一种基于微生物基因的油气勘探方法与流程

1.本发明属于油气勘探技术领域，涉及一种基于微生物基因的油气勘探方法。


背景技术：

2.我国从1955年开始，由中国科学院菌种保藏委员会(微生物研究所前身之一)与石油工业部合作进行了气态烃氧化菌和油气田微生物学勘探法的研究。油气微生物勘探技术经历了半个多世纪的发展，进行了大量的现场应用，取得了很好的应用效果，在提供烃富集的直接证据方面，展示出了其他技术不具备的优势，已经成为一项被广泛认可的油气勘探技术。
3.随着微生物检测技术的发展，以基因检测为技术手段的微生物勘探方法显示出了更好的应用前景。比如：专利(授权公告号：cn 102174646 b；cn 104975067 b)采用培养法和荧光定量pcr方法检测甲烷氧化菌或丁烷氧化菌总菌异常和活菌异常，绘制等菌线，将丁烷氧化菌异常和甲烷氧化菌异常相结合，并与地质、地球化学和地球物理勘探结果对接，对勘探区进行石油资源评价和预测。专利(授权公告号：cn 106011241 b)提供了用于油气勘探的探针组、芯片、试剂盒与勘探方法，所提供的探针组根据微生物的16s rrna基因以及alkb、alkh、alkj、alkk、pmoa、mmox和bmox基因设计，具有良好的特异性，不依赖于培养，具有较高准确性。专利(授权公告号：cn 107267623 b)首先利用培养法检测丁烷氧化菌的含量，绘制等值线图，确定丁烷氧化菌异常区；然后对识别勘探异常区，使用荧光定量pcr法检测低级烃氧化菌数量，综合两种结果，结合地表因素，确定井位候选点。
4.已公开的利用基因检测方法开展的微生物勘探技术，提供了大量的烃氧化相关的检测指标和微生物基因信息，通过各种各样的数据处理和解释方法，均获得了用于开展油气勘探的相关证据。但以往利用基因检测为手段的勘探技术的开展，没有充分考虑不同目标勘探区块内微生物的差异性，所使用的方法都是基于特异微生物数量异常来判别油气富集，缺少对目标区域正演井位微生物信息的提取，不区分不同目标勘探区微生物种类上存在的差异性。如果不充分考虑正演井位的微生物信息，获取的数据可能有一些是无效数据或者干扰数据，造成了对勘探区的误判或错判。从正演中提取有效信息，将提取到的信息再利到未知区域进行扩展应用，是提高微生物勘探成功率的有效手段。
5.另外，目前对于土壤样品的保存液研究较少，没有专门的针对包括油气微生物的土壤样品进行保存的保存液。


技术实现要素：

6.针对上述问题，本发明提出了一种基于微生物基因的油气勘探方法。在勘探区内，分别采集已知油井/气井和干井上方地表浅层的样品，提取dna后进行高通量测序，根据测序结果建立该勘探区内微生物种类组成模式图，根据该模式图分别筛选出该勘探区内，油/气井上方地表土壤中的特征微生物，然后根据特征微生物的属性特征设计引物直接进行荧光定量pcr检测。并且对土壤样品的保存液进行了研究和优化，开发除了专门针对包括油气
微生物的土壤样品进行保存的保存液。
7.本发明公开了一种基于微生物基因的油气勘探方法，包括以下步骤：
8.s1，确定勘探区域的采样点；
9.s2，确定正演区域的采样点，所述正演区域的采样点为勘探区域的探区内或邻区的已知井上方的采样点；
10.s3，设计正演区域采样方案，采样并保存样品，
11.s4，样品提取dna；
12.s5，对所述正演区域的样品进行高通量测序，读取划分到种的otu(operational taxonomic units)值；
13.s6，建立所述勘探区域的油气指示微生物指纹图谱，识别出该勘探区内，气指示有效菌和/或油指示有效菌；根据otu值分别计算油指标和/或气指标，比较油指标和/或气指标的数值，确定有效油指标和/或有效气指标；
14.s7，根据油气指示微生物指纹图谱识别出的气指示有效菌和/或油指示有效菌设计相应的引物，进行荧光定量pcr检测，分别得到采样点的油指示微生物数值和/或气指示微生物数值；
15.s8，结合微生物成果，地球物理和石油地质等资料，多学科、多领域的技术综合确定油气区。
