一种耐高温抗生素降解混合菌剂及其制备方法和应用

1.本发明涉及环境保护领域，特别涉及一种耐高温抗生素降解菌剂、制备方法及其在畜禽粪污抗生素去除中的应用。


背景技术：

2.养殖业是抗生素应用的主要领域。养殖粪污中抗生素残留普遍，若未处理完全，将伴随废水、粪便排放进入环境，对人体及生态环境造成危害。如何有效去除畜禽粪污中抗生素残留已成为当下亟待解决的重要问题。
3.四环素、泰乐菌素、链霉素以及氨苄青霉素在高温加热条件下容易被分解，但磺胺二甲嘧啶，分子结构稳定、热稳定性强，仅利用简单的加热处理还会有大量的残留。因此，推测传统的堆肥温度下，磺胺类抗生素较难被完全去除。
4.生物降解是解决养殖废弃物、废水及环境中抗生素残留的有效手段，已引起国内外学者的广泛关注。目前，磺胺类抗生素降解菌有较多报道，microbacterium，rhodococcus，achromobacter，ralstonia，brevundimonas，pseudomonas，acinetobacter，variovorax，alcaligenes、ochrobactrum、类地杆菌、假单胞菌、气单胞菌、产碱菌等。但耐高温的抗生素降解菌较少。
5.此外，混合微生物群落比起单一微生物有很大的优势，对环境的适应性更强，多种微生物菌种相互配合，更能满足多种抗生素同时存在的复合污染现状，因此混菌降解抗生素的研究也很受关注。特别是实验室人工筛选构建出的混合菌剂，较成分不完全明确的天然混菌及单一菌株对污染物的生物降解优势明显。此外，由于人工构建的混合菌剂的菌种成分明确，因此更容易找到最佳、最合理的生产工艺，产品质量也更稳定，在实际应用中这类菌剂的针对性更强，也更安全合理。然而，目前关于这类菌种明确的抗生素降解混合菌剂的报道还很少。
6.由上可知，为了满足日益扩大的抗生素污染的微生物修复需求，能够根据主要抗生素残留类型、与介质原生微生物菌群兼容情况等具体应用情况选择不同的抗生素降解菌种，为混合菌剂配制提供更多菌种资源，筛选更多不同菌属以及针对不同抗生素的降解菌，扩大抗生素降解微生物菌种库必不可少。


技术实现要素：

7.本发明的一个目的是提供一种适用于高温堆肥、超高温堆肥，与粪便堆肥原生微生物菌群兼容性良好，磺胺二甲嘧啶去除效率高的耐高温抗生素降解菌剂。发明另一个目的是提供上述耐高温抗生素降解菌剂的制备方法和在畜禽粪污抗生素去除中的应用。本发明的目的通过下列技术方案实现：一种耐高温抗生素降解混合菌剂，包括蜡样芽孢杆菌（bacillus cereus）、水原拉梅尔芽胞杆菌（rummeliibacillus）、巨大芽孢杆菌（bacillus megaterium）和解蛋白芽孢杆菌（bacillus proteolyticus）。
8.作为优选，耐高温抗生素降解混合菌剂由蜡样芽孢杆菌（bacillus cereus）、纺缍
形赖氨酸芽孢杆菌（lysinibacillus fusiformis）、水原拉梅尔芽胞杆菌（rummeliibacillus）、巨大芽孢杆菌（bacillus megaterium）和解蛋白芽孢杆菌（bacillus proteolyticus）组成。
9.进一步的，蜡样芽孢杆菌（bacillus cereus）、纺缍形赖氨酸芽孢杆菌（lysinibacillus fusiformis）、水原拉梅尔芽胞杆菌（rummeliibacillus）、巨大芽孢杆菌（bacillus megaterium）和解蛋白芽孢杆菌（bacillus proteolyticus）从从猪粪中驯化、筛选得到，且均具有经121℃湿热灭菌30min后仍能复苏存活的高温耐受性。
