循环可以在肠道和血液进行多次重吸收，一部分未在小肠吸收的儿茶素以及通过胆汁回到肠道中的儿茶素进入大肠，在大肠中发生降解。降解过程中儿茶素的c环被打开是其代谢的第一步，生成1-(3,4-二羟苯)-3-(2,4,6-三羟基苯基)-2-丙醇(3,4-dhpp-2-ol)，紧接着a环也发生裂解，然后经α-氧化以及β-氧化形成苯丙酸、苯乙酸以及苯甲酸类化合物，这一过程中还伴随着b环上c-3
′
和c-4
′
位上的去羟基化。这些经代谢形成的酚酸类物质分子量较小，极易被肠道吸收进入血液。据报道，3,4-二羟基苯丙酸可以通过降低ros的产生而发挥抗氧化作用；3,5-二羟基苯丙酸和3,4-二羟基苯丙酸的含量与高敏c反应蛋白升高呈现负相关趋势。而且有报道指出，苯丙酸可以通过调节过氧化物酶体增殖物激活受体(ppars)来改善糖脂代谢和炎症细胞活化。因此代谢产物很可能是其母体化合物在体内发挥多种生物活性的重要原因。
4.1964年，griffith等首次提出儿茶素的代谢可能与肠道微生物的作用相关，他们的研究发现在大鼠仅通过口服方式摄入儿茶素时，在尿液和粪便中可以检测到间羟基苯丙酸和间羟基马尿酸形成，腹腔摄入儿茶素或者大鼠经过饲喂抗生素处理其肠道微生物后再经口摄入儿茶素后，在粪便和尿液中均没检测到间羟基苯丙酸和间羟基马尿酸，后两种摄入方式排除了大肠肠道菌群的作用，因此griffith等认为儿茶素某些代谢产物的形成取决于肠道菌群的作用。虽然儿茶素的肠道微生物代谢过程已经清晰，但关于儿茶素代谢菌株的研究仍不充分。c环开环是儿茶素代谢的第一步，目前的研究中分离出的能打开黄烷-3-醇单体c环的菌株多来源于粪便，且除了一株为adlercreutzia equolifaciens 菌外其余几乎均为eggerthella lenta菌。盲肠为肠道微生物最为丰富的部位，并且盲肠是儿茶素通过微生物进行转化的主要场所，而猪与人的肠道微生物具有极高的同源性，因此，我们猜想从猪盲肠内容物中能筛选出代谢儿茶素的菌株。从猪盲肠进行儿茶素代谢菌株的分离，可以丰富儿茶素代谢菌株的理论基础，且利用筛选得到的菌株，能实现具有良好抗氧化活性的开环代谢产物的高效生产。


技术实现要素：

5.本发明一方面提供了一株巴士链球菌(streptococcuspasteurianus)f32-1菌株。
6.本发明另一方面提供上述巴士链球菌在生物合成儿茶素衍生物中的应用。
7.本发明还提供一种儿茶素衍生物的生物合成方法。
8.本发明采用了如下技术方案：
9.对猪盲肠内容物中的微生物进行分离，并利用分离得到的菌落与儿茶素共孵育，通过液相色谱图保留时间比对，筛选出具有代谢儿茶素能力的一株菌，用平板划线法对其进行纯化，得到能转化儿茶素的单一菌株，对其进行16srdna分子生物学鉴定，其序列与菌株streptococcuspasteurianus相似性最高，相似性高达99.65％，证实该分离菌株为streptococcuspasteurianus菌属，命名为巴士链球菌(streptococcuspasteurianus)f32-1，该菌株于2021年8月9日保存于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏号为cctccno：m2021999。保藏单位地址为中国武汉武汉大学
10.将上述巴士链球菌f32-1与儿茶素共培养，能将儿茶素转化为新的产物，经hplc-pda-ms和nmr1h和13c对其结构进行鉴定，该代谢产物为1-(3',4'-二羟基苯基)-3-(2”,4”,6
”‑
三羟苯基)-2-丙醇(3,4-dhpp-2-ol)，说明该菌能实现儿茶素代谢的第一步，即将儿茶素的c环打开，得到其开环代谢产物。
11.一种儿茶素衍生物的生物合成方法：向儿茶素中加入所述巴士链球菌f32-1并进行生物发酵，然后从发酵液中提取并纯化儿茶素c环开环产物。
12.优选地，所述提取是乙酸乙酯萃取。
13.优选地，通过p230p半制备液相色谱对儿茶素c环开环代谢产物进行纯化，所述半制备液相色谱的固定相为二异丁基硅氧烷键合硅胶，流动相a为0.1-0.2％(体积)甲酸水溶液，流动相b为乙腈，梯度洗脱，流速为1-5ml/min，进样量为0.5-3ml，紫外检测波长为250-300nm。
