（2S）-顺-羟基内酰胺合成用脂肪酶的生产工艺的制作方法

（2s）-顺-羟基内酰胺合成用脂肪酶的生产工艺
技术领域
1.本发明涉及脂肪酶生产技术领域，具体涉及（2s）-顺-羟基内酰胺合成用脂肪酶的生产工艺。


背景技术：

2.地尔硫卓，也叫做硫氮卓酮或哈氮，其属于非二氢吡啶类钙离子通道阻滞剂，作用机理介于苯烷胺类药物和二氢吡啶类药物这两种药物之间。由于地尔硫卓具有扩张小动脉血管、增加冠脉血流量、降低心率和血压的功效，其已经广泛应用于室上性心律失常、典型心绞痛、变异型心绞痛、老年性高血压等病症的治疗，并且地尔硫卓口服情况下吸收速度快、吸收效率高、治疗效果显著、副作用小，因此地尔硫卓已经成为临床上用于治疗高血压、冠心病、心绞痛的常用药物。
3.（2s）-顺-羟基内酰胺是地尔硫卓的关键中间体，目前，其合成工艺路线较为冗长，合成收率低，所产生的副产物对环境污染严重。申请人研发出一条新的（2s）-顺-羟基内酰胺合成工艺路线，该路线中通过脂肪酶对其进行酶促拆分，使得（2s）-顺-羟基内酰胺的合成步骤缩短，产品光学纯度高。为了配合（2s）-顺-羟基内酰胺的合成，脂肪酶的批量化生产也迫在眉睫。


技术实现要素：

4.本发明提供了（2s）-顺-羟基内酰胺合成用脂肪酶的生产工艺，以提供一种（2s）-顺-羟基内酰胺新的合成工艺中所用到的脂肪酶的生产工艺。
5.本发明所采用的技术方案是：（2s）-顺-羟基内酰胺合成用脂肪酶的生产工艺，该生产工艺包括以下步骤：（1）一级种子培养；（2）二级种子培养；（3）发酵培养；（4）离心处理；其中，一级种子培养包括以下步骤：a1：投料：称取一定重量的一级培养基原料，加水溶解后将所得溶液加入一级种子罐中，向一级种子罐中加入一定体积的水，搅拌混合均匀，并添加碱液调整ph至6.5~7.5；a2：一级种子罐灭菌：保持搅拌的条件下，对一级种子罐升温，温度达到80-100℃后停止搅拌；向一级种子罐中输送水蒸气，维持一级种子罐温度在121
±
1℃灭菌20min，停止水蒸气的输送，一级种子罐中的液体即为一级培养基，向一级种子罐内通入无菌空气并降低一级培养基的温度，同时通过调整空气进出量来维持一级种子罐内压力维持在0.03~0.08mpa，一级培养基温度维持29-31℃；a3：接种；a4：一级种子培养控制：培养周期为5-7h，在一级种子培养周期内维持一级培养基
的温度为29-31℃，一级种子罐内压力为0.04-0.06mpa，无菌空气流量为1.7-1.9m
³
/h，低速搅拌，当od
600
≥3时对移种管道灭菌。
6.优选地，一级种子培养中步骤a3包括以下步骤：a1：校准；即在接种前维持一级种子罐内一级培养基的温度为29-31℃，低速搅拌，调整无菌空气的通气量为1.7-1.9m
³
/h，一级种子罐内的压力为0.04-0.06mpa；a2：将接种圈置于接种口处并加入乙醇（向哪里加乙醇），乙醇的体积分数不小于95%，通过一级种子罐的出气阀门调节其罐内压力至0.01mpa；点燃接种口内的乙醇并缓慢打开接种口，盛有浓度为50%的基因工程菌的烧瓶在火焰口打开瓶塞，的烧瓶在火焰口打开瓶塞，转动烧瓶一圈并将菌种缓缓倒入一级种子罐中；其中，基因工程菌为现有技术，购买于上海嘉楚生物工程有限公司，型号为编号shbcc d10833。
7.a3：接种口塞在火焰中灼烧2~3s，旋紧接种口塞，熄灭火焰；调整一级种子罐的出气阀门使得罐内压力维持在0.04~0.06mpa。
8.优选地，所述的步骤（2）二级种子培养包括以下步骤：b1：投料：称取一定重量的二级培养基原料，加水溶解后将所得溶液加入二级种子罐中，向二级种子罐中加入一定体积的水，搅拌混合均匀，并添加碱液调整ph至6.5~7.5；b2：二级种子罐灭菌：保持搅拌的条件下，对二级种子罐升温，温度达到80-100℃后停止搅拌；向二级种子罐中输送水蒸气，维持二级种子罐温度在121
