一种能够降胆固醇及抑制加德纳菌的罗伊氏乳杆菌和应用的制作方法

1.本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种能够降胆固醇及抑制加德纳菌的罗伊氏乳杆菌和应用。


背景技术：

2.健康女性的阴道内是个复杂的微生物系统，内部含有多种细菌，包括处于平衡状态的益生菌和致病菌，共同作用影响阴道健康。阴道加德纳菌是引起妇科疾病的主要致病菌，在某些因素影响下，如抗生素的使用等造成阴道加德纳菌过度生长，发生阴道炎等疾病。目前的治疗主要为改善妇科疾病的症状，调整阴道微生物菌群，恢复阴道微生物平衡，以此来抵御外界致病菌的入侵。因此开发出对阴道加德纳菌有较强抑制作用的菌株尤为重要，同时菌株应该具备耐酸特性，且对阴道内部无刺激、无伤害。
3.胆固醇水平偏高可以引发心血管疾病、动脉粥样硬化，高胆固醇与许多代谢综合症相关，造成肥胖、高血压、高血脂的发生。目前降低胆固醇主要通过药物治疗，造成机体肌肉痉挛，副作用较大。一部分患者选择食疗，长期食用药物作用下降，且长期服用很难坚持，具有降胆固醇功能的益生菌制剂应运而生，目前部分益生菌胆固醇降解率普遍偏低，列举如表1。
4.罗伊氏乳杆菌广泛存在于人和动物肠道中，来源较为丰富。其益生作用繁多，可调节肠道菌群有效预防腹泻，同时可抑制病源微生物的繁殖，减少肠道疾病的发生。罗伊氏乳杆菌具有较多益生作用，其中一项为参与胆固醇代谢，服用后经过消化系统进入肠道，具备耐酸耐胆盐特性，对机体发挥益生作用。本发明中的罗伊氏乳杆菌具有降胆固醇和抑制阴道加德纳菌的作用，目前研究已分离出多种乳酸菌具有抑制阴道加德纳菌的作用，通过外用调节阴道菌群平衡，消除阴道疾病，因此开发研制降胆固醇、抑制阴道加德纳菌微生态制剂，对改善人们的健康有至关重要的意义。
5.表1现有研究公开的菌制剂胆固醇降解率
6.7.

技术实现要素：

8.针对现有技术上存在的问题，本发明目的在于提供一株耐酸能力强、耐胆盐能力强耐胃肠液能力强、具有降低胆固醇功能作用、可粘附于阴道内具有抑制阴道加德纳菌作用的罗伊氏乳杆菌及其应用，尤其在食品或药品组合物中的应用。
9.一株罗伊氏乳杆菌，所述的罗伊氏乳杆菌命名为罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri) hcs02-001,该菌株已于2020年04月27日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为cgmcc no.19746。
10.上述的一株罗伊氏乳杆菌在制备降低胆固醇药品中的应用。
11.上述的一株罗伊氏乳杆菌在制备抑制阴道加德纳菌药品中的应用。
12.一种具有降胆固醇和/或抑制阴道加德纳菌功能的药物制剂，包括有效剂量的上述的一株具罗伊氏乳杆菌和药学上可接受的辅料。
13.一种具有降胆固醇和/或抑制阴道加德纳菌功能的菌剂，是含有上述的罗伊氏乳杆菌的菌剂。
14.本发明提供罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)hcs02-001菌株或其培养液的组合物。
15.本发明提供罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)hcs02-001菌株或其培养液的食品组合物。
16.本发明提供罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)hcs02-001菌株或其培养液的药品组合物。
17.所述的食品组合物可以为保健食品组合物，发酵食品组合物。
18.所述食品组合物或药品组合物的剂型不受限制，例如，可以被制成粉剂、片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液等。
19.所述降胆固醇功能可用于食品或药品组合物，抑制阴道加德纳菌可用于药品组合物。
20.本发明所述的罗伊氏乳杆菌hcs02-001分离自内蒙古呼伦贝尔满洲里通达牧场的奶豆腐中，是一株具有降胆固醇及抑制阴道加德纳菌功能的罗伊氏乳杆菌，具有乳杆菌的典型特征，革兰氏阳性，无芽孢，细胞呈杆状，成对排列。其理化特征是：接触酶阴性，氧化酶
阴性，上述罗伊氏乳杆菌cgmcc no.19746的细胞形态和理化实验结果详见表2。
21.表2罗伊氏乳杆菌cgmcc no.19746的细胞形态和理化实验结果
[0022][0023]
通过在美国生物工程信息中心(national center for biotechnology information，ncbi)查阅国际相关的基因库，将本发明的罗伊氏乳杆菌cgmcc no.19746的16s rdna序列与genbank提交菌株序列相似性比较，鉴定菌株hcs02-001为罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)，比较结果见表3。
