一株固定CO2产L-苏氨酸的大肠杆菌工程菌及应用

一株固定co2产l-苏氨酸的大肠杆菌工程菌及应用
技术领域
1.本发明涉及一株固定co2产l-苏氨酸的大肠杆菌工程菌及应用，属于发酵工程领域。


背景技术：

2.全球范围内的人类活动导致大气co2浓度不断升高。据统计，2019年全球co2排放量达到368亿吨，预计到2050年排放量将增至500亿吨/年。快速增强的大气co2浓度已经引起了诸多气候变化，例如温室效应、冰川融化和土地干旱等。因此迫切需要发展有效的co2封存技术，以增强co2的捕获或者减少co2的释放。传统的基于物理和化学方法的二氧化碳回收技术，包括二氧化碳捕获(如后燃烧和氧燃料燃烧)、二氧化碳分离(如吸附和膜分离)和二氧化碳储存(如盐碱含水层、近海地质构造)，对于减缓二氧化碳具有重要意义。但是这些方法存在一些明显的不足，如运行成本高、产生对人体健康和环境都有害的降解产物、能耗大。相比之下，微生物固定co2是缓解温室效应的一种绿色环保途径，还可以同时生产高附加值化学品。
3.l-苏氨酸是人体所必需的八种氨基酸中的之一。苏氨酸在人体内和动物体内不能合成，但是在生命过程中发挥重要的作用。l苏氨酸已被广泛应用在食品产业、医疗制药行业和饲料行业中。在食品行业中，l苏氨酸作为一种食品强化剂，补充被破坏的营养元素，同时， l苏氨酸用于人们常食用的糕点和牛奶之中，发挥抗氧化作用，同时可以用作食品的增香剂。医疗行业领域中，l-苏氨酸具有人体发育抗脂肪肝药用效能，是复合氨基酸输液中的一个成分，同时，苏氨酸又是制造一类高效低过敏的抗生素-单酰胺菌素的原料。在饲料行业，l-苏氨酸是猪饲料的第二限制氨基酸和家禽饲料的第三限制氨基酸，添加l-苏氨酸可以大大提高饲料效价，提供给动物更加充分全面的营养。我国是l-苏氨酸主要苏氨酸生产国和出口国，产量占到全球的90％左右。目前，大肠杆菌由于遗传学清晰、基因操作简单、易于培养、周期短和培养条件粗放等优点，已成为直接法发酵生产l-苏氨酸的主要菌株。通过在大肠杆菌中引入co2固定途径，能够提高葡萄糖发酵生产l-苏氨酸的得率，同时为效缓解温室效应提供新的方案。


技术实现要素：

4.本发明提供了一株产l-苏氨酸的大肠杆菌(escherichia coli)fmme-aa5，所述大肠杆菌已于2022年5月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 2022562，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
5.本发明还提供了所述e.coli fmme-aa5在作为底盘细胞构建基因工程菌中的应用。
6.本发明还提供了一株产l-苏氨酸的重组大肠杆菌，在所述e.coli fmme-aa5中过表达甲酸脱氢酶(fdh)、乙酰辅酶a合成酶(acs)、酰化乙醛脱氢酶(acdh)、甲醛裂合酶(fls)、二羟基丙酮激酶(dhak)和亚磷酸脱氢酶(ptxd)。
7.在一种实施方式中，所述甲酸脱氢酶基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
8.在一种实施方式中，所述乙酰辅酶a合成酶的genbank登录号为np_418493.1，编码所述乙酰辅酶a合成酶的基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
9.在一种实施方式中，编码所述酰化乙醛脱氢酶的基因序列如seq id no.3所示，编码所述甲醛裂合酶的基因序列如seq id no.4所示，编码所述二羟基丙酮酸激酶的基因序列如 seq id no.5所示。
10.在一种实施方式中，所述甲酸脱氢酶、乙酰辅酶a合成酶、酰化乙醛脱氢酶、甲醛裂合酶和二羟基丙酮激酶是由同尾酶组装的方式逐步连接到载体per上进行过量表达。
11.在一种实施方式中，所述亚磷酸脱氢酶来源于肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)或变形杆菌(proteobacteria)。
12.在一种实施方式中，所述亚磷酸脱氢酶的编码基因含有seq id no.6或seq id no.7所示的核苷酸序列。