±
1℃灭菌20min，停止水蒸气的输送，二级种子罐中的液体即为二级培养基，向二级种子罐内通入无菌空气并降低二级培养基的温度，同时通过调整空气进出量来维持二级种子罐内压力维持在0.04~0.06mpa，一级培养基温度达到29-31℃；b3：移种；b4：二级种子培育控制：培养周期为5-7h，在二级种子培养周期内维持二级培养基的温度为29-31℃，二级种子罐内压力为0.04-0.06mpa，无菌空气流量为25-29m
³
/h，低速搅拌，并控制一级培养基的ph为6.5-7.5。
9.优选地，所述的步骤b3中移种操作包括以下步骤：b1：校准；即在接种前维持二级种子罐内二级培养基的温度为29-31℃，低速搅拌，调整无菌空气的通气量为25-29m
³
/h，一级种子罐内的压力为0.04-0.06mpa；b2：冲洗管路：用水蒸气对一级种子罐和二级种子罐之间的管路冲洗3~5min；b3：调整二级种子罐的出气阀使得罐内压力维持在0.02mpa~0.03mpa，同时调整一级种子罐的出气阀门使得其罐内压力维持在0.1mpa，打开一级种子罐和二级种子罐之间的阀门，一级种子罐中的种子液经管路进入二级种子罐内。
10.优选地，所述的步骤（3）发酵罐培养包括以下步骤：c1：投料，向发酵罐中投入一定体积的饮用水，并向发酵罐中投入一定量的发酵培养基原料，搅拌均匀，通过向其中添加naoh来调节发酵罐中ph维持在6.5~7.5;c2：发酵罐灭菌：保持搅拌的条件下，对发酵罐升温，温度达到80-100℃后停止搅拌；向发酵罐中输送水蒸气，维持发酵罐温度在121
±
1℃灭菌25min，停止水蒸气的输送，发酵罐中的液体即为发酵培养基，向发酵罐内通入无菌空气并降低发酵培养基的温度，同时通过调整空气进出量来维持发酵罐内压力维持在0.03~0.08mpa，发酵培养基温度达到29.5~30.5℃；
c3：移种；c4：发酵罐培育控制：培育周期为20~30h，发酵罐中发酵培养基的温度维持在29.5~30.5℃，在发酵罐培育控制的前6个小时内发酵罐的通风量为130~170m
³
/h，搅拌速度为50r/min，发酵罐内压力为0.03~0.05mpa，6个小时后发酵罐的通风量为40~70m
³
/h，发酵罐内压力为0.02~0.03mpa，搅拌速度为20~30rmp/min；并于发酵10h后每间隔1h取样测定脂肪酶的活性。
11.其中，步骤c3至少包括以下步骤：c1：维持发酵罐内温度为29.5-30.5℃，搅拌速度为50-60rmp/min，通气量为150~200m
³
/h，发酵罐内压力为0.03~0.05mpa；c2：冲洗管路：用水蒸气对二级种子罐和发酵罐之间的管路冲洗3~5min；c3：调整发酵罐的出气阀使得罐内压力维持在0.02mpa~0.03mpa，同时调整二级种子罐的出气阀门使得其罐内压力维持在0.1mpa，打开二级种子罐和发酵罐之间的阀门，二级种子罐中的种子液经管路进入发酵罐内。
12.优选地，所述的步骤（4）中离心处理包括以下步骤：在步骤c4中所测定的脂肪酶活性上升缓慢或者出现下降且脂肪酶活性达到标准时，关闭发酵罐的通风阀门，通过向发酵罐的夹层内通入循环水或冷冻盐水对发酵罐内液体进行降温，当发酵罐内液体温度达到10~20℃时，打开发酵罐底部的卸料阀，并将发酵罐内液体输送至离心机中进行离心操作，离心过程中每间隔2个小时均需对离心液的浊度进行检测，当离心液浊度≤200 ntu关闭离心机并收集上层离心液即可。
13.优选地，一级培养基原料包括以下组分：蔗糖、牛肉浸粉、精制蛋白胨、氯化钠、泡敌，经步骤a2向一级种子罐中输送水蒸气后所得的一级培养基为30l，且一级培养基中蔗糖的浓度为10g/l，牛肉浸粉的浓度为4g/l，精制蛋白胨的浓度为10g/l、氯化钠的浓度为5g/l、泡敌的浓度为0.2g/l，步骤a2的烧瓶中所含的菌种体积为1.5l。