14.本发明得到的儿茶素衍生物具有良好的dpph、abts自由基清除能力及亚铁还原能力，可用于抗氧化领域。
15.本发明的优点在于：本发明首次从猪盲肠内容物中分离得到能打开儿茶素c环的巴士链球菌，且其转化性能稳定、转化效率高。本发明提供的生物合成方法能实现儿茶素的高效转化，得到纯度较高的儿茶素衍生物，其纯度可达96％以上，得率60％左右。本发明得到的儿茶素衍生物清除dpph、abts自由基的能力以及亚铁还原能力都高于底物儿茶素，具有高抗氧化活性。
附图说明
16.图1：猪盲肠微生物孵育液的液相色谱图。
17.图2：f32-1菌株pcr扩增电泳胶图。
18.图3：代谢产物分离纯化的半制备色谱图。
19.图4：代谢产物的质谱分析。
20.图5：代谢产物(3,4-dhpp-2-ol)的结构。
21.图6：代谢产物的核磁氢谱和碳谱。
具体实施方式
22.实施例1儿茶素代谢菌株的分离筛选
23.1.儿茶素代谢菌株的分离纯化
24.①
培养基的准备：按照脑心浸出液肉汤(bhi)的配方配制液体培养基，并加入l
‑ꢀ
半胱氨酸(0.25g/l)作为抗氧化剂维持厌氧，调节ph至7.2～7.4，高压灭菌(121℃，20min)后备用；按照脑心浸液琼脂的配方配制固体培养基，加入l-半胱氨酸(0.25g/l)，调节ph至7.2～7.4，高压灭菌(121℃，20min)，灭菌结束后取出放入超净工作台并加入四环素(10μg/ml)，趁热混匀后倒平板，用于菌株分离培养。
25.②
猪盲肠微生物的准备：成年猪经宰杀之后，将整个肠道取出，并将盲肠在厌氧操作台中解剖，取出其内容物，将其分装在离心管中，加入30％的甘油，于-80℃保存。筛选时室温解冻，依次稀释8个梯度(10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
、10-8
)，将10-8
稀释液涂布于bhi平板上，在37℃的条件下培养24h。
26.③
孵育：将儿茶素以0.5mm的浓度加入5ml的bhi的液体培养基中，然后从培养猪盲肠微生物的平板挑取单一菌落用于厌氧孵育，孵育24h，在孵育结束时对孵育液进行划线培养。
27.④
检测：孵育24h后对孵育液进行处理并通过高效液相色谱进行检测，取2ml孵育液，加入200μl 6m的盐酸，终止微生物的反应，再加入等体积的乙酸乙酯，离心(5000 g
×
10min)后取上清液进行氮吹除去有机溶剂，然后加入200μl的色谱甲醇复溶，用液相色谱检测其是否具有代谢儿茶素的功能。色谱柱采用thermo hypersil gold c18 (250
×
4.6mm,5μm)。液相a相为0.13％甲酸水溶液，b相为乙腈。柱温30℃，流速为0.5ml/min，进样量10μl。检测波长为280nm。洗脱梯度：0～5min，90％a；5～ 40min，90-40％a；40～40.5min，40-90％a；40.5～50min，90％a。
28.⑤
菌株筛选及纯化：根据液相结果，筛选出1个对底物儿茶素具有转化作用的单菌株，如图1a、b所示，儿茶素的出峰时间是16.880min，其代谢产物的出峰时间为20.107 min，将该菌株编号为f32-1，并对其采用平板划线的方法进行纯化，每次纯化后重新检测其代谢产物转化活性，共纯化四次，经过划线方法纯化的菌株都具有将儿茶素转化为 c环开环产物的能力，说明f31-1为单一菌株，并且其代谢儿茶素的能力稳定。
29.2.菌株鉴定
30.2.1细菌dna提取
31.①
取适量菌体于2ml离心管中，加入567μl的te缓冲液，反复吹打使之重悬。然后加入30μl的10％sds和15μl的蛋白酶k，混匀37℃温育1h。
32.②
加入100μl的5mol/l nacl溶液,充分混匀，再加入80μl ctab/nacl溶液，混匀后65℃温育10min。
33.③
加入等体积的氯仿:异戊醇溶液(体积比24:1)，然后12000r/min离心5min。将上清转入新管中，加入0.6～0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到dna沉淀下来，12000 r/min离心10min。
34.④
取沉淀加入1ml 70％乙醇洗涤，12000r/min离心10min，弃乙醇。
