一种籽粒β-葡聚糖含量提高的转基因水稻的制备方法

id no.2所示，所述cslf6基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；
12.(2)将步骤(1)的glub-1启动子和cslf6基因连接至原始表达载体上，得到同时包含有glub-1启动子和cslf6基因的重组表达载体；
13.(3)将重组表达载体转化至感受态细胞进行培养，得到基因工程菌；
14.(4)将步骤(3)的基因工程菌转化至受体植株内，得到转基因植株；
15.(5)验证步骤(4)的转基因植株，测定转基因植株籽粒中的β-葡聚糖含量，得到籽粒β-葡聚糖含量提高的转基因水稻。
16.进一步地，步骤(1)中，获取glub-1启动子的方法为：
17.(a)提取水稻中花11幼苗叶片的基因组dna；
18.(b)对基因组dna进行一次pcr扩增，再对一次扩增后的产物进行二次pcr扩增，得到目标扩增产物；
19.所述一次pcr扩增所用引物如seq id no.6和seq id no.7所示；所述二次pcr扩增所用引物如seq id no.8和seq id no.9所示。
20.进一步地，步骤(1)中，获取cslf6基因的方法为：
21.(a)提取水稻叶片总rna，反转录成单链cdna；
22.(b)以单链cdna为模板，进行第一轮pcr扩增，再对第一轮pcr扩增后的产物进行第二轮pcr扩增，得到目标扩增产物；
23.所述第一轮pcr扩增所用引物如seq id no.10和seq id no.11所示；所述第一轮pcr扩增所用引物如seq id no.12和seq id no.13所示。
24.进一步地，所述原始表达载体为b24_pcambia-1300-35s-gfp-nos。
25.进一步地，所述感受态细胞为大肠杆菌dh5α。
26.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
27.本发明将glub-1启动子和cslf6基因进行重组，重组后的目标基因转入至受体植株中，获得的转基因水稻能够显著提高水稻籽粒中的β-葡聚糖含量，在水稻遗传育种领域可用于培育高β-葡聚糖含量的水稻新品种，为功能稻的筛选和培育提供理论指导。
附图说明
28.图1为实施例1、2、3中过表达植株与对照植株籽粒β-葡聚糖含量的比较；
29.其中，图a受体材料为中花11，图b受体材料为华占；ck表示阴性对照材料；oe1，oe2，oe3分别表示实施例1、2、3中的转基因阳性植株；**所示为实施例1中的转基因植株与对照植株的差异为极显著，显著水平为p《0.05。
具体实施方式
30.下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
31.实施例1转基因植株的制备(glub-1启动子连接cslf6基因)
32.1)水稻基因组dna的提取
33.水稻种子(中花11)在25℃条件下发芽，水稻幼苗长到3～4片叶时，采用ctab法提取水稻幼苗叶片基因组dna。
34.2)启动子的分离
35.以上述步骤中的基因组dna为模板，用以下引物按下述方法进行两轮pcr扩增，获得启动子核苷酸序列。
36.第一轮pcr扩增：
37.模板：步骤1)中的基因组dna
38.引物如下：
39.f:5
’‑
acagattcttgctaccaacaac-3’；
40.r:5
’‑
agttcaaagacagaccaagctag-3’；
41.以水稻基因组dna为模板，在上述引物的作用下，通过pcr扩增得到启动子片段。
42.pcr体系(50μl)：
[0043][0044]
pcr程序：
[0045][0046]
第二轮pcr扩增：
[0047]
模板：第一轮纯化后的pcr产物
[0048]
引物：
[0049]
f:5
’‑
gtaaaacgacggccagtgccaagcttacagattcttgctaccaacaac-3’；
[0050]
r:5
’‑
agttcaaagacagaccaagctag-3’；
[0051]
pcr体系和程序与第一轮相同。
[0052]
扩增结束后，pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(长约为2.3kb的特异性扩增条带)并切胶回收目的片段，采用北京天根生化公司的胶回收试剂盒。
[0053]
3)水稻总rna提取及cdna合成
[0054]