16.在本发明的一些实施方式中，所述已知井包括干井、水井、显示井和工业井中的一种或多种。
17.在本发明的一些实施方式中，所述高通量测序为16s rdna基因或烃氧化相关基因的高通量测序，所述烃氧化相关的基因包括已发现的pmoa基因、mmox基因、bmox、alk系列基因和p450基因中的一种或多种。
18.在本发明的一些实施方式中，所述确定有效油指标和/或有效气指标时，在油指标中，油/气数值最大的前5个种，且数值大于2，确定为有效油指标；在气指标中，气/油数值最大的前5个种，且数值大于2，确定为有效气指标。
19.在本发明的一些实施方式中，采样的深度为20-100cm，在本发明的一些实施方式中，采样量为50-100g。
20.在本发明的一些实施方式中，样品-20℃保存或者用保护液保存样品。
21.在本发明的一些实施方式中，所述保护液含有dnase抑制剂、金属离子螯合剂和β-巯基乙醇，可长时间保护dna分子完整性。
22.在本发明的一些优选的实施方式中，所述保护液还包括抗坏血酸及其衍生物。
23.在本发明的一些优选的实施方式中，所述十六烷基三甲基溴化铵在保存液中的浓度为1-2％(w/v)。
24.在本发明的一些优选的实施方式中，所述乙醇在保存液中的浓度为2-4.5％(v/v)。
25.在本发明的一些优选的实施方式中，所述β-巯基乙醇在保存液中的浓度为1-3％(v/v)。
26.在本发明的一些优选的实施方式中，所述抗坏血酸及其衍生物在保存液中的浓度为0.5-1.5mm。
27.在本发明的一些优选的实施方式中，所述抗坏血酸及其衍生物为3:1摩尔比的抗坏血酸与抗坏血酸棕榈酸酯的混合物。
28.在本发明的一些优选的实施方式中，所述乙二胺四乙酸二钠盐在保存液中的浓度为5-10mm。
29.在本发明的一些优选的实施方式中，所述dnase抑制剂在保存液中的浓度为1-2mg/l。
30.在本发明的一些实施方式中，所述保护液包括以下含量的各组分：
31.十六烷基三甲基溴化铵，0.5-2％(w/v)；乙醇，2-4.5％(v/v)；β-巯基乙醇，1-3％(v/v)；抗坏血酸，0.5-1mm；抗坏血酸棕榈酸酯，0.1-0.5mm；乙二胺四乙酸二钠盐，5-10mm；nacl，0.2-0.5mm；dnase抑制剂，1-2mg/l；余量为ph 8.0的tris-hcl。
32.在本发明的一些实施方式中，s3步骤的采样中，通过以下步骤确定采样点最适宜的采样深度：
33.s31，分别在10、20、30、40、50、60、70、80、90、100cm处采样；
34.s32，检测50cm和60cm采样深度的微生物总量；
35.s33，比较两个采样深度的微生物总量；
36.s34，沿两个采样深度微生物总量增多的方向，取最邻近的另一个采样深度检测微生物总量；
37.s35，重复s33和s34步骤，直至没有样品可以检测；
38.s36，最佳的采样深度
39.其中，hm为最大微生物总量采样深度的对数值，a为常数，为6-9，b为矫正深度，为40-60cm，h为检测微生物总量的各采样深度，hn为最小微生物总量采样深度的对数值。
40.本发明的有益技术效果：
41.本发明的基于微生物基因的油气勘探方法中，用已知井样品的高通量测序结果来确定有效油和/或气指标的指示菌，并据此针对性的设计引物，得到的指示微生物的数值可以很好的预测整个勘探区域的油气分布情况。通过筛选有效指示菌大大减少了需要处理的数据量并降低了数据噪音，而且预测结果优于现有的油气微生物方法。
42.本发明的基于微生物基因的油气勘探方法方法得到的油气指示微生物数值的等值线不仅与已知井吻合率较高，而且能够与圈闭线吻合率较好，能够精细刻画油区。
附图说明
43.图1为按照专利(授权公告号：cn 107267623 b)专利方法得到的某一区域的油气指示微生物数值的等值线图；
44.图2为按照本发明的一种实施方式的得到的同一区域的油气指示微生物数值的等值线图。
具体实施方式