10.耐高温抗生素降解混合菌剂的驯化和筛选方法，包括如下步骤：1）称取冷藏猪粪样品50g 于1l的三角瓶中，加入450ml 无菌水（粪便：水=1:9，v:v），180rpm，室温振荡2小时，滤纸过滤获得猪粪废水悬液1，121℃灭菌30min；2）取冷藏猪粪按照1:1与水混合（100g 100ml），180rpm，室温振荡2小时，静置2小时，取上清，获得猪粪悬浊液2；3）取49ml高温灭菌处理的猪粪废水悬液1，加磺胺二甲嘧啶至终浓度10mg/l，并加1ml猪粪悬浊液2，在25℃，180rpm，避光震荡培养；4）培养结束后，取100μl培养物涂布到含有磺胺二甲嘧啶的lb平板上，随机挑取单菌落到含有10mg/l磺胺二甲嘧啶的lb培养基中，培养5天，测定抗生素降解率；5）选取可降解抗生素的菌种，提取细菌总dna，用16srdna通用引物进行pcr扩增后，进行测序、同源性比对，确定降解菌的种属；6）挑选筛选获得的磺胺二甲嘧啶降解菌，制定不同菌剂组合方案；将菌剂组合按照1%接种到猪粪废水悬液中，加磺胺二甲嘧啶至终浓度10mg/l，在180rpm，25℃，避光震荡培养；培养2、5天后，测定磺胺二甲嘧啶降解率；通过对比磺胺二甲嘧啶降解率，获得耐高温抗生素降解混合菌剂。
11.与现有技术对比，本发明的有益效果是：1、本发明的菌株为耐高温抗生素降解菌剂，适用于高温堆肥、超高温堆肥。
12.2、本发明的菌株来源于畜禽粪便，与粪便堆肥原生微生物菌群兼容性良好。
13.3、本发明公开的菌株中lysinibacillus fusiformis、rummeliibacillus的抗生素降解性能未有报道，为抗生素污染修复提供了新的微生物菌种资源。
14.4、本发明的抗生素降解混合菌剂是一种人工筛选构建的混合菌剂，较成分不完全明确的天然混菌体系和单一菌株对污染物的生物降解优势明显。该菌剂的菌种成分明确，可应用于畜禽粪便有机肥料中的残留抗生素去除。与不添加菌剂的对照相比，接种该菌剂的畜禽粪污中磺胺二甲嘧啶去除效率从35%提高至88%。
附图说明
15.图1：本发明实施例中灭菌和有菌处理猪粪磺胺二甲嘧啶降解对比试验示意图。
具体实施方式
16.下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例
17.一、磺胺二甲嘧啶降解菌种驯化、筛选和鉴定试验1、灭菌和有菌处理猪粪磺胺二甲嘧啶降解对比试验1）称取冷藏猪粪样品50g 于1l的三角瓶中，加入450ml 无菌水（粪便：水=1:9，v:v），180rpm，室温振荡2小时，滤纸过滤获得猪粪废水悬液1，121℃灭菌30min。
18.2）取冷藏猪粪按照1:1与水混合（100g 100ml），180rpm，室温振荡2小时，静置2小时，取上清，获得猪粪悬浊液2，121℃灭菌30min。
19.3）制备灭菌猪粪处理（s）：取49ml高温灭菌处理的猪粪废水悬液1，加磺胺二甲嘧啶至终浓度10mg/l，并加1ml高温灭菌的猪粪悬浊液2，在25℃，180rpm，避光震荡培养。
20.制备有菌猪粪处理（l）：取49ml高温灭菌处理的猪粪废水悬液1，加磺胺二甲嘧啶至终浓度10mg/l，并加1ml未灭菌猪粪悬浊液2，在25℃，180rpm，避光震荡培养。
21.4）在培养2天时采样，测定磺胺二甲嘧啶残留浓度。计算磺胺二甲嘧啶降解率。
22.5）采用lb平板培养计数法测定培养物中可培养细菌总数量（cfu/ml）。
23.、磺胺二甲嘧啶降解菌种的筛选、鉴定试验1）利用灭菌和有菌处理猪粪磺胺二甲嘧啶降解对比试验中的培养物，取100μl灭菌猪粪处理培养物（s：2天）涂布到含有磺胺二甲嘧啶的lb平板上，培养36-38小时；2）从耐药lb平板上，随机挑取10株单菌落到含有10mg/l磺胺二甲嘧啶的lb培养基中，培养5天，测定抗生素降解率，降解率如表1。