采用takara公司的takaraminibest plant rna extraction kit提取水稻(中花11)叶片中总rna，采用dnase i酶去除基因组dna，随后使用takara公司的rt reagent kit perfect real time试剂盒将提取的总rna反转录成单链cdna。
[0055]
4)a基因编码区扩增
[0056]
以上述步骤中的cdna为模板，用以下引物按下述方法进行两轮pcr扩增，选用toyobo公司的kod-fx聚合酶，扩增得到pcr产物，全长为2865bp。pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收目的片段，采用北京天根生化公司的胶回收试剂盒。
[0057]
第一轮pcr扩增：
reagent kit perfect real time试剂盒将提取的总rna反转录成单链cdna。
[0079]
2)基因编码区扩增
[0080]
以上述步骤中的cdna为模板，用以下引物按下述方法进行两轮pcr扩增，选用toyobo公司的kod-fx聚合酶，扩增得到pcr产物，全长为2865bp。pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收目的片段，采用北京天根生化公司的胶回收试剂盒。
[0081]
第一轮pcr扩增：
[0082]
模板：步骤3)中的cdna
[0083]
引物：f:5
’‑
ttagcaatggcgccagcggt-3’；
[0084]
r:5
’‑
tcatggccaggcgtaggtga-3’；
[0085]
pcr体系(50μl)：
[0086][0087]
pcr程序：
[0088][0089]
第二轮pcr扩增：
[0090]
模板：第一轮纯化后的pcr产物
[0091]
引物：
[0092]
f:5
’‑
agaacacgggggactctagattagcaatggcgccagcggt-3’；
[0093]
r:5
’‑
ttgaacgatcggggaaattcgagctctcatggccaggcgtaggtga-3’；
[0094]
pcr体系和程序与第一轮相同。
[0095]
3)重组载体构建
[0096]
采用vazyme的同源重组试剂盒进行线性化载体、启动子片段和基因编码区片段的同源重组，在此所用载体为pcambia-1300-35s-gfp-nos，限制性酶切位点分别为xbai(tctaga)和saci(gagctc)。
[0097]
将重组载体转化大肠杆菌感受态，涂板至含50μg/ml卡那霉素的lb培养基，过夜培养后挑取单克隆采用引物f(5
’‑
agaacacgggggactctagattagcaatggcgccagcggt-3’)和r:(5
’‑
ttgaacgatcggggaaattcgagctctcatggccaggcgtaggtga-3’)进行菌液pcr验证并测序验证其序列(即如seq id no.3所示，重组片段总长为3739bp)。
[0098]
将序列正确的阳性克隆进行过夜培养抽提质粒。质粒提取试剂盒购自北京天根生化公司，提取方法参照说明书。将质粒进行遗传转化，转化受体材料为中花11和华占。
[0099]
经潮霉素筛选后，获得数十株转基因候选植株；再依次提取转基因候选植株和对
照组植株ck(不含潮霉素抗性基因)的dna，通过pcr的验证方法获得转基因阳性植株和阴性植株(作为对照组材料)，其中验证引物为上述菌液pcr验证引物，引物信息前已所述。
[0100]
实施例3转基因植株的制备(glub-1启动子连接cslf3基因)
[0101]
1)水稻基因组dna的提取
[0102]
水稻种子(中花11)在25℃条件下发芽，水稻幼苗长到3～4片叶时，采用ctab法提取水稻幼苗叶片基因组dna。
[0103]
2)启动子的分离
[0104]
以上述步骤中的基因组dna为模板，用以下引物按下述方法进行两轮pcr扩增，获得启动子核苷酸序列。
[0105]
第一轮pcr扩增：
[0106]
模板：步骤1)中的基因组dna
[0107]
引物如下：
[0108]
f:5
’‑
acagattcttgctaccaacaac-3’；
[0109]
r:5
’‑
agttcaaagacagaccaagctag-3’；
[0110]
以水稻基因组dna为模板，在上述引物的作用下，通过pcr扩增得到启动子片段。
[0111]
pcr体系(50μl)：
[0112][0113]
