胚胎植入前非整倍体遗传学检测用样本保存液及其制备方法与应用与流程

1.本发明是关于一种胚胎植入前非整倍体遗传学检测用样本保存液及其制备方法与应用。


背景技术：

2.胚胎植入前非整倍体遗传学检测(pgt)是一项辅助生殖技术。对于pgt人群，通常被要求采用卵胞浆内单精子显微注射技术(intracytoplasmic sperm injection，icsi)的受精方式。权威组织eshre(2007年)和asrm(2012年)建议所有进行植入前基因检测的患者使用icsi，包括非男性因素不孕的患者，主要目的是为了确保单精子受精,以消除附着在透明带的外来精子的潜在污染，防止卵裂球或卵丘细胞内存在未解浓缩的精子对pgt检测结果造成影响。
3.从技术安全性角度来说，与传统的ivf过程相比，icsi操作是有创的，不仅需要专业人员和技能，而且对卵母细胞有一定程度的损害，逃避了自然选择的精子可能通过icsi技术将遗传缺陷传递给下一代。研究发现，相对于常规ivf，icsi受精的子代在染色体异常、印记失调、孤独症、智力低下和出生缺陷的发生率等方面，都有不同程度的升高。而最新的临床随机对照试验表明，在纳入的1064例人群中，icsi和ivf人群在临床妊娠率、持续妊娠率和活产率均没有统计学差异。这些结果提示，若pgt检测结果的准确性不受外源精子污染，对于精子数量、活力和形态正常的pgt患者，或许可以使用ivf进行受精。这不仅不会影响患者胚胎移植的临床结局，同时也避免了icsi有创的操作对出生后代的不良影响。从卫生经济学角度来说，患者也无需支付因icsi受精而产生的额外费用。在2020年，asrm组织指出，对于非男性因素的pgt，icsi应该被用于外源精子污染可能影响检测结果的情况。
4.但在pgt过程中，精子是有可能被扩增检测的。这是由于为保证活检细胞裂解的充分性，细胞的保存液或者裂解液有较强的裂解能力，精子在这种强裂解的环境中，
5.易发生裂解，从而造成精子dna对检测结果的干扰。同时收集的待检测样本有可能被冷冻保存，增加了附着精子破裂的风险，使外源精子dna更易被成功扩增，从而影响pgt的检测结果。


