一种基于MIRA荧光法快速检测金黄色葡萄球菌的检测方法

一种基于mira荧光法快速检测金黄色葡萄球菌的检测方法
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体为一种基于mira荧光法快速检测金黄色葡萄球菌的检测方法。


背景技术：

2.近几年，因食源性病源微生物污染生鲜肉而导致的食物中毒事件时有发生。目前食源性病源微生物检测方法从传统的选择培养基筛选，到基于核酸的pcr检测，发展到基因探针和生物传感器等，这些方法均存在着耗时长、前期处理复杂、依赖昂贵仪器设备等局限性，无法对生鲜食品中食源性病原微生物进行快速检测。且由于抗生素的滥用用，细菌耐药性增高，而传统的检测方法容易出现假阴性结果，所以建立快速、简便、特异、灵敏、低耗且适用的快速检测诊断致病微生物的方法十分有必要。
3.本研究以常见的食源性致病菌金黄色葡萄球菌为对象，拟通过多酶恒温快速扩增技术(mira)建立这该致病菌的快速可视化检测方法，对及时有效控制病原菌传播、预防食物中毒、减少食源性疾病事件的发生具有重要的意义。


技术实现要素：

4.(一)解决的技术问题
5.针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于mira荧光法快速检测金黄色葡萄球菌的检测方法，解决了目前的检测方法存在着耗时长、前期处理复杂、依赖昂贵仪器设备等局限性，无法对生鲜食品中食源性病原微生物进行快速检测的问题。
6.(二)技术方案
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于mira荧光法快速检测金黄色葡萄球菌的检测方法，包括以下步骤：
8.s1、细菌培养：将-80℃保存的金黄色葡萄球菌菌液取出，使用“四区划线法”于lb固体培养基和血平板培养基上进行复苏培养，在37℃的恒温培养箱中培养12-16h，挑取单菌落于1.5ml的lb液体培养基中，在37℃的恒温摇床中培养3-6h后，以1∶100比例转接到20ml的液体培养基中，培养至菌液混浊备用；
9.s2、细菌基因组dna提取：使用某生化科技有限公司的细菌基因组dna提取试剂盒(离心柱型)提取细菌基因组；
10.s3、引物与探针设计：在genbank中检索金黄色葡萄球菌的nuc基因，通过meglign软件分析比对，确定各自的高度特异性保守片段区域，在primer premier 5的辅助下，设计nuc基因特异性mira引物和探针；并根据金黄色葡萄球菌nuc基因片段大小为687bp，在primer premier 5的辅助设计下设计全长引物，进行pcr扩增；
11.s4、pcr产物回收及纯化：根据sanprep柱式dna胶回收试剂盒说明书提取步骤操作，把扩增产物回收备用；
12.s5、标准质粒的构建：根据pmd
tm
19-t vector cloning kit使用说明书，构建
pmd19-t-nuc重组质粒；
13.s6、重组质粒鉴定：取部分培养菌液进行测序服务，并在ncbi网站的blast功能和meglign软件与基因全长进行比对分析；
14.s7、质粒dna小量抽提：根据sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒使用说明书，提取上述构建的pmd19-t-nuc重组质粒备用；
15.s8、金黄色葡萄球菌荧光检测体系建立
16.s81、体系建立：根据dna恒温快速扩增试剂盒(荧光型)使用说明书，进行荧光结果检测体系建立；
17.s82、引物筛选：使用上一步建立的荧光结果检测体系，对金黄色葡萄球菌的nuc基因的引物进行筛选实验，对比结果；
18.s83、温度优化：使用第一步建立的荧光结果检测体系，反应温度分别设置为38℃、39℃、40℃、41℃和42℃，筛选s.aureus体系的最佳反应温度对并用于后续实验。
19.优选的，所述步骤s2的具体步骤为：
20.s21、取备用的菌液5ml，9000rpm离心2min，留取沉淀物；
21.s22、在沉淀物中加入菌液∶ga溶液＝25∶1的ga溶液，使用振荡器悬浊溶液；
22.s23、在管中加入ga溶液∶proteunase k溶液＝10∶1的proteunase k溶液，吹打混匀；
23.s24、继续加入proteunase k溶液∶gb溶液＝1∶1的gb溶液，震荡混匀，在70℃水浴锅中静放8-10min，待试管中液体澄清，瞬间离心；
24.s25、再加入gb溶液∶无水乙醇＝1∶11的无水乙醇，震荡混匀要充分；
25.s26、将混匀的溶液(包括絮状物)加入到吸附柱-收集管cb3中，11000rpm离心30s，丢掉收集管中液体；
26.s27、在吸附柱-收集管cb3中加入无水乙醇∶gd溶液＝11∶25的gd溶液，11000rpm离心30s，丢掉收集管中液体；