13.在一种实施方式中，所述亚磷酸脱氢酶基因以质粒pcdr为表达载体。
14.本发明还提供所述重组大肠杆菌在发酵生产l-苏氨酸方面的应用。
15.在一种实施方式中，所述应用是将大肠杆菌工程菌活化培养10-12h，获得种子液；再将种子液按照12％接种量接种到发酵罐中，发酵温度为35-37℃，通气量为1-2vvm，搅拌转速 400-700r/min，然后搅拌和转速关联溶氧控制在10-20％，并加入可供给co2的ph中和剂以控制发酵液ph6.5-7.0。
16.在一种实施方式中，所述ph中和剂是含终浓度为4mol/l khco3和5mol/l氨水的溶液。
17.在一种实施方式中，所述ph中和剂是含终浓度为4mol/l khco3和1mol/l koh的溶液。
18.在一种实施方式中，所述ph中和剂是含终浓度为4mol/l k2co3和5mol/l氨水的溶液。
19.在一种实施方式中，用于种子培养的种子培养基含有：胰蛋白胨10g/l，酵母浸粉5g/l，玉米浆5ml/l，葡萄糖3g/l，nacl 0.5g/l，kh2po
4 2g/l，mgso
4 0.5g/l。
20.在一种实施方式中，所述发酵使用的发酵培养基含有：葡萄糖40-50g/l，玉米浆40ml/l， kh2po
4 2g/l，甜菜碱1.0g/l，mgso4·
7h2o 200-800mg/l，feso4·
7h2o 20-40mg/l， mnso4·
h2o 4-20mg/l，生物素0.04-0.1mg/l。
21.在一种实施方式中，发酵过程中当葡萄糖浓度低于2g/l时，补加500-800g/l葡萄糖补料液，使葡萄糖浓度维持在1-2g/l。
22.本发明还要求保护所述大肠杆菌或所述方法在生产含l-苏氨酸的产品中的应用。
23.有益效果：
24.(1)本发明筛选了一株可生产l-苏氨酸的菌株e.coli fmme-aa5，该菌株在发酵培养基中发酵42h可生产125g/l l-苏氨酸，葡萄糖得率为0.52g/g，且传代稳定性好，可作为大肠杆菌工程菌的底盘细胞；
25.(2)本发明以l-苏氨酸的菌株e.coli fmme-aa5为出发菌株，利用代谢工程手段引入 co2固定途径，并强化co2的固定系统中酶的表达效率，使构建获得的基因工程菌e.colifmme-aa5-a和e.coli fmme-aa5-b的l-苏氨酸产量达到108.8-109.6g/l，葡萄糖得率提高
至0.59-0.63g/g。
26.(3)本发明还通过优化发酵过程中co2的供给，使基因工程菌在发酵42h后l-苏氨酸的产量达到145.0g/l，l-苏氨酸对葡萄糖得率为从0.52g/g提高至0.65g/g，产品得率高、产量大，不仅能够对有效缓解温室效应提供新的方案，而且可以同时为其他氨基酸与有机酸产品的生产提供新的思路，利用微生物将废弃物高值化为有用工业化学品。
27.生物材料保藏
28.大肠杆菌(escherichia coli)fmme-aa5，分类命名为escherichia coli fmme-aa5，已于2022年5月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 2022562，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
附图说明
29.图1为大肠杆菌co2固定途径的设计路线图。
具体实施方式
30.细菌选择性培养基：牛肉膏10g/l，蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl 3g/l，制霉菌素(nystatin)30mg/l，放线菌酮(cycloheximide)30mg/l，0.2％溴百里酚蓝4ml/l，琼脂粉15 g/l，p h 7.0-7.2。
31.种子与富集培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母浸粉5g/l，nacl 0.5g/l。
32.发酵培养基：葡萄糖40g/l，玉米浆40ml/l，kh2po
4 2g/l，mgso4·
7h2o mg/l， feso4·
7h2o 20mg/l，mnso4·