技术实现要素：

6.本发明的一个目的在于提供一种胚胎植入前非整倍体遗传学检测用样本保存液组合物，能有效避免精子裂解，同时又不影响pgt的检测结果。
7.本发明的另一目的在于提供一种胚胎植入前非整倍体遗传学检测用样本保存液的制备方法。
8.本发明的另一目的在于提供所述的样本保存液在胚胎植入前非整倍体遗传学检测中的应用。
9.一方面，本发明提供了一种胚胎植入前非整倍体遗传学检测用样本保存液组合
物，其包括以下组分：
10.tris hcl；
11.edta；以及
12.kcl。
13.根据本发明的具体实施方案，本发明的胚胎植入前非整倍体遗传学检测用样本保存液组合物，其中，所述各组分在样本保存液中的终浓度为：100-250μm的tris hcl、10-25μm的edta、10-50mm的kcl。
14.根据本发明的具体实施方案，本发明的胚胎植入前非整倍体遗传学检测用样本保存液组合物，还包括primer-3g。优选地，primer-3g在样本保存液中的终浓度为0.1-0.5μm。
15.另一方面，本发明还提供了一种样本保存液，其是用本发明所述的样本保存液组合物配制得到的。具体地，所述样本保存液中，各组分的终浓度为：100-250μm的tris hcl、10-25μm的edta、10-50mm的kcl、0.1-0.5μm的primer-3g。
16.另一方面，本发明还提供了一种制备所述的样本保存液的方法，该方法包括：
17.提供以tris hcl与edta配制的tris-edta溶液：
18.依次向离心管中加入tris-edta溶液、kcl溶液，再加入primer-3g，混匀，配制得到所述样本保存液。
19.根据本发明的具体实施方案，本发明的制备所述的样本保存液的方法中，tris-edta溶液中，tris-hcl浓度为1m，edta浓度为0.1m；kcl溶液浓度为1m。
20.根据本发明的具体实施方案，本发明的制备所述的样本保存液的方法中，向离心管中加入的tris-edta溶液与kcl溶液的体积比为0.1～0.25ml：1～5ml。
21.根据本发明的具体实施方案，本发明的制备所述的样本保存液的方法中，primer-3g以100μm浓度的溶液形式添加。优选地，以配制10ml的样本保存液计，primer-3g溶液的添加量为0.1～0.5ml。
22.根据本发明的具体实施方案，本发明的制备所述的样本保存液的方法包括：
23.先配制10倍浓度的样本保存液母液：依次向离心管中加入tris-edta溶液(1m tris-hcl，0.1m edta)0.1～0.25ml，kcl溶液(1m kcl)1～5ml，primer-3g(100μm)0.1～0.5ml，之后用无核酸酶水补足体积至10ml，充分涡旋混匀10次以上，配制得到样本保存液母液；
24.用无核酸酶水将样本保存液母液稀释成1
×
样本保存液。
25.另一方面，本发明还提供了所述的样本保存液组合物或所述的样本保存液在保存胚胎植入前非整倍体遗传学检测样本中的应用。
26.另一方面，本发明还提供了一种胚胎植入前非整倍体遗传学检测的样本前处理方法方法，该方法包括：
27.将本发明所述的样本保存液分装至pcr管中备用，将细胞样本放入分装后的样本保存液中，即可进行保存。
28.具体地，配制好的样本保存液平时可冷冻保存。待进行细胞样本保存时，取出样本保存液，室温解冻，涡旋混匀，2000rpm瞬时离心3～5sec后分装4.5μl至0.2ml pcr管中备用，将细胞样本放入分装后的样本保存液中即可。进行胚胎植入前非整倍体遗传学检测时，正常解冻后检测即可。
29.本发明的胚胎植入前非整倍体遗传学检测用样本保存液，能够为精子和细胞样本提供一个稳定的ph值缓冲环境和盐离子平衡作用，保护生物蛋白和生物特性，尽可能地维护细胞结构的完整性，避免样本在运输过程中因反复冻融而导致的细胞核酸物质释放，能有效避免精子的裂解，同时又不影响pgt的检测结果。未来临床或许可以不受受精方式的限制进行无创植入前染色体非整倍性检测，实现受精方式和染色体筛查均无创。
附图说明
30.图1显示本发明的样本保存液配方优化实验中不同配方的cnv检测结果。
31.图2显示本发明实施例1中cnv_1_1样本扩增失败的测序染色体拷贝数(cnv)结果。
32.图3a为常规保存液，保存活检细胞、活检细胞 2个精子，样本的cnv结果。
33.图3b为常规保存液，保存活检细胞样本的snp结果分析。
34.图3c为常规保存液，保存活检细胞样本的父源污染检测结果。
35.图4a为本发明调整后的保存液的活检细胞、活检细胞 2个精子，样本的cnv结果。
36.图4b为本发明调整后的保存液，保存活检细胞样本的snp结果分析。
37.图4c为本发明调整后的保存液，保存活检细胞样本的父源污染检测结果。
38.图5为本发明部分测序结果的cnv图。
具体实施方式
39.本发明的内容可以通过参考下面的实例更容易理解，除非特别指明，这些实例是以说明的方式提供，而并非旨在限制本发明。
40.除非另外专门定义，本文使用的所有技术和科学术语都与相关领域普通技术人员的通常理解具有相同的含义。实施例中未特别注明的方法操作，按照所属领域现有技术的常规操作或商厂说明书建议的操作进行。
41.各实施例中，所用primer-3g为seq id no.1所示的多核苷酸：
42.seq id no.1：gtgagtgatggttgaggtagtgtggagnnnnnggg。
43.各实施例中，本发明的样本保存液配方见表1。
44.表1