35.⑤
在洁净工作台中干燥，复溶于50μl的te缓冲液或者去离子水中。
36.2.2 16s rrna的序列分析
37.使用通用27f/1492r引物(引物1：5
′‑
agagtttgatcmtggctcag-3
′
；引物2：5
′‑
ggytaccttgttacgactt-3
′
)进行16srdna的pcr扩增。
38.①
pcr反应体系：
[0039][0040]
②
pcr扩增程序：
[0041][0042]
③
pcr产物电泳图
[0043]
检测前处理：2μl样品添加2μl 6
×
loading buffer，取适量样品进行检测。
[0044]
检测参数：胶浓度1％，电压120v，电泳时间20min。
[0045]
扩增电泳图见图2。左边四个条带依次为四次纯化菌株dna的pcr产物，右侧条带为maker。左边四条条带印记清晰，无拖尾现象，说明pcr产物的质量较高，与maker 比较后发现其片段长度在1000～2000bp。
[0046]
将pcr产物进行上机测序，结果显示四次纯化菌株的序列一致，进一步说明菌株 f32-1为单一菌株，其16s rdna扩增序列长度为1421bp，测序结果见seq id no：1。
[0047]
该序列匹配序列登录号为nr_043660.1。经blast比对，菌株f32-1的16s rdna 序列与菌株streptococcus pasteurianus相似性最高，相似性高达99.65％。根据kegg 数据库的检索，该菌株的种系为bacteria；firmicutes；bacilli；lactobacillales；streptococcaceae；streptococcus，最终将其分类命名为巴士链球菌(streptococcuspasteurianus)f32-1，并于2021年8月9日送交湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为cctcc no：m2021999。
[0048]
实施例2菌株s.pasteurianus f32-1在生物合成儿茶素衍生物中应用
[0049]
1.代谢产物的分离制备
[0050]
将发酵体积扩大为200ml，向其中添加0.1％的活化后菌液，并加入1mm(0.29 mg/ml)的儿茶素。发酵18～24h后利用6m的盐酸将培养液的ph调节到1～2，终止微生物的反应，再加入等体积的乙酸乙酯萃取两次，取上层清液利用旋转蒸发仪挥发乙酸乙酯(35℃)，从而将样品进行浓缩。c环开环代谢物的纯化通过elite p230p hplc-uv 半制备系统(elite analytical instruments co.ltd.,dalian,china)进行。所用色谱柱为 agilent zorbax sb-c18(9.4mm
×
250mm，5.0μm)。将浓缩后的代谢物样品溶解在水/甲醇(50:50,v/v)溶液中。流动相为0.13％甲酸的水溶液(a)和乙腈(b)。梯度程序如下：0min，90％a；5min，90％a；25min，53％a；26min，10％a；32min， 10％a，流速为3ml/min，进样量为1ml。紫外检测器设置为280nm。代谢产物的半制备色谱图如图3所示，图中保留时间为18.0min的峰即为代谢产物，从半峰高处开始收集流出液，到紫外吸收值下降到半峰高处停止收集，即图3阴影部分，能够得到纯度较高的组分。将几次发酵代谢产物出峰时间内的流出组分进行合并，冷冻干燥一共得到34.21mg的代谢产物，得率为58.98％。
[0051]
2.代谢产物的结构鉴定
[0052]
利用hplc-pda-ms和nmr 1h和13c对代谢产物结构进行鉴定：
[0053]