h2o 10mg/l，生物素0.1mg/l，20g/l caco3、(naoh调节培养基ph到6.75)。
33.l-苏氨酸检测方法：色谱柱为aglient zorbax sb-aq 250
×
4.6mm；流动相a为0.01 mol/l kh2po4溶液，用koh调ph至5.3；流动相b为乙腈、甲醇与流动相a按5:3:1的体积比混合后用乙酸调ph至5.3。利用柱前在线衍生方法，衍生剂为opa，柱温：35℃，流速为1.0ml/min进行梯度洗脱，检测波长：uv 254nm；fld：激发波长330nm/发射波长465nm。
34.细胞浓度测定：发酵液适当稀释后使用紫外分光光度计在波长600nm的条件下测定 od
600
。
35.葡萄糖浓度测定：取发酵液12000r/min离心8min，收集上清液进行适当稀释，使用m-100 生物传感器测定葡萄糖浓度。
36.商业化质粒产品的购买来源：per质粒是petm6(购自addgene，#49795)改造启动子区域后获得的质粒，pcdr质粒是pcdm4(购自addgene，#49796)改造启动子区域后获得的质粒，均公开于公开号为cn 110951660 b的专利中。
37.实施例1：产l-苏氨酸的大肠杆菌的筛选与鉴定
38.1.菌株的富集培养
39.取氨基发酵提取车间的取5-15cm深的土壤污泥，加入到有玻璃珠的无菌生理盐水中震荡 10min，然后转至总体积为200ml的富集培养基中，30-37℃厌氧培养过夜后按照30％接种量转接一次。
40.2.菌株的初筛
41.将富集培养后的菌液梯度稀释，涂布于细菌选择琼脂培养基，30-37℃培养24h后
部分菌落周围的平板颜色变为黄色，挑取黄色变色圈大的菌株进行平板菌落纯化后转入斜面保藏和进行初筛分析用；对初筛的菌株135株接种于24深孔板的种子培养基中37℃震荡培养24h，按照12％接种量转接于24深孔板中的发酵培养基中，37℃振荡培养48-64h，使用薄层层析法(tcl)定量检测苏氨酸，共计59株菌可以生产苏氨酸。
42.3.菌株的复筛
43.将初筛获得的产苏氨酸菌的菌株取一环接种到装有种子液20ml/250ml三角瓶中，置于往复式摇床上，37℃，180r/min培养24h。然后吸取1ml种子液接种于装有20ml发酵培养基的250m l三角瓶中，37℃，200r/min振荡培养48h。进一步使用高效液相色谱(hplc) 检测苏氨酸的含量，得到一株高产苏氨酸的菌株fmme-aa5，苏氨酸摇瓶产量达到15.9g/l。
44.4.苏氨酸生产菌株的鉴定
45.(1)菌落特征及菌体形态
46.菌株fmme-aa5梯度稀释涂布于种子琼脂培养基，培养过夜后形成圆形微凸起、表面光滑湿润、边缘整齐的白色单菌落。镜检显示菌体为短小杆状，无芽孢，革兰氏染色为阴性。
47.(2)16s rdna序列分析
48.按细菌dna提取试剂盒的说明提取基因组dna，以基因组dna为模板，用细菌16srdna通用引物进行pcr扩增，扩增产物送至公司进行测序，测序结果在ncbi中进行比对，结果显示该菌株为大肠杆菌。
49.综合菌落形态特征和16s rrna分析，确认该菌株为大肠杆菌，命名为e.colifmme-aa5。该菌株已于2022年5月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 cctcc no:m 2022562，保藏地址为中国湖北武汉，武汉大学。
50.5.l-苏氨酸发酵罐发酵验证
51.种子培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母浸粉5g/l，玉米浆5ml/l，葡萄糖3g/l，nacl 0.5 g/l，kh2po
4 2g/l，mgso
4 0.5g/l。
52.发酵培养基：葡萄糖40-50g/l，玉米浆40ml/l，kh2po
4 2g/l，甜菜碱1.0g/l， mgso4·
7h2o 500mg/l，feso4·
7h2o 40mg/l，mnso4·
h2o 20mg/l，生物素0.04-0.1 mg/l。
53.种子培养条件：从甘油管中取e.coli fmme-aa5菌液200μl接入装有30ml/500ml种子培养基的三角瓶中，37℃，往复式摇床100r/min培养10-12h至对数中后期，获得种子液。