[0024]
表3罗伊氏乳杆菌cgmcc no.19746的16s rdna序列与genbank提交菌株序列相似性比较
[0025][0026]
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
[0027]
1、本发明罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)hcs02-001既具有降胆固醇功能，又具有抑制阴道加德纳菌功能。
[0028]
2、本发明罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)hcs02-001，降胆固醇功能的胆固醇降解率达到51.5％。
[0029]
3、本发明罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)hcs02-001，抑制阴道加德纳菌功能，发酵液和发酵上清液的3倍浓缩均出现直径14.6mm以上的抑菌圈，抑制能力较强；
[0030]
4、本发明罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)hcs02-001，具有较好的阴道细胞粘附能力，能够粘附在阴道发挥抑菌作用。
[0031]
5、本发明罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)hcs02-001具有优秀的耐酸性和耐胆盐能力。当从口摄入进入人体时，能够耐受ph值较低的胃环境和高胆盐环境以较高的存活率到达肠道。
[0032]
6、本发明罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)hcs02-001分离自食品原料奶豆腐中，菌种纯化及发酵过程的培养基及中和剂采用的组分原料均为食品级，且已经安全性验证，可用于食品发酵、冻干菌粉、食品或药品等应用。
附图说明
[0033]
图1a为罗伊氏乳杆菌hcs02-001发酵液3倍浓缩抑制加德纳菌试验结果。
[0034]
图1b为罗伊氏乳杆菌hcs02-001发酵液上清3倍浓缩抑制加德纳菌试验结果。
[0035]
图2为胆固醇标准曲线。
[0036]
本发明所述的具有降胆固醇和抑制阴道加德纳菌功能的罗伊氏乳杆菌，所述的罗伊氏乳杆菌，所述菌株命名为罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)hcs02-001，该菌株已于2020 年04月27日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为cgmccno.19746，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式
[0037]
实施例1罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)hcs02-001 cgmcc no.19746菌株的筛选
[0038]
1、初筛
[0039]
(1)样品富集：取一小勺样品加入到灭菌的缓冲蛋白胨水培养基中，混匀，放入37℃培养箱中培养24h；
[0040]
(2)富集后取500μl加入到4.5ml改良的mrs中，混匀，依次进行十倍的梯度稀释，得到10-2-10-6
稀释度，然后每个稀释度分别吸取100μl加入到改良mrs固体平板表面，用涂布棒进行涂布，将10-1
稀释度分区划线，每个稀释度做两个平板，将平板倒置放入自封袋中，分别放入37℃培养箱和厌氧袋中培养48h。
[0041]
2、纯化
[0042]
挑取具有目的菌株典型特征、菌落较大、活性较强的单菌落，于改良mrs固体培养基上进行划线纯化培养，37℃培养24-48h，如此反复2～3次，直到划线平皿中菌落特征一致。
[0043]
3镜检
[0044]
每个纯化后的平皿挑取2个以上单菌落进行涂片、革兰氏染色，并且在显微镜下观察其颜色、菌体形状是否一致，从而确定该平皿中菌落是否为纯培养物。
[0045]
所述的改良mrs培养基：蛋白胨10g/l，牛肉粉3g/l，酵母粉4g/l，磷酸氢二钾2g/l，柠檬酸2g/l，乙酸钠5g/l，葡萄糖20g/l，七水合硫酸镁0.58g/l，四水合硫酸锰0.25g/l，吐温-80 0.6g/l，碳酸钙10g/l，中性红0.05g(1％浓度5ml)，番茄汁10ml/l(v/v)，琼脂粉20g/l，调ph至5.5；115℃,30min灭菌。
[0046]
实施例2罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)hcs02-001 cgmcc no.19746菌株的鉴定
[0047]