hplc-pda-ms在agilent6520系统(agilent technologies，美国)上进行。其色谱柱同实施例1中检测所用。液相条件为：液相a相为0.13％甲酸水溶液，b相为乙腈。柱温30℃，流速为0.8ml/min，进样量10μl。检测波长为280nm。洗脱梯度：0～5min， 90％a；5～25min，90-55％a；25～26min，55-45％a；26～30min，90％a。ms参数如下：负模式；毛细管，3500v；干气温度，350℃；气体流量，8l/min；雾化器，45 psi；和扫描范围，m/z 100～1500。代谢产物的hplc-pda-ms结果如图4。图4a为pda 检测器的在280nm下的色谱图，从图中可以看出经分离纯化后的代谢产物中只含有一个峰，保留时间为17.76min，经峰面积归一法计算其纯度为96.76％。此保留时间下的对应的质谱如图4b，其分子离子为m/z 291.0875，二级碎片离子为m/z 247.0976，m/z167.0351，m/z 123.0453。其中m/z 247.0976为其特征碎片离子，与takagaki and nanjo (2013)的研究通过大鼠粪便微生物发酵儿茶素得到的c环开环产物的质谱结果一致，证明菌株f32-1产生的代谢物确为儿茶素的c环开环产物，其结构如图5。
[0054]
进一步采用nmr对c环开环产物的结构进行鉴定。nmr分析用bruker avanceiii 600mhz(bruker biospin k.k.,yokohama,japan)进行。所有样品都溶解在甲醇-d4中。四甲基硅烷(tms)的化学位移设为0ppm。代谢物的化学位移以tms为参考，进行 1h和13c的测定。化学位移表示为d(百万分之几)，耦合常数(j)表示为hz。图6为其核磁氢谱和碳谱的结果，对其结构中的h和c进行归属，代谢产物的化学位移值符合儿茶素c环开环产物的规律。
[0055]
实施例3代谢产物3,4-dhpp-2-ol的抗氧化活性
[0056]
①
dpph清除能力测定
[0057]
将样品分别以浓度0.5000、0.2500、0.1250、0.0625、0.0313、0.0156mm溶解于甲醇中，将50μl样品与150μl 0.2mm dpph甲醇溶液混匀，在37℃下避光孵育30min，在517nm处测定吸光值。将150μl dpph溶液替换为150μl甲醇作为空白组(a0),150 μl dpph与50μl甲醇反应作为对照组(a2)。dpph自由基清除率计算如下：
[0058]
dpph自由基清除率(％)＝(a2-a1)/(a2-a0)
×
100
[0059]
通过清除率与样品浓度的剂量-反应曲线计算样品的ec50值。
[0060]
②
abts清除能力测定
[0061]
将10ml 7mm abts溶液与176μl 140mm过硫酸钾溶液混合摇匀，室温中避光静置16h,生成abts 工作液。使用前，用甲醇将abts

工作液稀释至吸光度为0.70
±
0.05 (734nm波长下)。样品溶解在甲醇中，浓度分别为1.0000、0.5000、0.2500、0.1250、 0.0625、0.0313mm,将20μl样品和180μl abts

溶液加入到96孔板中，在37℃下避光孵育6min，734nm处测量吸光度值。同时，将180μl abts 溶液替换为180μl甲醇作为空白组(a0),180μl abts

与200μl甲醇反应作为对照组(a2)。abts 自由基清除率和ec50的计算方法同dpph的计算方法。
[0062]
③
frap总还原力的测定
[0063]
将10体积的300mm醋酸盐缓冲液(ph＝3.6)、1体积10mm tptz(2,4,6-三吡啶-s-三嗪)溶于40mm hcl和1体积20mm氯化铁，并于37℃加热，制备得到frap 工作液。将5μl样品与150μl frap工作液于37℃反应5min，于593nm处测定吸光度。利用不同浓度feso4·
7h2o建立标准曲线。在frap分析中，样品的抗氧化效率表示为铁还原能力，相当于已知浓度的fe
2
溶液的铁还原能力。结果以mmolfe
2
/mmol 表示。
[0064]
3,4-dhpp-2-ol清除dhpp自由基的半数效应浓度(ec50)为5.97μmol/l，底物儿茶素的ec50为12.04μmol/l，3,4-dhpp-2-ol清除abts自由基的ec50为5.14μmol/l，底物儿茶素的ec50为8.76μmol/l，3,4-dhpp-2-ol亚铁还原能力frap是底物儿茶素的2.39倍。3,4-dhpp-2-ol清除dpph、abts自由基的能力以及亚铁还原能力都高于底物儿茶素。