54.发酵培养条件：将种子液按照12％接种量接种到含2l培养基的5l发酵罐中，发酵温度为37℃，通气量为1-2vvm，搅拌转速400-700r/min，搅拌和转速关联溶氧控制在20％，氨水用于控制发酵液ph 6.5-7.0；发酵过程中当葡萄糖浓度低于2g/l时，补加500-800g/l 葡萄糖补料液，使葡萄糖浓度维持在1-2g/l。e.coli fmme-aa5菌株在发酵培养基中发酵 42h，l-苏氨酸产量可达125.0g/l，传代20代产量仍保持在95％以上。
55.实施例2：构建能够固定co2生产l-苏氨酸的大肠杆菌工程菌株
56.(1)fdh、acs、acdh、fls和dhak蛋白的过表达
57.根据ncbi数据库中提供的永达尔梭菌(clostridium ljungdahlii)甲酸脱氢酶基因序列设计扩增引物fdh-s与fdh-a(表1)，以永达尔梭菌基因组为模板，扩增引物fdh-s和fdh-a 扩增出fdh蛋白的基因序列(如seq id no.1所示)，胶回收后采用一步同源重组的方式连接到质粒per的bglii和xhoi位点之间，得到重组质粒per-fdh；
58.乙酰coa合成酶基因序列设计扩增引物acs-s与acs-a，以大肠杆菌mg1655的基因组为模板，扩增acs蛋白的编码基因序列(如seq id no.2所示)，胶回收后采用一步同源重组的方式连接到质粒per的bglii和xhoi位点之间，得到重组质粒per-acs；
59.采用基因合成的方式，分别合成如seq id no.3所示的acdh、如seq id no.4所示的 fls和如seq id no.5所示的dhak基因片段，然后分别以酶切(bglii和xhoi)连接的方式连接到质粒per上，分别得到重组质粒per-acdh、per-fls和per-dhak；采用同尾酶组装技术(参考论文《a synthetic biology platform for engineering metabolic pathways in e. coli》)，分别将上述构建获得的五个质粒(per-fdh、per-acs、per-acdh、per-fls和per-dhak)逐步组装成一个质粒per-cf5a(构建方法参见公开号为cn 110951660 b的专利)。
60.表1蛋白过量表达引物序列
61.引物名称引物序列fdh-sagatatacatatggcagatctgatgaaaagtatactaactacttgtccttattgtfdh-aggtttctttaccagactcgagttaagcgtctttacgcatactcttttacs-sagatatacatatggcagatctgatgagccaaattcacaaacacaccacs-aggtttctttaccagactcgagttacgatggcatcgcgatagc
62.(2)ptxd蛋白的过表达
63.采用基因合成的方式，合成seq id no.6所示的肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae) 来源的亚磷酸脱氢酶ptxd基因片段，然后以酶切连接的方式连接到质粒pcdr的bglii和xhoi 位点之间，得到重组质粒pcdr-paptxd；
64.采用基因合成的方式，合成如seq id no.7所示的变形杆菌(proteobacteria)来源的亚磷酸脱氢酶ptxd基因片段，然后以酶切连接的方式分别连接到质粒pcdr的bglii和xhoi 位点之间，得到重组质粒pcdr-pbptxd。
65.(3)引入co2固定途径的基因工程菌株构建
66.将上述得到的两个质粒per-cf5a和pcdr-paptxd转化至实施例1的e.colifmme-aa5的感受态细胞中，涂布于含有壮观霉素和氨苄青霉素的双抗性平板上，获得的转化子即为本发明所述的大肠杆菌基因工程菌，命名为e.coli fmme-aa5-a。
67.同样的将两个质粒per-cf5a和pcdr-pbptxd转化至实施例1的e.coli fmme-aa5 的感受态细胞中，涂布于含有壮观霉素和氨苄青霉素的双抗性平板上，获得的转化子即为本发明所述的大肠杆菌基因工程菌，命名为e.coli fmme-aa5-b。