45.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实
施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
46.实施例1
47.一种基于微生物基因的油气勘探方法，对某一勘探区域进行油气勘探，包括以下步骤：
48.前期样品采集同油气微生物勘探的采集。
49.具体步骤如下：
50.1.以勘探区域地质背景及前期研究成果为基础，针对勘探现状中存在的问题和难点进行技术服务方案定制。
51.a.方案设计非常灵活，设计时应考虑勘探目标预期的大小和形状，能否沿关键地震测线或在地震测线间进行采集，施工可行性及地表环境的复杂性。
52.b.根据不同的勘探目标，样点间距的范围变化较大，可以从50-100m到500-1000m。
53.c.须以探区或邻区已知井为目标建立正演模型，最好包括干井、水井、显示井和工业井。
54.2.根据设计方案，测绘人员计算出各个站点的坐标。
55.3.根据勘探区域的地表特征及人类活动情况，确定样品的采集深度。本发明研究表明，采样深度从20-60cm。
56.4.根据需要检测的指标确定样品的采集量。本发明研究表明，采样量为50-100g。
57.5.根据需要检测的指标确定样品的保存方式。本发明研究表明，样品-20℃保存样品。
58.6.对所有样品提取dna。
59.7.对正演区域(已知油/气井)的样品进行16s rdna基因或烃氧化相关基因的高通量测序。烃氧化菌基因包括已发现的pmoa基因、mmox基因、bmox、alk系列基因和p450基因中的一种或多种。
60.读取划分到种的otu值。数据表见表1。
61.表1高通量测序数据表
[0062][0063][0064]
注：otu值为井上所取样品所得otu的平均值。
[0065]
8.建立勘探区域油气指示微生物指纹图谱，识别出该勘探区内，气指示有效菌和/或油指示有效菌。
[0066]
根据otu值分别计算油指标和/或气指标。
[0067]
(1)油指标＝油井中otu值/干井中otu值，气指标＝气井中otu值/干井中otu值，分别选取油指标和气指标中数值最大的前10个。分别筛选出油指标和气指标对应的种类。见表2和表3。
[0068]
表2油指标
[0069][0070]
*，有效指标
[0071]
表3气指标
[0072][0073][0074]
*，有效指标
[0075]
(2)再比较油指标和气指标的数值。在油指标中，油/气数值最大的前5个种，且数值大于2，确定为有效油指标；在气指标中，气/油数值最大的前5个种，且数值大于2，确定为有效气指标。
[0076]
该实施方案中，确定的油指标为s__methylobacterium_radiotolerans(o-1)，s__miscellaneous_crenarchaeota_group_archaeon_smtz-80(o-2)，和s__cylindrotheca_closterium(o-3)。
[0077]
确定的有效的气指标为s__catellatospora_sp._kc-ep-s6(g-1)，s__weissella_confusa(g-2)，s__marine_metagenome(g-3)，s__oryza_longistaminata(g-4)，s__planctomycetia_bacterium_wsf3-27(g-5)。
[0078]
在实际油气勘探中，同一工区同时存在油井和气井的可能性比较低，如果油/气井只出现出现一种情况的时候，那么在筛选油指标和气指标时，不需要考虑油/气的结果。
[0079]
本实施例在数据处理前期就把一些无效数据进行了处理，这样后期得到数据处理起来更为方便，结果更加直接。
[0080]
在pcr检测中剔除低效菌种(在干井，油井和气井中占比都比较小的菌种)，可以明显降低“无油气”情况下的读数，即背景噪声读数，提高信噪比，提高勘探预测的准确率
[0081]
