一种提高细胞色素P450单加氧酶储存稳定性的方法

一种提高细胞色素p450单加氧酶储存稳定性的方法
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种提高细胞色素p450单加氧酶储存稳定性的方法。


背景技术：

2.生物催化反应条件温和、专一性好、副反应少且在催化过程中避免了重金属残留、环境污染等问题，因此生物催化被广泛地用于药物合成。
3.细胞色素p450单加氧酶作为生物催化剂的一种，是自然界中最具催化多样性的酶之一，主要参与生物体外源物质代谢与天然产物生物合成，能以结构多样的有机化合物作为底物催化多种类型的化学反应。
4.尽管细胞色素p450单加氧酶具有众所周知的优势，但其在工业应用成功的例子仍然有限。这是由于生物催化目前发现的大多数酶是蛋白质，有着许多固有的缺点，如储存稳定性差、需要有效的辅酶再生、易受温度、ph影响等。目前对其储存稳定性的研究，发现绝大多数细胞色素p450单加氧酶储存不到一周就检测不到底物被消耗，说明仅不到一周，绝大多数细胞色素p450单加氧酶已经大部分失活，这也大大限制了其工业应用。


技术实现要素：

5.本发明针对现有技术的不足，设计一种操作简便、成本低的提高细胞色素p450单加氧酶储存稳定性的方法。
6.一种提高细胞色素p450单加氧酶储存稳定性的方法，将细胞色素p450单加氧酶加入到基础溶液中，再添加酶稳定剂或辅酶添加剂，其中，所述基础溶液为pb、pbs、kpb、tri-hcl、tri-h2so4或者glycine-naoh中的一种；所述酶稳定剂为甘油、葡萄糖、山梨醇、果糖、黄原胶、甘露醇、聚乙二醇或乙二胺四乙酸中的一种或几种，所述辅酶添加剂为nadh或nadph中的一种或几种。
7.进一步的，所述细胞色素p450单加氧酶以全细胞、粗酶液、粗酶粉或者纯酶的形式存储。
8.进一步的，酶稳定剂加入的终浓度为1％～80％。
9.进一步的，辅酶添加剂加入的终浓度为1～30mm。
10.进一步的，储存温度为-100℃～0℃之间。
11.进一步的，所述甘油的浓度为10％，乙二胺四乙酸的浓度为1％，其余酶稳定剂的浓度均为2％。
12.进一步的，所述储存温度为-80℃。
13.进一步的，所述辅酶添加剂为nadh，针对于粗酶液添加nadh的浓度为3mm，针对于粗酶粉添加nadh的浓度为10mm。
14.进一步的，所述储存温度为-20℃。
15.与现有技术相比，本发明通过添加终浓度为1％～80％酶稳定剂可将-100℃～0℃
下储存的全细胞、粗酶液、纯酶储存时间延长至180d，且催化性能保持在50％～90％；通过向粗酶粉中添加终浓度为1～30mm的辅酶添加剂，可将后续酶转化反应的催化性能由0％～40％提升至50％～90％，并可以保持其较优催化性能高达180d。这一发明有效地解决了细胞色素p450酶在生产过程中存储稳定性差的关键科学问题，为细胞色素p450酶的工业化应用提供了重要的技术支撑。
16.本发明的方法操作简便、成本低，便于推广利用。
附图说明
17.图1是无酶稳定剂在不同储存温度下对p450酶ee值和产率的影响示意图；
18.图2是15％甘油作为酶稳定剂在不同储存温度下对p450酶ee值和产率的保护作用示意图；
19.图3是不同浓度的甘油作为酶稳定剂在-80℃下对p450酶ee值和产率的保护作用示意图；
20.图4是甘油、山梨醇、甘露醇、乙二胺四乙酸及甘油与山梨醇、甘油与甘露醇、甘油与乙二胺四乙酸作为酶稳定剂对p450酶ee值和产率的促进作用示意图；
21.图5是甘油、乙二胺四乙酸及甘油与甘露醇作为酶稳定剂对p450酶ee值和产率的保护作用示意图；
22.图6是15％甘油作为酶稳定剂对p450酶以全细胞及粗酶粉的形式ee值和产率的保护作用示意图；
23.图7是不同浓度的辅酶添加剂nadh对粗酶液催化性能的提升示意图；
24.图8是不同浓度的辅酶添加剂nadh对粗酶粉催化性能的提升示意图；
25.图9是10mm辅酶添加剂nadh对储存于-20℃的粗酶粉对p450酶ee值和产率的保护作用示意图；
26.图10是无辅酶添加剂与10mm辅酶添加剂nadh对储存于-20℃的粗酶粉对p450酶ee值和产率的对照示意图；
27.图11是反应产率曲线图及p450酶co差光谱扫描结果图，其中(b)储存0d；(c)储存5d；(d)储存30d。
具体实施方式
28.下面通过具体实施方式进一步详细说明：
29.实施例中涉及的p450酶来源于deinococcus apachensis。
30.菌株培养：从tb固体培养基平板上挑取活化后的单菌落接种到50ml tb液体培养基中，加入kan抗生素，37℃，250rpm下培养8h。按2％体积比将菌液转入100ml tb培养基中，37℃，250rpm下培养3h后加入iptg诱导蛋白表达，诱导剂终浓度为0.2mm，于25℃，250rpm下诱导10～12h。
31.全细胞催化反应：取少量诱导后的菌液稀释10倍用于检测od
600
值，然后用高速冷冻离心机回收菌体，4℃下9000rpm离心3min，弃上清保留菌体，根据所测量od
600
值与细胞浓度关系加入相应体积的pb(50mm，ph 8.0,15％v/v glycerol)作为缓冲溶液，旋涡震荡重新悬浮混匀菌体。细胞浓度为20g cdw/l，2mm 1-氯-4-苯基-3-丁烯作为底物，反应条件为10