27.s28、在吸附柱-收集管cb3中加入gd溶液∶pw漂洗液＝5∶6的pw漂洗液，11000rpm离心30s，丢掉收集管中液体；
28.s29、重复上一步；
29.s210、吸附柱-收集管cb3空管离心3min，丢掉收集管中液体后，在室内的温度静置数分钟，用来蒸发吸附柱上的漂洗液；
30.s211、最后取一干净离心管，将吸附柱放在干净离心管中，向吸附柱中间部分加入50-200μl的te溶液，11000rpm离心3min，收集得到试管中的液体。
31.优选的，所述步骤s3中的pcr体系为20μl，其中mix 10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，dna模板2μl，灭菌水6μl。
32.优选的，所述方法还包括步骤s9、灵敏度试验：测量出质粒浓度，根据拷贝数浓度(copies/μl)＝[6.02
×
10
23
×
浓度(ng/μl)
×
10-9
]/[dna长度
×
660]公式，计算拷贝数浓度，以10倍稀释浓度分别稀释nuc基因重组质粒(pmd19-t-nuc)，稀释浓度为100copies/μl、101copies/μl、102copies/μl、103copies/μl、104copies/μl、105copies/μl，并使用灭菌水(ddh2o)作为实验的阴性对照，反应体系使用本实验建立的体系进行灵敏度验证并与pcr检测技术进行比较。
[0033]
优选的，所述方法还包括步骤s10、特异性试验：使用提取的金黄色葡萄球菌的目的基因dna保守片段构建的质粒作为阳性样本，葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、禽致病性大肠杆菌、单增李斯特菌、英诺克李斯特菌、粪肠球菌的基因组dna作为模板，ddh2o作为阴性对照，进行金黄色葡萄球菌的特异性实验。
[0034]
优选的，所述方法还包括步骤s11、重复性试验：以重组质粒pmd19-t-nuc的103copies/μl、104copies/μl和105copies/μl为模板，每个浓度设置3个重复，进行组内重复性试验，每个浓度的质粒分别进行3次独立的试验，进行组间的重复性试验，统计组内和组间重复性试验的变异系数(cv值)，以评价mira技术检测方法的重复性和稳定性。
[0035]
优选的，所述方法还包括步骤s12、临床样本检测：以51份金黄色葡萄球菌临床菌液样本基因组dna为模板，ddh2o作为阴性对照，使用本研究建立的金黄色葡萄球菌mira检测方法检测，以评价mira技术临床检测的可行性。
[0036]
(三)有益效果
[0037]
本发明提供了一种基于mira荧光法快速检测金黄色葡萄球菌的检测方法，具备以下有益效果：
[0038]
本发明通过mira技术来进行金黄色葡萄球均的检测，具有检测时间短、检测温度低、仪器设备要求不高、特异性强、灵敏度高等优点，从而提供了分子生物学的检测效率，降低了检测门槛，节省了检测的时间，对及时有效控制病原菌传播、预防食物中毒、减少食源性疾病事件的发生具有重要的意义。
附图说明
[0039]
图1为本发明中pmd19-t-nuc质粒基因pcr扩增结果图；
[0040]
图2为本发明中金黄色葡萄球菌mira引物筛选扩增结果图；
[0041]
图3为本发明中金黄色葡萄球菌在37℃下mira反应荧光扩增曲线图；
[0042]
图4为本发明中金黄色葡萄球菌在38℃下mira反应荧光扩增曲线图；
[0043]
图5为本发明中金黄色葡萄球菌在39℃下mira反应荧光扩增曲线图；
[0044]
图6为本发明中金黄色葡萄球菌在40℃下mira反应荧光扩增曲线图；
[0045]
图7为本发明中金黄色葡萄球菌在41℃下mira反应荧光扩增曲线图；
[0046]
图8为本发明中金黄色葡萄球菌mira(荧光型)灵敏度曲线图；
[0047]
图9为本发明中金黄色葡萄球菌mira(荧光型)灵敏度紫外灯下目视图；
[0048]
图10为本发明中金黄色葡萄球菌mira(荧光型)特异性灵敏度曲线图；
[0049]
图11为本发明中金黄色葡萄球菌mira(荧光型)特异性灵敏度紫外灯下目视图；
[0050]
图12为本发明中部分s.aureus mira检测结果图。
具体实施方式
[0051]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0052]
本发明提供一种技术方案：一种基于mira荧光法快速检测金黄色葡萄球菌的检测
方法，包括以下步骤：
[0053]