9.根据油气指示微生物指纹图谱识别出的有效指标设计相应的引物，进行荧光定量pcr检测，分别得到油指示微生物数值和/或气指示微生物的数值。
[0082]
10.结合微生物成果，地球物理和石油地质等资料，多学科、多领域的技术综合判定确定油气区。
[0083]
图2为按照本发明的实施例1的方法得到的某一勘探区域的微生物数值的等值线图。图1为同一区域采用专利(授权公告号：cn 107267623 b)的方法得到的等值线图。图1中虽然与已知井吻合率较高，但是在背景区和异常区上并没有那么明显，在圈闭外仍然有很多高点，可能会与其他不确定的异常连片形成“伪异常带”。而图2中不仅与已知井吻合率较高，而且能够与圈闭线吻合率较好，能够精细刻画油区。
[0084]
实施例2样品保存液的保存效果研究
[0085]
保存液配方1：
[0086]
十六烷基三甲基溴化铵，0.5％(w/v)；乙醇，2％(v/v)；β-巯基乙醇，1％(v/v)；抗坏血酸，0.9mm；抗坏血酸棕榈酸酯，0.1mm；乙二胺四乙酸二钠盐，10mm；nacl，0.5mm；dnase抑制剂，1mg/l；余量为ph 8.0的tris-hcl。
[0087]
保存液配方2：
[0088]
十六烷基三甲基溴化铵，2％(w/v)；乙醇，4.5％(v/v)；β-巯基乙醇，3％(v/v)；抗坏血酸，0.9mm；抗坏血酸棕榈酸酯，0.1mm；乙二胺四乙酸二钠盐，5mm；nacl，0.2mm；dnase抑制剂，2mg/l；余量为ph 8.0的tris-hcl。
[0089]
保存液配方3：
[0090]
十六烷基三甲基溴化铵，1％(w/v)；乙醇，3％(v/v)；β-巯基乙醇，2％(v/v)；抗坏血酸，0.9mm；抗坏血酸棕榈酸酯，0.1mm；乙二胺四乙酸二钠盐，8mm；nacl，0.3mm；dnase抑制剂，2mg/l；余量为ph 8.0的tris-hcl。
[0091]
保存液配方4：
[0092]
十六烷基三甲基溴化铵，0.5％(w/v)；乙醇，2％(v/v)；β-巯基乙醇，1％(v/v)；抗坏血酸，0.5mm；抗坏血酸棕榈酸酯，0.5mm；乙二胺四乙酸二钠盐，10mm；nacl，0.5mm；dnase抑制剂，1mg/l；余量为ph 8.0的tris-hcl。
[0093]
保存液配方5：
[0094]
十六烷基三甲基溴化铵，0.5％(w/v)；乙醇，2％(v/v)；β-巯基乙醇，1％(v/v)；抗坏血酸，0.75mm；抗坏血酸棕榈酸酯，0.25mm；乙二胺四乙酸二钠盐，10mm；nacl，0.5mm；dnase抑制剂，1mg/l；余量为ph 8.0的tris-hcl。
[0095]
保存液的制备方法：
[0096]
按照配方的量，在tris-hcl中加入乙醇和β-巯基乙醇，搅拌均匀，然后加入十六烷基三甲基溴化铵、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸)、乙二胺四乙酸二钠盐、nacl、dnase抑制剂，搅拌溶解；
[0097]
保存液的制备在无菌环境中进行，0.25um滤膜过滤除菌后备用。
[0098]
将实施例1得到的新鲜样品，按体积1:1的比例，加入上述配方的保存液，25℃保存72h，然后按照常规的方法进行总dna的提取，为实验组；以配方1的保存液不经保存的样品(处理时间＜4h)提取的总dna为对照，记为100％，得到的总dna提取率如下表所示：
[0099] 总dna提取率/％
配方1保存液(25℃保存72h)90.2b配方2保存液(25℃保存72h)91.3b配方3保存液(25℃保存72h)92.7b配方4保存液(25℃保存72h)92.3b配方5保存液(25℃保存72h)96.4a配方1保存液(不保存)100a
[0100]
结果表明，配方1-5的保存液在室温下保存3天后的总dna大于90％，已经能够满足试剂的需要，其中，以配方5的保存液性能最优。
[0101]
以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。