14.优选地，二级培养基原料包括以下组分：蔗糖、牛肉浸粉、精制蛋白胨、氯化钠、泡敌，经步骤b2向二级种子罐中输送水蒸气后所得的二级培养基的体积为420l，二级培养基中蔗糖的浓度为10g/l，牛肉浸粉的浓度为4g/l，精制蛋白胨的浓度为10g/l、氯化钠的浓度为5g/l、泡敌的浓度为0.2g/l，一级种子罐中30l的一级培养基均输送至二级种子罐中。
15.优选地，步骤c1中发酵罐中所添加的饮用水体积为7500l，经步骤c2灭菌处理后发酵培养基的体积为8600l，二级种子罐中的450l二级培养基均输送至发酵罐中后发酵罐中的液体至少包括以下组分：1g/l的氯化钠、0.1g/l的泡敌、6g/l的蛋白胨、15g/l的糊精、10g/l的玉米浆、2g/l的三水磷酸氢二钾、1.025g/l的七水硫酸镁、7g/l的硫酸铵、0.1g/l的无水氯化钙、0.01g/l的七水硫酸亚铁、6g/l的吐温-80。
16.本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明所提供的脂肪酶发酵方法条件温和，易于控制，同时所生产的脂肪酶活性较高，其酶活≥8000u/l，同时，该脂肪酶能够进行酶促拆分直接获得两个手性中心的合成前体，进而通过化学转化合成地尔硫卓的关键中间体化合物（2s）-顺-羟基内酰胺，缩短了其工艺步骤，产品的光学纯度高，质量优异，适合于工业化生产。
具体实施方式
17.为了对本发明进行更好地说明，现结合实例对其进行进一步的说明。
18.（2s）-顺-羟基内酰胺合成用脂肪酶的生产工艺，该生产工艺包括以下步骤：（1）一级种子培养；（2）二级种子培养；（3）发酵培养；（4）离心处理；其中，一级种子培养包括以下步骤：a1：投料：称取一级培养基原料，其中，蔗糖0.3kg、牛肉浸粉0.12kg、精制蛋白胨0.3kg、氯化钠0.15kg、泡敌0.006kg，加水溶解后将所得溶液加入一级种子罐中，向一级种子罐中加入水至溶液总体积为25l，搅拌混合均匀，并添加naoh溶液调整ph至6.5~7.5，取样检测ph，与一级种子罐所附带的ph计相比较，避免ph的测量出现偏差；a2：一级种子罐灭菌：在200rmp/min的搅拌速度下，通过加热夹套对一级种子罐中液体加热，待液体温度达到80-100℃后停止搅拌，较优地，液体温度达到90℃时停止搅拌；向一级种子罐中输送水蒸气，维持一级种子罐温度在120~122℃灭菌20min，停止水蒸气的输送，一级种子罐中的液体即为一级培养基，灭菌过程中一级种子罐内压力为0.1~0.11mpa，接着，向一级种子罐内通入无菌空气并降低一级培养基的温度，直至一级培养基温度达到29-31℃，同时通过调整空气进出量来维持一级种子罐内压力维持在0.03~0.08mpa，空气流通量≤1.8m
³
/h，此时一级种子罐中一级培养基的体积约为30l；a3：接种；a4：一级种子培养控制：培养周期为4-7h，在一级种子培养周期内维持一级培养基的温度为29.5~30.5℃，溶氧≥20%，一级种子罐内压力为0.04-0.06mpa，无菌空气流量为1.7-1.9m
³
/h，搅拌速度为200rmp/min，当od
600
≥3时对移种管道灭菌。
19.一级种子培养中步骤a3包括以下步骤：a1：校准；即在接种前维持一级种子罐内一级培养基的温度为29.5~30.5℃，搅拌速度为200rmp/min，调整无菌空气的通气量为1.7-1.9m
³
