一种三角褐指藻Myb类转录因子PtMYB3基因及其编码蛋白和应用

技术特征：
1.一种三角褐指藻myb类转录因子ptmyb3基因，其特征在于：该基因核苷酸序列如seq id no：1所示。2.一种三角褐指藻myb类转录因子ptmyb3编码的蛋白质，其特征在于：该蛋白质的氨基酸序列如seq id no：2所示。3.一种权利要求1所述的三角褐指藻myb类转录因子ptmyb3的克隆方法，其特征在于包括如下步骤：（1）提取三角褐指藻总rna并反转录成cdna作为模板；（2）根据ptmyb3的基因序列设计引物：上游引物序列：5
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atgccttggaccgccgacgaag-3’，下游引物序列：5
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tcatgccaggtacttttcaatt-3’;(3) pcr扩增：通过pcr扩增得到ptmyb3基因扩增产物。4.一种权利要求1所述的三角褐指藻myb类转录因子ptmyb3过表达重组藻构建方法，其特征在于包括如下步骤：（1）根据ptmyb3的基因序列和ppha-t1载体信息设计引物：上游引物序列：5
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cggggatcctctagagtcgacatgccttggaccgccgacgaag-3’，下游引物序列：5
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gatagcacgcttctgaagctttcatgccaggtacttttcaatt-3’，引物两端分别包括载体的序列作为同源臂；（2）pcr扩增：通过pcr扩增得到ptmyb3基因载体构建扩增产物；（3）重组质粒的获得：通过同源重组方法，将ptmyb3基因构建进ppha-t1载体中得到重组质粒；（4）过表达ptmyb3重组藻的获得：将重组质粒通过电转化的方法转化进三角褐指藻中，并通过抗生素筛选和表达量检测方式筛选得到阳性过表达ptmyb3的重组藻。5.根据权利要求4所述的一种三角褐指藻myb类转录因子ptmyb3过表达重组藻构建方法，其特征在于步骤（2）pcr扩增的反应体系为：0.5μl cdna，10μl 2
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primestar max premix，上、下游引物各0.5μl，8.5μl ddh2o；pcr扩增程序为：变性98℃ 10s，退火55℃ 15s，延伸，72℃ 1min，30个循环；pcr扩增产物用1wt%琼脂糖凝胶电泳纯化回收，得到ptmyb3同源重组产物。6.根据权利要求4所述的一种三角褐指藻myb类转录因子ptmyb3过表达重组藻构建方法，其特征在于步骤（3）具体为将ppha-t1双酶切产物与ptmyb3同源重组产物进行同源重组反应，反应体系为：2μl ppha-t1双酶切产物，2μl ptmyb3 pcr同源重组产物，2μl exnase ii，4μl 5
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ce ii buffer，10μl ddh2o，37℃反应30min；将同源产物进行大肠杆菌转化，鉴定获得含有ppha-t1-ptmyb3阳性菌质粒。7.根据权利要求4所述的一种三角褐指藻myb类转录因子ptmyb3过表达重组藻构建方法，其特征在于步骤（4）具体将ppha-t1-ptmyb3质粒用scai进行质粒线性化处理，酶切体系为：26μl ppha-t1-ptmyb3，1μl scai，3μl 10
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fastdigest buffer，37℃酶切3小时，酶切产物用胶回收试剂盒进行清洗回收；将密度为2
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109cell/ml的100
µ
l重悬三角褐指藻细胞与4
µ
g线性化ppha-t1-ptmyb3质粒和40
µ
g鲑精dna，在冰上孵育至少10min后进行电穿孔，电穿孔后细胞立即转移到含有10ml f/2培养液的试管中，在低光强下孵育24h，再转移到正常光强下培养24h，然后3000g离心10min收集细胞并用0.6ml f/2培养液重悬细胞，经过博来霉素筛选得到初步阳性藻；再经表达量检测方式筛选得到阳性过表达pthsf1的重组藻。
8.一种权利要求1-7所述的三角褐指藻myb类转录因子ptmyb3在提高三角褐指藻中岩藻黄素含量方面的应用。

技术总结
本发明公开了一种三角褐指藻Myb类转录因子PtMYB3基因及其编码蛋白和应用，特点是该基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，该基因过表达重组藻构建方法包括根据PtMYB3的基因序列和pPha-T1载体信息设计引物的步骤；通过PCR扩增得到PtMYB3同源重组产物后通过同源重组方法，将PtMYB3基因构建进pPha-T1载体中得到重组质粒的步骤；最后将重组质粒通过电转化的方法转化进三角褐指藻中，并通过抗生素筛选和表达量检测方式筛选得到阳性过表达PtMYB3的重组藻的步骤；优点是可显著提高三角褐指藻中岩藻黄素含量。藻黄素含量。藻黄素含量。


技术研发人员：范思哲 严小军 徐继林 周成旭 李政 李小辉 张金荣
受保护的技术使用者：宁波大学
技术研发日：2022.05.30
技术公布日：2022/9/2