s1、细菌培养：将-80℃保存的金黄色葡萄球菌菌液取出，使用“四区划线法”于lb固体培养基和血平板培养基上进行复苏培养，在37℃的恒温培养箱中培养12-16h，挑取单菌落于1.5ml的lb液体培养基中，在37℃的恒温摇床中培养3-6h后，以1∶100比例转接到20ml的液体培养基中，培养至菌液混浊备用；
[0054]
s2、细菌基因组dna提取：使用某生化科技有限公司的细菌基因组dna提取试剂盒(离心柱型)提取细菌基因组，具体为：
[0055]
s21、取备用的菌液5ml，9000rpm离心2min，留取沉淀物；
[0056]
s22、在沉淀物中加入菌液∶ga溶液＝25∶1的ga溶液，使用振荡器悬浊溶液；
[0057]
s23、在管中加入ga溶液∶proteunase k溶液＝10∶1的proteunase k溶液，吹打混匀；
[0058]
s24、继续加入proteunase k溶液∶gb溶液＝1∶1的gb溶液，震荡混匀，在70℃水浴锅中静放8-10min，待试管中液体澄清，瞬间离心；
[0059]
s25、再加入gb溶液∶无水乙醇＝1∶11的无水乙醇，震荡混匀要充分；
[0060]
s26、将混匀的溶液(包括絮状物)加入到吸附柱-收集管cb3中，11000rpm离心30s，丢掉收集管中液体；
[0061]
s27、在吸附柱-收集管cb3中加入无水乙醇∶gd溶液＝11∶25的gd溶液，11000rpm离心30s，丢掉收集管中液体；
[0062]
s28、在吸附柱-收集管cb3中加入gd溶液∶pw漂洗液＝5∶6的pw漂洗液，11000rpm离心30s，丢掉收集管中液体；
[0063]
s29、重复上一步；
[0064]
s210、吸附柱-收集管cb3空管离心3min，丢掉收集管中液体后，在室内的温度静置数分钟，用来蒸发吸附柱上的漂洗液；
[0065]
s211、最后取一干净离心管，将吸附柱放在干净离心管中，向吸附柱中间部分加入50-200μl的te溶液，11000rpm离心3min，收集得到试管中的液体；
[0066]
s3、引物与探针设计：在genbank中检索金黄色葡萄球菌的nuc基因(genbank id:v01281.1)，通过meglign软件分析比对，确定各自的高度特异性保守片段区域，在primer premier 5的辅助下，设计nuc基因特异性mira引物(表1)和探针(表2)；
[0067]
表1nuc的引物序列
[0068]
[0069]
表2mira技术的探针序列
[0070][0071]
并根据金黄色葡萄球菌nuc基因片段大小为687bp，在primer premier 5的辅助设计下设计全长引物，进行pcr扩增，pcr体系为20μl，其中mix 10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，dna模板2μl，灭菌水6μl，反应程序见表3；
[0072]
表3目的片段的pcr扩增程序
[0073][0074][0075]
s4、pcr产物回收及纯化：根据sanprep柱式dna胶回收试剂盒说明书提取步骤操作，把扩增产物回收备用；
[0076]
s5、标准质粒的构建：根据pmd
tm
19-t vector cloning kit使用说明书，构建pmd19-t-nuc重组质粒；
[0077]
s6、重组质粒鉴定：取部分培养菌液进行测序服务，并在ncbi网站的blast功能和meglign软件与基因全长进行比对分析；
[0078]
s7、质粒dna小量抽提：根据sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒使用说明书，提取上述构建的pmd19-t-nuc重组质粒备用；
[0079]
s8、金黄色葡萄球菌荧光检测体系建立
[0080]
s81、体系建立：根据dna恒温快速扩增试剂盒(荧光型)使用说明书，进行荧光结果检测体系建立；
[0081]
s82、引物筛选：使用上一步建立的荧光结果检测体系，对金黄色葡萄球菌的nuc基因的引物进行筛选实验，对比结果，荧光结果检测体系见表4；
[0082]
表4反应体系
[0083][0084][0085]
s83、温度优化：使用第一步建立的荧光结果检测体系，反应温度分别设置为38℃、39℃、40℃、41℃和42℃，筛选s.aureus体系的最佳反应温度对并用于后续实验；
[0086]
s9、灵敏度试验：测量出质粒浓度，根据拷贝数浓度(copies/μl)＝[6.02
×
10
23
×
浓度(ng/μl)
×
10-9
]/[dna长度
×
660]公式，计算拷贝数浓度，以10倍稀释浓度分别稀释nuc基因重组质粒(pmd19-t-nuc)，稀释浓度为100copies/μl、101copies/μl、102copies/μl、103copies/μl、104copies/μl、105copies/μl，并使用灭菌水(ddh2o)作为实验的阴性对照，反应体系使用本实验建立的体系进行灵敏度验证并与pcr检测技术进行比较；