/h，一级种子罐内的压力为0.04-0.06mpa；a2：将接种圈置于接种口处，并向接种口加入乙醇50ml，所述的乙醇为无水乙醇或者体积分数不小于95%的乙醇，通过一级种子罐的出气阀门调节其罐内压力至接近0.01mpa；点燃接种口内的乙醇并缓慢打开接种口，以避免一级种子罐内的微弱压力冲出，含有菌种的烧瓶在火焰口打开瓶塞，转动烧瓶一圈并将菌种缓缓倒入一级种子罐中；a3：接种口塞在火焰中灼烧2~3s，旋紧接种口塞，熄灭火焰；调整一级种子罐的出气阀门使得通气量为1.7~1.9m
³
/h，罐内压力维持在0.04~0.06mpa；在控制柜上记录发酵批次。
20.所述的步骤（2）二级种子培养包括以下步骤：b1：投料：称取二级培养基原料，二级培养基原料包括以下物料：蔗糖4.5kg、牛肉浸粉1.8kg、精制蛋白胨4.5kg、氯化钠2.25kg、泡敌0.09kg，加水溶解后将所得溶液加入二级种子罐中，向二级种子罐中加入一定体积的水，搅拌混合均匀，此时溶液的总体积为360l，添加naoh调整ph至6.5~7.5；
b2：二级种子罐灭菌：搅拌速度为200rmp/min下对二级种子罐升温，温度达到80-100℃后停止搅拌；向二级种子罐中输送水蒸气，维持二级种子罐温度在121
±
1℃灭菌20min，停止水蒸气的输送，二级种子罐中的液体即为二级培养基，灭菌过程中，二级种子罐内压力为0.1~0.11mp。向二级种子罐内通入无菌空气并降低二级培养基的温度，一级培养基温度达到29-31℃，同时通过调整空气进出量来维持二级种子罐内压力维持在0.04~0.06mpa，空气流通量≤1.8m
³
/h，取样再次检测其ph，并调整其范围为6.5~7.5，此时二级种子罐中二级培养基的总体积约为420l；b3：移种；b4：二级种子培育控制：培养周期为4-7h，在二级种子培养周期内维持二级培养基的温度为29.5-30.5℃，二级种子罐内压力为0.04-0.06mpa，无菌空气流量为25-29m
³
/h，搅拌速度为120rmp/min。培育6h后，取样并将其稀释5倍检测od600，取样前后均采用蒸汽对取样口进行冲洗3~5min，待od600≥3时，对二级种子罐和发酵罐之间的移种管道进行灭菌处理。
21.所述的步骤b3中移种操作包括以下步骤：b1：校准；即在接种前维持二级种子罐内二级培养基的温度为29-31℃，搅拌速度为120rmp/min，调整无菌空气的通气量为25-29m
³
/h，一级种子罐内的压力为0.04-0.06mpa；b2：冲洗管路：用水蒸气对一级种子罐和二级种子罐之间的管路冲洗3~5min；b3：调整二级种子罐的出气阀使得罐内压力维持在0.02mpa~0.03mpa，同时调整一级种子罐的出气阀门使得其罐内压力维持在0.1mpa左右，打开一级种子罐和二级种子罐之间的阀门，一级种子罐中的种子液经管路进入二级种子罐内。
22.移种结束的标志是一级种子罐内的压力明显下降，此时，关闭二级种子罐的移种阀门，然后将一级种子罐和二级种子罐之间的管路用水蒸气冲洗5~10min。
23.所述的步骤（3）发酵罐培养包括以下步骤：c1：投料，向发酵罐中投入7500l的饮用水，并向发酵罐中投入发酵培养基原料，发酵培养基原料至少包括以下组分：9kg氯化钠、0.9kg泡敌、54kg蛋白胨、135kg糊精、90kg玉米浆、18kg三水磷酸氢二钾、9.225kg七水硫酸镁、63kg硫酸铵、0.9kg无水氯化钙、0.09kg七水硫酸亚铁、54kg吐温-80，搅拌均匀，通过向其中添加naoh来调节发酵罐中ph维持在6.5~7.5;c2：发酵罐灭菌：搅拌速度为60rmp/min，通过夹层和水蒸气对发酵罐升温，温度控制在80-100℃并维持30min后停止搅拌；停止夹层的加热，并保持向发酵罐中输送水蒸气，维持发酵罐温度在121
±
1℃灭菌25min，停止水蒸气的输送，发酵罐中的液体即为发酵培养基，向发酵罐内通入无菌空气并降低发酵培养基的温度，同时通过调整空气进出量来维持发酵罐内压力维持在0.03~0.08mpa，空气流量控制在≤200m
