红球菌菌剂及其对有机氯污染土壤的修复

1.本发明属于环境中有机氯污染环境生物修复技术领域，涉及一种由红球菌(rhodococcus zopfii)dcb-5构成的菌剂，具体包括菌剂的制备方法及其在有机氯污染环境生物修复领域的应用。


背景技术：

2.随着工农业对有机氯及相关产品使用量的增加，有机氯化合物复合污染对环境的损害不容忽视。虽然环境具有一定的“自净”作用，能降解和转化部分有毒有机污染物，但是大多数情况下，该自然衰减过程是十分漫长且不彻底的。关于有机氯化合物在水生环境、沉积物、土壤环境中发生的污染事件已有大量报道，一旦未采取适当的处理处置措施进入环境，最终将威胁到环境安全和人类的健康和安全。
3.在偶氮染料、农药、医药等的生产中，有机氯类物质被广泛使用，期间不合理使用和泄露导致土壤污染程度加剧，增强了从土壤中去除有机氯的难度。而在吸附、光解、电解等物化处理过程中通常会产生污泥，需要在卫生填埋场进一步处理，继而增加运营成本。
4.目前，微生物修复技术被认为是最可取的方法之一，美国环境保护署(usepa)将生物修复定义为一种使用微生物将有毒污染物降解为危害较小的产物，从而减少人为活动产生的环境污染物。生物修复技术成本较低、简单易行、不易产生二次污染，适用于大规模复合污染体系的修复。本发明选用对氯苯胺为代表性有机氯化物，设置有机氯污染体系，进一步构建高效菌剂来进行降解。
5.因此，研究一种成本低、环境友好、效率高的微生物菌剂对于对氯苯胺复合污染环境的修复具有重要意义。


技术实现要素：

6.针对上述研究背景，本发明提供了一种由(rhodococcuszopfii)dcb-5构成的微生物菌剂，所述菌剂具有降解对氯苯胺的特性，能够很好的应用于对氯苯胺污染环境的修复中。
7.本发明通过以下技术方案予以实现：
8.本发明的菌株dcb-5(rhodococcuszopfii)从南京某药厂长期受有机氯污染土壤中筛选而得，经研究发现，该菌对于对氯苯胺具有良好降解率。
9.一种对氯苯胺降解菌剂的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
10.将dcb-5接种到液体lb培养基中，35℃、160rpm条件下振荡培养7h后，得到菌发酵液，将发酵液离心后去掉上清液，再经过磷酸盐缓冲液清洗3次后收集菌体，最后将收集的菌体于-20℃冰箱过夜预冻后经真空冷冻干燥即得菌剂。
11.活化及发酵过程所用牛肉膏液体培养基组成成分包括：
12.牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，nacl 10.0g，蒸馏水1000ml；
13.所述活化培养基使用前调ph为7.0～7.5，121℃下灭菌20min后使用。
14.与现有技术相比，本发明具有下述优点：
15.(1)本发明涉及的菌剂的筛菌、培养过程均使用常规培养基，不需要特殊的培养环境，菌剂的制备更为简便。
16.(2)本发明利用的菌剂是一种人工筛选构建的菌剂，较成分不完全明确的天然菌株对污染物的生物降解优势明显。该菌剂的菌种成分明确，制备工艺简单，成本低，环境友好，具有广阔的应用前景。
附图说明
17.图1为筛选得到的红球菌(rhodococcuszopfii)dcb-5在牛肉膏固体培养基上的生长状态；
18.图2为菌对于对氯苯胺的降解效果图；
19.表1为基因注释与同源性图；
20.图3为降解基因图谱；
具体实施方式
21.为了使本技术领域的人员更好的理解本发明中的技术方案，下面将结合本申请中具体的实施例，对本申请的具体技术方案进行详细的说明。应当指出，所描述的实施例并不是本申请的全部实施例，这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定。下述实施例中所用实验材料若无特殊说明，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
22.实施例1.菌株筛选
23.材料和方法
24.土壤样品：南京某药厂附近长期受有机氯污染土壤。
25.无机盐培养基：nacl 0.5g，k2hpo41.5 g，kh2po40.5 g，蒸馏水1000ml，调ph为7.2～7.5，121℃灭菌20min后使用。
26.对氯苯胺降解菌筛选培养基：在无机盐培养基的基础上加入一定量的对氯苯胺。
27.对氯苯胺降解菌株的筛选
28.称取4g原始土壤加入100ml含有有机污染物(100mg/l)的锥形瓶中。在30℃黑暗条件下放入摇床连续摇动(180rpm)，孵育7天。
29.孵育7天后，观察孵育情况。静置，将1ml悬浮液转移到100ml有机污染物浓度为200、300、400和500mg/l无机盐培养基中。
30.将富集的悬浮液进行梯度稀释后在无菌操作台上铺展到含有机污染物(500mg/l)作为唯一碳源的矿物培养基琼脂平板上，在37℃下避光孵育2天。
31.从平板上挑取单个菌落并在补充有对氯苯胺(500mg/l)的无机盐培养基琼脂平板上划线2次，在37℃下避光孵育2天。
32.将孵育的细菌保存，然后对所有分离株的16srrna进行测序，并与ncbi数据库中的进行比较。
33.以上所述，仅是本发明的典型实施例，本领域的技术人员均可能利用上述阐述的技术方案对本发明加以修改或将其修改为等同的技术方案。因此，依据本发明的技术方案
所进行的任何简单修改或等同置换，尽属于本发明要求保护的范围。


技术特征：
1.一种菌剂及其对对氯苯胺污染环境的修复，其特征在于，该菌剂由(rhodococcus zopfii)dcb-5制成，菌株保藏于中国石油大学(华东)分子实验室保藏中心，地址：中国，青岛，中国石油大学(华东)。2.根据权利要求1所述菌剂，其特征在于，所述菌剂的制备方法步骤如下：将权利要求1所述的(rhodococcus zopfii)dcb-5接种于液体lb培养基中，35℃培养7h后，将发酵液离心后去掉上清液，经过磷酸盐缓冲液清洗3次后收集菌体，最后将收集的菌体于-20℃冰箱过夜预冻后经过真空冷冻干燥即得菌剂。3.根据权利要求2所述的菌剂的应用，其特征在于，用于有机氯污染环境的生物修复中，尤其在水体和土壤的对氯苯胺污染生物修复中具有广阔应用前景。

技术总结
本发明属于环境中对氯苯胺污染环境生物修复技术领域，具体涉及一种菌剂、菌剂的制备方法及其在有机氯污染环境领域的应用。本发明提供了1株对氯苯胺降解菌，为红球菌(Rhodococcus zopfii DCB-5)，从南京某药厂附近有机氯污染土壤中筛选而得。本发明所述菌剂对于对氯苯胺具有良好降解率，制备成的菌剂在水体及土壤有机氯污染环境的生物修复方面具有良好的应用前景。有良好的应用前景。


技术研发人员：孙烁 徐晨菲 乔晨露 郭龙飞 唐明璐 李婧 唐方 赵朝成 刘其友
受保护的技术使用者：中国石油大学（华东）
技术研发日：2022.04.25
技术公布日：2022/7/29