[0087]
s10、特异性试验：使用提取的金黄色葡萄球菌的目的基因dna保守片段构建的质粒作为阳性样本，葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、禽致病性大肠杆菌、单增李斯特菌、英诺克李斯特菌、粪肠球菌的基因组dna作为模板，ddh2o作为阴性对照，进行金黄色葡萄球菌的特异性实验；
[0088]
s11、重复性试验：以重组质粒pmd19-t-nuc的103copies/μl、104copies/μl和105copies/μl为模板，每个浓度设置3个重复，进行组内重复性试验，每个浓度的质粒分别进行3次独立的试验，进行组间的重复性试验，统计组内和组间重复性试验的变异系数(cv值)，以评价mira技术检测方法的重复性和稳定性；
[0089]
s12、临床样本检测：以51份金黄色葡萄球菌临床菌液样本基因组dna为模板，ddh2o作为阴性对照，使用本研究建立的金黄色葡萄球菌mira检测方法检测，以评价mira技术临床检测的可行性.
[0090]
实验结果
[0091]
1、基因重组质粒构建
[0092]
1.1、pmd-19t-nuc重组质粒构建：金黄色葡萄球菌nuc基因组在pcr扩增之后，针对扩增的片段使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳验证，鉴定结果如图1所示。与预期相符的目的基因片段在蓝光切胶仪的辅助下切取目的条带，进行胶回收实验，并与pmd19-t载体连接，转化到dh5α中。
[0093]
1.2、重组质粒鉴定测序：与某生物科技有限公司合作被提供测序服务，测序结果在ncbi的blast网站、genbank基因库和meglign软件的辅助下进行序列比对，结果显示，测序结果与所需目的基因片段的对应率达到100％，表明目的基因重组质粒构建合格，无变
异，可作为阳性对照使用。
[0094]
2、nuc基因的引物筛选：按照dna恒温快速扩增试剂盒(荧光型)试剂盒使用说明书，使用primer premier 5引物设计软件针对nuc基因设计4条上游引物、2条下游引物以及一条荧光探针，将上下游引物随机组合，经筛选得nuc-mira-f1和nuc-mira-r2效果最佳。扩增结果如图2。
[0095]
3、温度优化：反应温度分别设置为37℃、38℃、39℃、40℃和41℃进行筛选，不同温度下mira反应荧光扩增曲线如图3-7所示，最佳反应温度为38℃。
[0096]
4、金黄色葡萄球菌的灵敏度实验：金黄色葡萄球菌的nuc基因重组质粒在lb培养液中过夜培养，使用sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒提取质粒后，以10倍的稀释倍数对提取的重组质粒进行稀释，用mira技术的荧光结果如图8-9。mira技术荧光结果显示检测金黄色葡萄球菌灵敏度达到了102copies/μl。
[0097]
5、金黄色葡萄球菌的特异性实验：使用dna质粒小量提取试剂盒提取金黄色葡萄球菌nuc基因重组质粒pmd19-t-nuc，用mira技术进行特异性实验。mira技术特异性结果的凝胶电泳鉴定和荧光结果鉴定图如图10-11。结果显示，金黄色葡萄球菌的nuc基因扩增成功，其他的病原菌均为出现扩增曲线，无交叉反应。
[0098]
6、金黄色葡萄球菌的重复性试验：本研究建立的基于mira技术检测金黄色葡萄球菌的nuc基因，以103copies/μl、104copies/μl和105copies/μl为模板进行组内和组间的重复性试验。结果如表5所示，组内变异系数为0.627％-0.950％，组间变异系数为1.446％-2.325％，。两者变异系数在3％以内，表明建立的荧光结果的mira技术有较高的稳定性和重复性。
[0099]
表5金黄色葡萄球菌的mira技术荧光检测组内和组间重复性试验
[0100][0101]
7、金黄色葡萄球菌的临床样本检测：以51份金黄色葡萄球菌临床样本基因组dna为模板，ddh2o为阴性对照，mira方法检测荧光扩增曲线见图12；统计试验数据得mira方法检测51份阳性，说明本研究建立的金黄色葡萄球菌mira检测方法临床适用性良好。
[0102]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0103]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换
和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。