24.3）选取可降解抗生素的菌种，提取细菌总dna，用16srdna通用引物进行pcr扩增后，进行测序、同源性比对，结合生理生化、菌种形态，确定降解菌的种属。菌种信息见表1。
25.、试验结果1）灭菌和有菌处理猪粪磺胺二甲嘧啶降解对比试验如图所示，灭菌处理猪粪中仍能降解磺胺二甲嘧啶，2天降解率28.1%，降解率与有菌对照相比无显著差异。高温处理未能致死所有微生物，培养物中存在高温耐受微生物，细菌数量达1
ꢀ×ꢀ
10
5 cfu/ml，很可能存在磺胺二甲嘧啶降解能力。
26.2）磺胺二甲嘧啶降解菌种的筛选、鉴定试验如表1所示，从2天的灭菌猪粪处理培养物中筛选到10株具有磺胺二甲嘧啶降解能力的菌种，降解率在4%-19.6%，这10株磺胺二甲嘧啶降解菌能耐受高温，在121℃处理30分钟后仍能存活。经鉴定，10株菌中bacillus cereus、bacillus megaterium、bacillus proteolyticus的磺胺二甲嘧啶降解性能略强，而此前未有研究报道过rummeliibacillus、lysinibacillus fusiformis能降解磺胺二甲嘧啶。
27.表1 磺胺二甲嘧啶降解菌鉴定结果和磺胺二甲嘧啶降解效率%菌种smz降解率(%)aerococcusviridans7.39aerococcussp.3.84sporosarcinacontaminans13.79bacilluscereus17.41bacillusstratosphericus12.75bacillusaltitudinis12.54
lysinibacillusfusiformis8.32rummeliibacillus13.52bacillusmegaterium17.23bacillusproteolyticus19.57二、磺胺二甲嘧啶混合微生物菌剂的应用效果试验（案例1）1、试验方法1）制备种子液：将表1中的所有菌种按0.5%接种量转接到lb液体培养基中，25℃，180rpm振荡培养至od600值约为0.6-1，培养结束后，收集菌液作种子液备用。
28.2）制备混合菌剂：混合菌种，使用前用无菌生理盐水洗涤，然后浓缩10倍后作为混合菌剂备用。
29.3）猪粪废水：将猪粪与水按1:9比例混合，180rpm，25℃振荡2h，然后用纱布过滤收集滤液，分装后121℃高压蒸汽灭菌1h做无菌浸提液，冷却备用。
30.4）按照1%接种量，将菌剂接种到猪粪废水中，培养5天后采样，测定磺胺二甲嘧啶残留浓度。计算磺胺二甲嘧啶降解率。
31.2、试验结果经过5天培养后，对照养殖废水中磺胺二甲嘧啶降解率为1.9%，而菌剂接种处理中磺胺二甲嘧啶降解率为20.2%。
32.三、磺胺二甲嘧啶混合微生物菌剂组合优化试验（案例2）1、试验方法1）制备种子液：将表1中的所有菌种按0.5%接种量转接到lb液体培养基中，25℃，180rpm振荡培养至od600值约为0.6-1，培养结束后，收集菌液作种子液备用。
33.2）制备混合菌剂：按照比例混合菌种，使用前用无菌生理盐水洗涤，然后浓缩10倍后作为混合菌剂备用。表2：混合菌种组合
ꢀ组合bacilluscereusbacillusstratosphericus1-23lysinibacillusfusiformisrummeliibacillusbacillusmegateriumbacillusproteolyticus菌剂1ꢀꢀꢀꢀ√1√1菌剂2√1√1√1ꢀ√1√1菌剂3√1ꢀ√1ꢀ√1√1菌剂4√1ꢀ√1√1√1√1菌剂5√1ꢀꢀꢀ√1√2菌剂6√1√1√1√1√1√1