℃，250rpm，24h。
32.粗酶液、纯酶反应体系：5ml pb(50mm，ph 8.0，15％v/v glycerol)作为缓冲溶液，p450酶量为20g cdw/l，2mm 1-氯-4-苯基-3-丁烯作为底物，反应条件为10℃，250rpm，24h。
33.粗酶粉反应体系：5ml pb(50mm,ph 8.0,15％v/v glycerol)作为缓冲溶液，100mg粗酶粉溶于5ml缓冲液中，2mm 1-氯-4-苯基-3-丁烯作为底物，反应条件为10℃，250rpm,10h。
34.样品制备：待生物催化反应达到反应时间时，加入与反应液等体积含有20mm苯丙醇内标物的乙酸乙酯充分萃取，12000rpm下高速离心混合液至分层，取1ml有机相转入含有适量无水硫酸钠的1.5ml ep管中干燥水分，上清液以0.22μm有机膜过滤，滤液装入干净液相分析样品瓶内。
35.制备完成的样品供试液用岛津lc-20d高效液相色谱仪分析，对图谱积分处理后根据内标物与生成产物的峰面积之比带入制作好的标准曲线得产物浓度，计算ee及产率。
36.使用tb培养基培养，收集菌体后以pb(50mm,ph 8.0,15％v/v glycerol)作为缓冲溶液配置成20g cdw/l细胞浓度的混悬液。取一部分进行酶量测定，一部分在2mm底物浓度下进行生物转化。根据反应最终产量与p450酶量计算ttn，tof则取各个时间段中反应速率最快的一段时间计算。
37.co差光谱扫描法测定p450酶蛋白浓度：将样品等量分装至3个3ml石英比色皿中，取一只比色皿放入样品池中设置仪器在400～500nm进行基线矫正；第二只加入3mg左右连二亚硫酸钠混匀后作为基线样品进行扫描；第三只比色皿于通风橱内通入co气体3min，加入3mg左右连二亚硫酸钠还原p450酶后，在400～500nm进行多次扫描直至450nm峰不再增加为止，得到的曲线为还原型p450酶co结合光谱，根据基线与co结合光谱420nm与450nm吸光度的变化判断p450酶可溶性表达情况，并根据扣除基线后的co结合图谱计算酶量。
38.生物转化反应：取20g cdw/l蛋白浓度的混悬液5ml于25ml具塞磨口三角瓶中，分为11组，每组平行三个，每个加入50μl已配置好的底物储备液(100mm)，塞紧后置于恒温摇床10℃、250rpm条件下反应。在反应20min、40min、1h、2h、4h、5h、6h、8h、10h、12h、24h时取样，使用5ml含20mm苯丙醇的乙酸乙酯溶液进行萃取制样，高效液相分析反应样品，以时间对产率作线图取反应速率最快的时间段计算tof值，以反应24h的产率计算ttn。
39.p450酶浓度计算方法：p450(μm)＝(δa450-δa490)/0.091，p450酶的摩尔吸光系数ε＝0.091μm-1
cm-1
，δa490做为基线值计算450nm峰高。
40.转化频率(tof)计算方法：tof(min-1
)＝c
p
/(t
×ce
)，c
p
为产物浓度，ce为p450酶浓度，t为反应时间。
41.总转化数(ttn)计算方法：ttn＝c
p
/ce，c
p
为最终产物浓度，ce为p450酶浓度。
42.实施例1
43.使用pb(50mm,ph 8.0)作为储存溶剂，置于-80℃、-20
°
℃、4℃、10℃下储存0d、1d、2d、5d、10d、15d、30d。
44.结果显示，储存0d～5d时，于4℃储存效果最佳；随着储存时间的延长，于4℃储存相当不稳定。于-80℃、-20℃储存较稳定，但产率降低较多(如图1)。
45.实施例2
46.向pb(50mm,ph 8.0)中添加终浓度为15％酶稳定剂甘油作为储存溶剂，置于-80
nadh催化反应。
68.结果显示，随着储存时间的延长，ee值和产率均变化不大，直至储存90d产率仍高达67％，说明粗酶粉具有较好的储存稳定性(如图9)。
69.实施例10
70.将粗酶粉置于-20℃储存0d、5d、10d、20d、30d、40d、50d、60d、90d后，直接催化反应及添加10mm nadh催化反应。
71.结果显示，当加入10mm nadh后，其产率由8％提升至70％。表明辅酶添加剂nadh对该反应起着至关重要的作用(如图10)。
72.实施例11
73.根据co差光谱扫描结果测定p450酶蛋白浓度；并在反应20min、40min、1h、2h、4h、5h、6h、8h、10h、12h、24h时取样进行监测。以时间对产率作线图取反应速率最快的时间段计算转化频率(tof)值，以反应24h的产率计算总转化数(ttn)。
74.结果显示，储存0d、5d、30d的p450酶蛋白浓度为0.47μm、0.47μm、0.54μm；tof值为79.05min-1
、79.05min-1
、68.80min-1
；ttn值为3173.94、3173.94、2762.50。表明p450酶储存30d仍可基本保持其原有蛋白浓度，且tof值及ttn值均变化不大(如图11)。
75.以上仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。