将实施例1中分离纯化后的纯培养物进行菌种鉴定，包括革兰氏染色试验，接触酶试验及16s rdna全序列测序鉴定。最终鉴定分离得到的菌株为一株罗伊氏乳杆菌，命名为罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)hcs02-001，已于2020年04月27日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为cgmcc no.19746。
[0048]
上述罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)hcs02-001菌株为革兰氏阳性，细胞呈多形态杆状，成对排列。其理化特征是：接触酶阴性，氧化酶阴性，可利用l-阿拉伯糖、d-半乳糖、 d-葡萄糖、d-果糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、棉子糖。
[0049]
实施例3罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)hcs02-001 cgmcc no.19746菌株的耐消化道逆环境试验
[0050]
罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)hcs02-001耐消化道的逆环境能力是其能够以较高存活率到达肠道并在肠道存活、定植生长及发挥功效的先决条件。
[0051]
1、耐酸试验
[0052]
将传代三次的菌液按照10％的接种量分别接种于空白对照培养基、ph2.0和ph3.0的基础mrs培养基中。37℃静置培养，于17h取样，用灭菌的生理盐水进行一系列的10倍稀释，分别取适宜稀释度的菌液1000μl进行活菌计数操作，每个稀释度2次重复，37℃静置培养 36-48h后计数。
[0053]
耐酸试验数据指标：
[0054]
不同ph条件的培养基测得的活菌数(用n
′
表示)；空白对照试验测得的活菌数(用n0表示)，其耐酸性活菌数对数比率计算公式如下：
[0055]
受试菌株耐酸存活率(％)＝lg cfu n
′
/lg cfu n0×
100％；
[0056]
表4罗伊氏乳杆菌hcs02-001耐酸试验数据表
[0057][0058]
由表4可知，hcs02-001菌株在ph 2.0的条件下经过17h后，存活率仍达85.52％，表明该菌通过胃酸的抑制作用后仍可保持较高活性，从而发挥其益生作用。
[0059]
2、耐胆盐试验
[0060]
将传代三次的菌液按照10％的接种量分别接种于不同胆盐浓度0.3％、0.5％、1.0％、1.5％ (进口sigma胆盐)的mrs液体培养基中，37℃静置培养，于17h取样，测定活菌数。
[0061]
测得空白对照的活菌数用n0表示，其他胆盐浓度条件下测得的活菌数用n
″
表示，其耐胆盐活菌数对数比率计算公式如下：
[0062]
受试菌株耐胆盐试验存活率(％)＝lgcfun
″
/lgcfu n0×
100％；
[0063]
表5罗伊氏乳杆菌hcs02-001耐胆盐试验数据表
[0064][0065]
由表5可知，虽然hcs02-001菌株随胆盐浓度的升高，活菌数逐渐下降，但是在1.5％胆盐浓度处理条件下，存活率仍然高达90.99％，具有较强的耐胆盐能力。
[0066]
3、模拟胃液试验
[0067]
将传代三次的菌液震荡摇匀，取菌悬液10ml离心(5000
×
g，10min，5℃)获得菌泥，用pbs缓冲液冲洗2次，获得的菌泥重悬于10ml模拟胃液中，37℃条件下消化3h，取样测活菌数。
[0068]
活化三代后的受试菌株在第三代培养液中的活菌数用n表示，经在模拟胃液培养基中消化3h后计数测得的活菌数用n
#
表示，受试菌株模拟胃液试验存活率计算公式如下：
[0069]
受试菌株模拟胃液试验存活率(％)＝lgcfu n
#
/lgcfun
×
100％；
[0070]
表6罗伊氏乳杆菌hcs02-001模拟胃液试验数据表
0.6g/l，番茄汁10ml/l(v/v)，ph 6.5。
[0088]
2、阴道加德纳菌试验菌株制备
[0089]
将阴道加德纳菌冻存管1ml菌液接种于100ml添加了无菌脱纤维绵羊血(添加量50g/l) 的tsb液体培养基中，37℃培养24h(微厌氧产气包培养(5％co2))。
[0090]
所述的tsb培养基：胰蛋白胨17g/l，植物蛋白胨3g/l，氯化钠5g/l，磷酸氢二钾2.5 g/l，葡萄糖2.5g/l，固体加琼脂粉20g/l，ph 7.3
±
0.2。
[0091]
3、制备含指示菌双层平板
[0092]
将15-20ml添加了无菌脱纤维绵羊血(添加量50g/l)的tsb培养基倒于平皿中，琼脂凝固至室温。平均放置4个牛津杯，取100μl阴道加德纳菌菌液(浓度约为1
×
108cfu/ml) 与10ml 1.5％的琼脂培养基(晾至不烫手)混匀倒入平皿中，使平皿中的致病菌菌液浓度约为1
×
106cfu/ml，待琼脂凝固，取走牛津杯，形成直径为8mm的加样孔。