68.将per空质粒与pcdr转化至实施例1的e.coli fmme-aa5的感受态细胞，获得工程菌株e.coli fmme-aa5-0，并作为对照菌株以验证异源co2固定途径对l-苏氨酸合成的影响。
69.实施例3：基因工程菌株发酵生产l-苏氨酸
70.种子培养基与发酵培养基同实施例1
71.种子培养条件：种子培养基中加入12.5mg/l壮观霉素和50mg/l氨苄青霉素，从甘油管中取菌株200μl接入装有30ml/500ml种子培养基的三角瓶中，37℃，往复式摇床100r/min 培养10-12h至对数中后期，获得种子液。
72.发酵培养条件：将种子液按照12％接种量接种到含2l培养基的5l发酵罐中，发酵温度为37℃，通气量为1-2vvm，搅拌转速400-700r/min，搅拌和转速关联溶氧控制在20％；
发酵过程中当葡萄糖浓度低于2g/l时，补加500-800g/l葡萄糖补料液，使葡萄糖浓度维持在 1-2g/l；使用4m nahco3用于控制发酵液ph 6.5-7.0，发酵液中的hco
3-与co2之间会发生快速的可逆反应，同时hco
3-还可以作为酸碱中和剂控制发酵液的ph，因此，通过向培养基中添加khco3可以创造co2环境。
73.按照上述方法，分别将实施例1的e.coli fmme-aa5、实施例2构建的e.colifmme-aa5-a、e.coli fmme-aa5-b和e.coli fmme-aa5-0分别按照上述方法进行种子培养和发酵培养，采用高效液相色谱测得e.coli fmme-aa5、e.coli fmme-aa5-a、e.colifmme-aa5-b和e.coli fmme-aa5-0发酵42h时发酵液上清l-苏氨酸的产量，结果显示， e.coli fmme-aa5-a的葡萄糖得率为0.63g/g，葡萄糖得率相较于e.coli fmme-aa5、e.colifmme-aa5-0提高了21.1％，e.coli fmme-aa5-b的葡萄糖仅提高至0.59g/g，说明 pseudomonas aeruginosa来源的ptxd酶更适用于构建的co2固定系统。
74.表2不同菌株发酵生产l-苏氨酸
75.菌株名称发酵周期(h)l-苏氨酸(g/l)葡萄糖得率(g/g)下罐体积(l)e.coli fmme-aa542105.90.523.38e.coli fmme-aa5-042100.60.523.42e.coli fmme-aa5-a42109.60.633.43e.coli fmme-aa5-b42108.80.593.44
76.实施例3：不同ph中和剂对l-苏氨酸生产的影响
77.l-苏氨酸发酵过程中需要固定co2用于l-苏氨酸的合成，发酵过程在控制ph时可以选用一种或者几种碳酸盐作为ph中和剂，以达到在控制ph的同时，为l-苏氨酸的合成提供 co2的效果。
78.分别以8mol/l氨水、4mol/l khco3、4mol/l k2co3、终浓度为4mol/l khco3和终浓度为1mol/l koh的混合液、终浓度为4mol/l k2co3和终浓度为5mol/l氨水的混合液、终浓度为4mol/l khco3和终浓度为5mol/l氨水的混合液作为ph中和剂(表3)，以e.colifmme-aa5-a为发酵菌株进行发酵，种子培养和其余发酵条件与实施例2中相同。结果显示， e.coli fmme-aa5-a使用8m氨水作为ph中和剂时，产量可以达到125.0g/l；使用khco3作为中和剂，由于补加中和剂体积大，将发酵液稀释，导致产量只有105.9g/l，增加后续纯化的成本。以4m khco3 5m氨水为ph中和剂时，l-苏氨酸的产量可达到145.0g/l，同时糖酸转化率也达到0.65g/g。
79.表3不同菌株发酵生产l-苏氨酸
[0080][0081][0082]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技
术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。