³
/h，发酵培养基温度达到29.5~30.5℃，取样再次检测其ph，并调整其范围为6.5~7.5，此时，发酵培养基的体积约为8500l~8600l；c3：移种；c4：发酵罐培育控制：培育周期为20~30h，发酵罐中发酵培养基的温度维持在29.5~30.5℃，在发酵罐培育控制的前6个小时内发酵罐的通风量为130~170m
³
/h，搅拌速度为50r/min，发酵罐内压力为0.03~0.05mpa，6个小时后发酵罐的通风量为40~70m
³
/h，发酵罐
内压力为0.02~0.03mpa，搅拌速度为20~30rmp/min；并于发酵10h后每间隔1h取样测定脂肪酶的活性，在该培育周期内对ph不进行控制调整。
24.此外，发酵罐培育过程中开启发酵罐的消泡器，由于发酵罐培育开始后的5.5h~9h内泡沫量较大，在此期间发酵罐处需安排工作人员值班，以便时刻观察发酵罐内的泡沫情况，并根据需要及时补充泡敌。发酵10h后，取样检测酶活，取样前后均需对取样口进行蒸汽冲洗，一般情况下，发酵20~30h后酶活上升缓慢或出现下降且最终酶活达到标准（酶活≥8000u/l）即可结束发酵培育过程。
25.其中，步骤c3至少包括以下步骤：c1：维持发酵罐内温度为29.5-30.5℃，搅拌速度为50-60rmp/min，通气量为150~200m
³
/h，发酵罐内压力为0.03~0.05mpa；c2：冲洗管路：用水蒸气对二级种子罐和发酵罐之间的管路冲洗3~5min；c3：调整发酵罐的出气阀使得罐内压力维持在0.02mpa~0.03mpa，同时调整二级种子罐的出气阀门使得其罐内压力维持在0.1mpa左右，打开二级种子罐和发酵罐之间的阀门，二级种子罐中的种子液经管路进入发酵罐内。
26.所述的步骤（4）中离心处理包括以下步骤：在步骤c4中所测定的脂肪酶活性上升缓慢或者出现下降且脂肪酶活性达到标准时，关闭发酵罐的通风阀门，通过向发酵罐的夹层内通入循环水或冷冻盐水对发酵罐内液体进行降温，当发酵罐内液体温度达到10~20℃时，打开发酵罐底部的卸料阀，并将发酵罐内液体输送至离心机中进行离心操作，离心过程中每间隔2个小时均需对离心液的浊度进行检测，当离心液浊度≤200 ntu关闭离心机并收集上层离心液即可。
27.一级培养基原料包括以下组分：蔗糖、牛肉浸粉、精制蛋白胨、氯化钠、泡敌，经步骤a2向一级种子罐中输送水蒸气后所得的一级培养基为30l，且一级培养基中蔗糖的浓度约为为10g/l，牛肉浸粉的浓度为4g/l，精制蛋白胨的浓度为10g/l、氯化钠的浓度为5g/l、泡敌的浓度为0.2g/l，步骤a2的烧瓶中所含的菌种体积为1.5l。
28.二级培养基原料包括以下组分：蔗糖、牛肉浸粉、精制蛋白胨、氯化钠、泡敌，经步骤b2向二级种子罐中输送水蒸气后所得的二级培养基的体积为420l，二级培养基中蔗糖的浓度为10g/l，牛肉浸粉的浓度为4g/l，精制蛋白胨的浓度为10g/l、氯化钠的浓度为5g/l、泡敌的浓度为0.2g/l，一级种子罐中30l的一级培养基均输送至二级种子罐中。
29.步骤c1中发酵罐中所添加的饮用水体积为7500l，经步骤c2灭菌处理后发酵培养基的体积为8600l，二级种子罐中的450l二级培养基均输送至发酵罐中后发酵罐中的液体至少包括以下组分：1g/l的氯化钠、0.1g/l的泡敌、6g/l的蛋白胨、15g/l的糊精、10g/l的玉米浆、2g/l的三水磷酸氢二钾、1.025g/l的七水硫酸镁、7g/l的硫酸铵、0.1g/l的无水氯化钙、0.01g/l的七水硫酸亚铁、6g/l的吐温-80。
30.以上所述的仅是本发明的优选实施例，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。