[0093]
4、添加抑菌物质菌株hcs02-001发酵液及发酵上清液
[0094]
平板中3个加样孔加入100μl的菌株发酵液3倍浓缩样品，其余1个孔中加入灭菌的 mrs培养基3倍浓缩液作为空白对照，将平皿小心置于37℃培养箱培养48h(微厌氧产气包培养(5％co2))。
[0095]
5、测量抑菌圈直径
[0096]
培养48h后观察抑菌圈，用游标卡尺测量抑菌圈直径。
[0097]
6、抑制阴道加德纳菌试验结果
[0098]
表8阴道加德纳菌抑菌谱
[0099][0100]
通过试验结果表8及图1可以看出，菌株hcs02-001发酵液3倍浓缩和发酵上清液3倍浓缩均出现了抑菌圈，且抑菌圈直径均达到14.6mm以上，菌株hcs02-001对阴道加德纳菌具有明显的抑制作用。
[0101]
7、对比其他菌种抑菌效果
[0102]
表9其他菌株对比情况
[0103][0104]
实施例5罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)hcs02-001阴道细胞粘附试验
[0105]
1、试验方法
[0106]
罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)hcs02-001对阴道上皮细胞的粘附：选择30名年龄为20-30岁、妇科体检正常、3天内无性生活史的健康女性，刮取阴道中后段粘膜上皮细胞并立即悬浮于10ml rpm11640中，旋涡混合器震荡洗涤细胞，去除内源性细菌，调整细胞浓度为1
×
105个/ml。将商业菌株作为对照组，调整待测菌液终浓度为2
×
107cfu/ml，与阴道上皮细胞悬液各1ml混匀，37℃震荡培养1h，1000r/min离心5min，pbs洗涤3次，弃去含未粘附至细胞的上清液，沉淀物涂片，干燥，甲醇固定15min，革兰氏染色，油镜下随机计数50个上皮细胞，推算出每个上皮细胞的粘附指数，粘附指数＝粘附细菌数/细胞数
×
100％。
[0107]
2、试验结果
[0108]
表10不同菌株与阴道上皮细胞粘附指数对比(％，)
[0109][0110]
结果显示不同菌株对于阴道上皮细胞粘附程度不同，当细菌浓度为2
×
107cfu/ml，不同菌株的粘附指数之间差异有统计学意义，罗伊氏乳杆菌粘附指数明显高于商业菌株，说明罗伊氏乳杆菌在可与阴道内细胞粘附，定植于环境中发挥作用。
[0111]
实施例6罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)hcs02-001降胆固醇功能体外试验研究
[0112]
1、试验方法
[0113]
(1)标准曲线的绘制
[0114]
1mg/ml胆固醇溶液：0.1g胆固醇，用无水乙醇定容至100ml，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃储藏备用。
[0115]
胆固醇标准溶液配制：分别吸取50μl、100μl、150μl、200μl、250μl，300μl 1mg/ml 胆固醇溶液于10ml干净的容量瓶中，无水乙醇定容，配成5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、 20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml的标准溶液。
[0116]
胆固醇标准曲线：吸取胆固醇标准溶液4ml于50ml离心管中，用60℃下氮气吹干仪通氮气流吹干溶剂，加入4ml邻苯二甲醛溶液，震荡，静置10min后，加入2ml浓硫酸，混匀，显色10min，用不加胆固醇标准溶液的邻苯二甲醛和浓硫酸为空白调零，测定550nm 处的吸光值。以胆固醇浓度(μg/ml)为横坐标，δod550为纵坐标，绘制胆固醇标准曲线。
[0117]
(2)试验菌株制备
[0118]
菌株划线分离出单菌落，挑取单菌落接种于10ml适宜培养基中，适宜温度下盖锡纸培养20h，再次转接至200ml上述培养基中，继续以适宜温度盖锡纸培养17h，待后续试验。
[0119]
3、邻苯二甲醛比色法胆固醇含量测定(opa法)
[0120]
取培养后的菌液，按1％接种量接种于50ml高胆固醇培养基中；以未接菌的高胆固醇培养基做对照。39℃培养24h，8000r/min，4℃离心10min，收集上清液，通过opa法进行测定。
[0121]
取离心后的上清液4ml，加入2ml 50％koh，混和均匀后加入3ml 95％乙醇，漩涡震荡1min。将离心管置于60℃水槽中，静置15min，取出后迅速冷却到室温，向离心管中加入 3ml正己烷，混和均匀后加入2ml蒸馏水，盖塞漩涡震荡1min，静置15min后，取2ml正己烷层溶液于干净离心管中，60℃氮气吹干仪挥发尽溶剂后，加入2ml当天配置的邻苯二甲醛(opa)溶液，混匀，室温下静置10min，加入1ml浓硫酸，漩涡震荡，显色10min后，测定δod550，根据标准曲线计算样品中胆固醇含量。