pcr程序：
[0114][0115]
第二轮pcr扩增：
[0116]
模板：第一轮纯化后的pcr产物
[0117]
引物：
[0118]
f:5
’‑
gtaaaacgacggccagtgccaagcttacagattcttgctaccaacaac-3’；
[0119]
r:5
’‑
agttcaaagacagaccaagctag-3’；
[0120]
pcr体系和程序与第一轮相同。
[0121]
扩增结束后，pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(长约为2.3kb的特异性扩增条带)并切胶回收目的片段，采用北京天根生化公司的胶回收试剂盒。
[0122]
3)水稻总rna提取及cdna合成
[0123]
采用takara公司的takaraminibest plant rna extraction kit提取水稻(中花
11)叶片中总rna，采用dnase i酶去除基因组dna，随后使用takara公司的rt reagent kit perfect real time试剂盒将提取的总rna反转录成单链cdna。
[0124]
4)基因编码区扩增
[0125]
以上述步骤中的cdna为模板，用以下引物按下述方法进行两轮pcr扩增，选用toyobo公司的kod-fx聚合酶，扩增得到pcr产物，全长为2553bp。pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收目的片段，采用北京天根生化公司的胶回收试剂盒。
[0126]
第一轮pcr扩增：
[0127]
模板：步骤3)中的cdna
[0128]
引物：f:5
’‑
atggcgtcggcggccggtgc-3’；
[0129]
r:5
’‑
aaatggaagaaaactaagaa-3’；
[0130]
pcr体系(50μl)：
[0131][0132]
pcr程序：
[0133][0134]
第二轮pcr扩增：
[0135]
模板：第一轮纯化后的pcr产物
[0136]
引物：
[0137]
f:5
’‑
ctagcttggtctgtctttgaactatggcgtcggcggccggtgc-3’；
[0138]
r:5
’‑
ttgaacgatcggggaaattcgagctcaaatggaagaaaactaagaa-3’；
[0139]
pcr体系和程序与第一轮相同。
[0140]
5)重组载体构建
[0141]
采用vazyme的同源重组试剂盒进行线性化载体、启动子片段和基因编码区片段的同源重组，在此所用载体为pcambia-1300-35s-gfp-nos，限制性酶切位点分别为hindiii(aagctt)和saci(gagctc)。
[0142]
将重组载体转化大肠杆菌感受态，涂板至含50μg/ml卡那霉素的lb培养基，过夜培养后挑取单克隆采用引物f(5
’‑
ctagcttggtctgtctttgaactatggcgtcggcggccggtgc-3’)和r:(5
’‑
ttgaacgatcggggaaattcgagctcaaatggaagaaaactaagaa-3’)进行菌液pcr验证并测序验证其序列(即如seq id no.4所示，重组片段总长为4897bp)。
[0143]
将序列正确的阳性克隆进行过夜培养抽提质粒。质粒提取试剂盒购自北京天根生化公司，提取方法参照说明书。将质粒进行遗传转化，转化受体材料为中花11。
[0144]
经潮霉素筛选后，获得数十株转基因候选植株；再依次提取转基因候选植株和对照组植株ck(不含潮霉素抗性基因)的dna，通过pcr的验证方法获得转基因阳性植株和阴性植株(作为对照组材料)，其中验证引物为上述菌液pcr验证引物，引物信息前已所述。
[0145]
实施例4功能验证
[0146]
对上述实施例1～3中的转基因阳性植株与对照组植株ck(非转基因植株)成熟籽粒进行β-葡聚糖含量的测定分析，测定采用megazyme试剂盒。结果发现，与对照相比，仅实施例1中导入seq id no.1(glub-1启动子连接cslf6基因组合)的转基因阳性植株籽粒β-葡聚糖含量极显著升高，最高可分别达对照的350％(中花11)和500％(华占)左右，而实施例2和3(其他启动子和基因组合)在两个受体材料中均不能提高水稻籽粒β-葡聚糖含量。因此，通过以上分析发现通过在水稻中外源导入seq id no.1序列可提高水稻籽粒β-葡聚糖含量。