一种多药联合药敏试验方法与流程

1.本发明属于抗微生物药物敏感性试验技术领域，具体涉及一种多药联合药敏试验方法。


背景技术：

2.多重耐药菌在全球范围内的广泛流行和播散，为临床的抗感染治疗带来极大挑战，其中尤其以碳青霉烯类耐药革兰阴性杆菌为代表。碳青霉烯类抗菌药物包括亚胺培南、美罗培南和厄他培南等，是治疗多重耐药革兰阴性杆菌所致感染最有效的抗菌药物之一。随着该类药物在临床的广泛使用，碳青霉烯类耐药细菌(carbapenem-resistant organisms,cro)的检出率呈逐年上升趋势，其中以肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌为代表。“chinet中国细菌耐药监测网”历年监测结果显示，我国临床分离肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌对亚胺培南的耐药率分别为23.1％、23％和71.5％。由于碳青霉烯类耐药菌株通常还携带有对其他抗菌药物耐药的基因，对抗菌药物呈广泛耐药甚至全耐药的特征，使临床的抗感染治疗面临无药可用的困境，导致感染患者的高病死率。多药联合药敏试验可通过两药多药组合分析不同药物之间的协同抗菌活性，在筛选针对cro菌株所致感染的精准抗感染治疗方案中发挥重要作用。但现有多药联合药敏试验方案包括肉汤微量稀释棋盘法、琼脂稀释棋盘法等标准方法存在操作复杂、所需材料价格昂贵等缺点，无法在常规实验室进行开展。etest多药联合方法虽然操作简单，但价格昂贵，亦不适用于常规实验室开展。


技术实现要素：

3.为了解决上述问题，本发明提供了一种多药联合药敏试验方法，针对多重耐药革兰阴性杆菌多药联合药敏试验技术进行研究，开发常规实验室可简单操作、结果容易阅读且价格低廉的方法，为临床应对多重耐药细菌的抗感染精准治疗提供强有力的依据。
4.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
5.本发明提供了一种多药联合药敏试验方法，包括以下步骤：
6.1)配置阳离子调节肉汤，准备抗菌药物a药敏纸片和抗菌药物b药敏纸片；
7.2)挑取新鲜纯培养菌落，制备菌悬液，稀释后得到待测菌菌悬液待用；
8.3)4根无菌试管中分别加入2ml步骤1)的阳离子调节肉汤，分别标记为c、a、b和a b管，a管放入抗菌药物a药敏纸片，b管放入抗菌药物b药敏纸片，a b管同时放入抗菌药物a药敏纸片和抗菌药物b药敏纸片，室温孵育使纸片中的抗菌药物完全扩散入阳离子调节肉汤中；
9.4)吸取步骤2)得到的待测菌菌悬液分别加入步骤3)得到的c、a、b和a b管中，最终接种菌量为1.5
×
105cfu/ml，孵育后观察各管中的细菌生长情况以判断抗菌药物a与抗菌药物b是否存在协同作用。
10.作为本发明的一种优选方案，步骤1)中，所述阳离子调节肉汤为camhb肉汤，所述
配置方法为：在水中加入camhb琼脂粉，定容至1000ml，高压灭菌，分装得到。
11.作为本发明的一种优选方案步骤3)中，所述抗菌药物a药敏纸片、抗菌药物b药敏纸片为临床常用的含不同抗菌药物特定含量的药敏纸片。
12.作为本发明的一种优选方案，步骤2)中，待测菌菌悬液为以生理盐水制备的0.5麦氏浊度菌悬液。
13.作为本发明的一种优选方案，步骤4)中，孵育温度为35℃，孵育时间为16h-20h。
14.作为本发明的一种优选方案，步骤4)中，若c、a、b和a b号管中细菌均生长，判断抗菌药物a和抗菌药物b两药间不存在协同抗菌作用。
15.作为本发明的一种优选方案，步骤4)中，若c、a和b号管中细菌均生长，但a b号管中细菌不生长，判断抗菌药物a和抗菌药物b两药间存在协同抗菌作用。
16.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
17.1)本发明针对多重耐药细菌的联合药敏试验，提供了一种常规实验室可执行的多药联合药敏试验方法；
18.2)本发明的方法结果易读，操作简单，成本低。
附图说明
19.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
20.图1是两药存在协同抗菌作用的结果图。
21.图2是两药不存在协同抗菌作用的结果图。
具体实施方式
22.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
23.本发明中所用的抗菌药物a药敏纸片和抗菌药物b药敏纸片，为临床常用的含不同抗菌药物特定含量的药敏纸片，在此不做限定，即满足临床常用，不同抗菌药物含量的药敏纸片组均可实现本发明的目的。
24.实施例1
25.本实施例提供了一种多药联合药敏试验方法的试剂和材料，包括camhb肉汤、抗菌药物a药敏纸片头孢他啶-阿维巴坦(30/20μg)与抗菌药物b药敏纸片氨曲南(30μg)。
26.camhb肉汤的配置方法为：在水中加入21克camhb琼脂粉，定容至1000ml，高压灭菌，分装。
27.实施例2
28.本实施例提供了一种多药联合药敏试验方法，包括以下步骤：
29.1)第一天：划线纯分受试细菌于血琼脂平板上，35℃
±
2℃大气环境孵育18-24h；
配置camhb肉汤；
30.2)第二天：挑取过夜培养的新鲜纯分菌落，以2ml生理盐水制备0.5麦氏浊度菌悬液，；
31.3)实验时在4根无菌试管中分别加入2ml的camhb肉汤，分别标记为c、a、b和a b管，其中c管为生长对照，a管放入一张实施例1所述的抗菌药物a药敏纸片，b管放入一张实施例1所述的抗菌药物b药敏纸片，a b管同时放入实施例1所述的抗菌药物a药敏纸片和抗菌药物b药敏纸片，室温孵育30分钟使纸片中的抗菌药物完全扩散入肉汤中；
32.4)然后吸取10μl的0.5麦氏浊度待测菌菌悬液分别加入含2ml的c、a、b和a b管中，最终接种菌量为1.5
×
105cfu/ml，35℃孵育16-20h后观察各管中的细菌生长情况。
33.5)结果判读：若c、a、b和a b号管中细菌均生长，判断抗菌药物a和抗菌药物b两药间不存在协同抗菌作用，如图2所示；若c、a和b号管中细菌均生长，但a b号管中细菌不生长，判断抗菌药物a和抗菌药物b两药间存在协同抗菌作用，如图1所示。
34.以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。