[0045][0046]
其中，配方b1为本发明优选的各组分浓度范围，配方a为各组分低浓度的组合，配方c为各组分高浓度的组合。
[0047]
本发明样本保存液配方b2-b4见表2。
[0048]
表2
[0049][0050][0051]
常规保存液配方见表3。
[0052]
表3
[0053]
原料名称加液体积(μl)100mm tris-hcl1200mm nacl11mm edta1无核酸酶水4蛋白酶k1样本2
[0054]
各样本的检测方法见表4。
[0055]
表4
[0056][0057]
barcode序列见表5。
[0058]
表5
[0059]
barcodebarcode_seqbarcodebarcode_seqk001atcacgk025actgatk002cgatgtk026atgagck003ttaggck027attcctk004tgaccak028caaaagk005acagtgk029caactak006gccaatk030caccggk007cagatck031cacgatk008acttgak032cactcak009gatcagk033caggcgk010tagcttk034catggck011ggctack035cattttk012cttgtak036ccaacak013agtcaak037cggaatk014agttcck038ctagctk015atgtcak039ctatac
k016ccgtcck040ctcagak017gtagagk041gacgack018gtccgck042taatcgk019gtgaaak043tacagck020gtggcck044tataatk021gtttcgk045tcattck022cgtacgk046tcccgak023gagtggk047tcgaagk024ggtagck048tcggca
[0060]
保存液配方的优化实验
[0061]
取a、b、c三组配方的保存液，分别加入3～5个单细胞(人b淋巴细胞系gm12878)，每组各设置两个重复。样本在-80℃保存两周后，再取出进行裂解扩增。
[0062]
全基因组扩增试剂盒：chrominst。
[0063]
实验方案见表6。
[0064]
表6
[0065][0066][0067]
测序质控详细数据见表7。
[0068]
表7
[0069][0070]
结果显示：本发明的配方b保存液保存样本后，chrominst试剂盒裂解扩增，cnv检测结果最佳。部分检测结果图见图1。
[0071]
实施例1
[0072]
把精子按照5～10条进行分组，每组各两例样本。吸取不同数量的精子，分别加入到常规保存液和本发明的样本保存液(配方b1)中，-80℃保存，可以保存一个月时间。样本立即进行裂解扩增或在保存期限内进行裂解扩增。
[0073]
全基因组扩增试剂盒：chrominst。
[0074]
实验方案见表8。
[0075]
表8
[0076]
[0077]
qc文件信息见表9。
[0078]
表9
[0079][0080]
cnv_1_1样本扩增失败的测序染色体拷贝数(cnv)结果见图2。
[0081]
本实施例的结果显示：加入到本发明的样本保存液的精子，均未扩增成功，测序失败。
[0082]
实施例2
[0083]
采用核型异常细胞掺和不同数量精子，分别加入到常规保存液和本发明的样品保存液中，进行检测。
[0084]
已知核型异常细胞 不同数量精子扩增产物样本，掺精子数量1、3、5、10，每组各3例样本，另有3个阳性对照(pc)。结果参见表10。
[0085]
表10
[0086]
[0087][0088]
结果显示，掺不同数量精子的核型异常细胞，检测结果未改变，说明精子未能扩增成功，对测序结果没有影响。本发明的样品保存液中的精子均未扩增出。
[0089]
实施例3
[0090]
活检胚胎细胞掺和2个精子，分别加入到常规保存液和本发明的样品保存液中，进行检测。
[0091]
1个家系：活检细胞掺和2个精子，保存在常规保存液中。检测结果显示存在精子污染(参见图3a-图3c)。其中，图3b中，子代1ctct代表活检细胞，子代2vlh3代表活检细胞 2个精子。
[0092]
2个家系：活检细胞掺和2个精子，保存在本发明的样品保存液中。从染色体和基因角度，本发明的样品保存液中的精子均未扩增出，即检测结果显示未发现精子污染(参见图4a-图4c)。其中，图4b中，子代1代表活检细胞，子代3代表活检细胞 2个精子。
[0093]
实施例4
[0094]
胚胎培养液掺和不同数量精子，加入到调整后的样品保存液中，精子均未扩增出。
[0095]
针对不同时间梯度(4-8h，1d，3d，5d)和不同数量梯度(3，10，50，100条)的精子，以及带有精子的透明带分别进行扩增和测序。
[0096]
不同培养时间和掺和不同精子数量，加入到样本保存液后的检测结果参见表11。结果显示，扩增产物文库的浓度均在0.5ng/μl以下，经ngs检测后，样本均未检出。
[0097]
表11
[0098]
[0099]
[0100][0101]
部分测序结果的cnv图见图5。
[0102]
本发明的实验表明，采用本发明的胚胎植入前非整倍体遗传学检测用样本保存液，能够为精子和细胞样本提供一个稳定的ph值缓冲环境和盐离子平衡作用，保护生物蛋白和生物特性，尽可能地维护细胞结构的完整性，能够避免样本在运输过程中因反复冻融而导致的细胞核酸物质释放，能有效避免精子的裂解，同时又不影响pgt的检测结果。