[0122]
2、试验结果计算方法
[0123]
根据标准曲线测定样品中胆固醇含量。
[0124][0125]
式中：c0为未接种培养液离心上清液中胆固醇实测浓度，μg/ml；c为接种后发酵液离心上清液中胆固醇实测浓度，μg/ml。
[0126]
罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)hcs02-001胆固醇去除率为51.5％。
[0127]
实施例7罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)hcs02-001安全性验证
[0128]
根据保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则(2010年版)检测了罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)hcs02-001的致病性，结果见表11-16。结果表明菌株hcs02-001 无致病性，具有安全性。
[0129]
表11菌株hcs02-001培养物对雄性小鼠体重的影响(腹腔注射)
[0130][0131]
表11结果说明：雄性小鼠的初始体重和终体重在培养物组与其相应对照组间比较均无显著性差异(p＞0.05)，即菌株hcs02-001培养物对雄性小鼠体重无影响。
[0132]
表12菌株hcs02-001培养物对雌性性小鼠体重的影响(腹腔注射)
[0133][0134][0135]
表12结果说明：雌性小鼠的初始体重和终体重在培养物组与其相应对照组间比较均无显著性差异(p＞0.05)，即菌株hcs02-001培养物对雌性小鼠体重无影响。
[0136]
表13菌株hcs02-001培养物对小鼠急性毒性作用(腹腔注射)
[0137][0138]
表13结果表明：将菌株hcs02-001培养物原液以0.2ml的剂量腹腔注射小鼠1次，连续观察21天，未观察到受试小鼠有毒性反应或死亡。
[0139]
表14菌株hcs02-001培养物对雄性小鼠体重的影响(经口灌胃)
[0140][0141]
表14结果表明：雄性小鼠的初始体重和终体重在培养物组与其相应对照组间比较均无显著性差异(p＞0.05)，即菌株hcs02-001培养物对雄性小鼠的体重无影响。
[0142]
表15菌株hcs02-001培养物对雌性小鼠体重的影响(经口灌胃)
[0143][0144]
表15结果表明：雌性小鼠的初始体重和终体重在培养物组与其相应对照组间比较均无显著性差异(p＞0.05)，即菌株hcs02-001培养物对雄性小鼠的体重无影响。
[0145]
表16菌株hcs02-001培养物对小鼠急性毒性作用(经口灌胃)
[0146][0147][0148]
表16结果表明：将hcs02-001培养物原液和浓缩液，以20.0ml/kg bw的剂量经口灌胃小鼠，连续灌胃3天，观察21天，观察到受试小鼠有毒性反应或死亡现象。
[0149]
实施例8罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)hcs02-001培养方法
[0150]
1、冻存菌种复苏：取存于低温冰箱内的菌种冻存管，立即放入37℃水浴锅内进行菌种复苏，15～30s，至冻存管内的固体全部融化；
[0151]
2、一级培养
[0152]
将复苏的菌种1ml转接到10ml基础培养基中，37℃，100rpm振荡培养16-20h，4℃冰箱保存备用。
[0153]
3、二级培养
[0154]
将一级培养所得菌悬液以5％的接种量转接于100ml基础培养基中，装液量40-60％， 37℃，100rpm振荡培养16-20h，测定菌悬液的ph值为4.40-4.60，收率为1.00-1.30。
[0155]
4、三级培养
[0156]
二级发酵所得菌悬液以5％的接种量转接到300ml优化培养基中，装液量40-60％，37℃， 100rpm振荡培养16-20h，测定菌悬液的测定菌悬液的ph为4.60-4.80、收率1.20-1.50％。
[0157]
所述的基础培养基：酵母蛋白胨15g/l，酵母浸出物10g/l，白砂糖20g/l，乙酸钠5g/l，一水柠檬酸2g/l，磷酸二氢钾2g/l，硫酸镁0.5g/l，硫酸锰0.01g/l，ph6.80。
[0158]
所述的优化培养基：酵母蛋白胨20g/l，酵母浸出物15g/l，红糖30g/l，乙酸钠5g/l，一水柠檬酸2g/l，磷酸二氢钾2g/l，硫酸镁0.5g/l，硫酸锰0.01g/l，ph6.80。
[0159]
上述罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)hcs02-001三级培养所得的菌悬液活菌数可达到(3.0-5.0)
×
109cfu/ml。