34.3）混合菌种组合，实际混合微生物菌剂组合优化过程中，制备了大量的混合菌剂组合，本技术选择了其中比较典型的如表6组，如表2所示；除菌剂5以外的混合菌种组合均按照等比例混合菌种，菌剂5中bacillus proteolyticu是其它菌种的2倍。
35.4）猪粪废水：将猪粪与水按1:18比例混合，180rpm，25℃振荡2h，然后用纱布过滤收集滤液，分装后121℃高压蒸汽灭菌1h。在常温下放置1天后，再在121℃高压蒸汽灭菌1h。随后为无菌浸提液，冷却备用。
36.5）按照1%接种量，将菌剂组合接种到猪粪废水中，培养5天后采样，测定磺胺二甲嘧啶残留浓度。计算磺胺二甲嘧啶降解率。每个处理3个重复。
37.2、试验结果如表3所示，菌剂4的磺胺二甲嘧啶降解率达到了88.5%，显著高于其他菌剂和单菌
处理。菌剂4只比菌剂3多了rummeliibacillus ，表明rummeliibacillus 在菌剂中具有较大的作用。
38.表3 不同磺胺二甲嘧啶降解菌剂组合磺胺二甲嘧啶（smz）降解率%
组合bacilluscereusbacillusstratosphericus1-23lysinibacillusfusiformisrummeliibacillusbacillusmegateriumbacillusproteolyticussmz降解率（%）5天ck
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
34.9菌剂1ꢀꢀꢀꢀ√1√129.9菌剂2√1√1√1ꢀ√1√133.3菌剂3√1ꢀ√1ꢀ√1√122.8菌剂4√1ꢀ√1√1√1√188.5菌剂5√1ꢀꢀꢀ√1√233.5菌剂6√1√1√1√1√1√132.7
与不接种菌剂对照相比，猪粪液体中磺胺二甲嘧啶降解效率明显增加，5天降解率最高达88.5%，显著优于单菌和其他菌剂组合。
39.三、磺胺二甲嘧啶复合微生物菌剂组合的应用效果评价试验（案例3）1、试验方法1）制备种子液：将表1中的所有菌种按0.5%接种量转接到lb液体培养基中，25 ℃，180rpm振荡培养至od600值约为0.6-1，培养结束后，收集菌液作种子液备用。
40.2）制备混合菌种：按比例混合菌种，使用前用无菌生理盐水洗涤，然后浓缩10倍后作为混合菌种备用。
41.3）混合菌种组合如表2（同实施例1）。
42.4）猪粪废水：将猪粪与水按1:18比例混合，180rpm，25℃振荡2h，然后用纱布过滤收集滤液，分装后121℃高压蒸汽灭菌1h做无菌浸提液，冷却备用。与实施例2相比，此猪粪在冰箱中的保存时间长度不同，提取液略有不同。
43.5）按照1%接种量，将菌剂组合接种到猪粪废水中，培养2天后采样，测定磺胺二甲嘧啶残留浓度。计算磺胺二甲嘧啶降解率。每个处理3个重复。
44.2、试验结果如表4所示，与实施例3相比，本次降解率为培养2天后的结果。菌剂4处理的磺胺二甲嘧啶降解率为56.7%，仍显著高于其他菌剂组合的降解率。
45.表4不同磺胺二甲嘧啶降解菌剂组合磺胺二甲嘧啶（smz）降解率%组合2天smz降解率（%）ck20.2菌剂122.9菌剂227.9菌剂322.3菌剂456.7菌剂533.5菌剂632.7本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
46.以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方
案的保护范围。