一种细胞分离方法与流程

1.本发明属于细胞分离技术领域，具体而言，是一种细胞分离方法。


背景技术：

2.动物组织原代细胞分离通常通过酶、edta和机械方法来进行，之后使其分散为单细胞悬液样品，后续在适当的培养体系下对于分离的原代细胞进行生存、生长和繁殖培养；针对不同物种的不同组织类型，其具体的操作流程也要进行调整；常规原代细胞分离流程为取样
→
预处理
→
分离处理
→
过滤清洗
→
后处理。
3.对于质地软且较为松散的软组织，在对于组织细胞的需求量较大时，通过成本较低，便于大批量提取的物理机械方式将组织进行初步碎化预处理，之后将碎化的组织置于缓冲液中过滤清洗后，进行后续分离提取处理。
4.现有专利号为cn202010322559.1的一种软骨组织切碎及细胞分离提取一体化装置，该专利文献中就是通过机械方式进行细胞分离的，并通过将破碎组件与分离提取组件进行一体化设置，以解决对于软骨组织切碎以及细胞离心分离单独处理时的效率较低的问题；但是该专利文献中通过破碎组件对组织剪碎的方式，是通过周向转动的破碎转盘和固定在容器侧壁的破碎转环之间进行剪切作用来实现的，无法对容器底部的组织进行充分处理，欲使其剪碎的组织大小能够穿过穿透孔进入到对接沉槽内，需要较长的处理时间，会对细胞组织造成较大的机械损伤。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种细胞分离方法，该细胞分离方法通过细胞组织碎化器来进行，通过该细胞组织碎化器底部设置的转动切割刀头的低速和高速切割方式的切换，能够对松散的软组织进行快速碎化处理，之后将碎化的组织在细胞组织碎化器内直接分离存储，以减少对细胞组织造成的机械损伤；
6.为了实现上述的目的，本发明的通过细胞组织碎化器进行细胞分离方法的步骤包括：
7.步骤一：将软组织清洗后，低温储存10～30min；
8.步骤二：投入到碎化容器内，通过刀头转动进行碎化处理；
9.步骤三：碎化处理后的组织碎片经滤网进入到存料箱中的缓冲液内；
10.步骤四：将存料箱向上抬起，使存料箱的排料口与碎化容器侧部的出料管连通，将组织碎片连同缓冲液一同排出；
11.步骤五：对细胞碎片进行聚解后充分分离。
12.细胞组织碎化器的主体结构包括承载座、导向立杆和碎化容器，承载座放置在试验台上，承载座上固定连接有导向立杆和碎化容器。
13.导向立杆上滑动连接有升降座，升降座上固定连接有转动驱动器，转动驱动器的输出轴与转轴通过联轴器相连，转轴上固定连接有刀头。
14.转轴贯穿碎化容器上的拆卸盖，拆卸盖通过固定座安装在碎化容器上，拆卸盖通过两个锁定旋钮与固定座锁定连接。
15.细胞组织碎化器对于组织碎片的收集结构包括存料箱和滤网夹持座，存料箱上设有排料口，存料箱上固定连接有连接架，连接架竖向滑动连接在承载座上的滑口内，承载座的底部设有通气口，存料箱上固定连接有滤网夹持座，滤网夹持座内侧安装有滤网。
16.存料箱内侧下端的排料口在存料箱升起后能够与碎化容器侧部的出料管连通，出料管上还安装有阀门。
17.优选的，连接架上安装有多个密封圈，密封圈与滑口内壁抵接连接。
18.优选的，承载座上固定连接有用于控制升降座滑动的第一升降驱动器。
19.优选的，承载座上固定连接有用于控制连接架升降的第二升降驱动器。
附图说明
20.图1为本发明的细胞分离方法的流程图；
21.图2为本发明的细胞组织碎化器的结构示意图；
22.图3为本发明的细胞组织碎化器的主体结构示意图；
23.图4为本发明的组织碎片升降座、转动驱动器和转轴的结构示意图；
24.图5为本发明的承载座和通气口的结构示意图；
25.图6为本发明的存料箱、排料口、连接架和密封圈的结构示意图；
26.图7为本发明的导温片的结构示意图；
27.图8为本发明的固定座和拆卸盖的结构示意图；
28.图9为本发明的固定座、拆卸盖和锁定旋钮的结构示意图；
29.图10为本发明的组织碎片升降座、转动驱动器和刀头的结构示意图；
30.图11为本发明的锁定旋钮、横片和弹性套的结构示意图；
31.图12为本发明的滤网夹持座的结构示意图。
32.图中：承载座11；导向立杆12；碎化容器13；出料管14；阀门15；通气口16；滑口17；升降座21；转动驱动器22；转轴23；刀头24；第一升降驱动器25；存料箱31；排料口32；连接架33；密封圈34；导温片35；第二升降驱动器35；滤网夹持座41；限位柱42；固定座51；拆卸盖61；密封套62；锁定旋钮71；横片72；弹性套73；套环74；金属片75。
具体实施方式
33.本发明的通过细胞组织碎化器进行细胞分离方法的步骤包括：
34.步骤一：将软组织清洗后，根据软组织的种类，-15～3℃储存10～30min；
35.步骤二：投入到碎化容器13内，通过刀头24转动进行碎化处理；
36.步骤三：碎化处理后的组织碎片经滤网进入到存料箱31中的缓冲液内；
37.步骤四：将存料箱31向上抬起，使存料箱31的排料口32与碎化容器13侧部的出料管14连通，将组织碎片连同缓冲液一起排出；
38.步骤五：对细胞碎片进行聚解后充分分离。
39.进一步地，在步骤二中，将软组织投入到碎化容器13内的同时，加入一定量的低温溶液，起到降温和便于软组织重新聚拢的作用；
40.进一步地，步骤二中，刀头24的转速过程为：长时间的低速转动和短时间的高速转动循环切换，减少对于组织的机械损伤；刀头24经高速转动切换到低速转动后，一定量的组织碎片通过滤网夹持座41之间的滤网进入到存料箱31内收集，脱离与刀头24的接触，减少对于组织碎片的温度损伤和机械损伤；
41.刀头24经低速转动重新切换到高速转动后，将滤网夹持座41上嵌入的部分大块组织碎片重新卷出粉碎处理；
42.进一步地，步骤三中的缓冲液可预先经过低温预处理，缓冲液能够便于溶解用于细胞分离的酶，便于后续细胞分离处理；
43.进一步地，缓冲液的量占存料箱31容积的二分之一或三分之一；
44.通过机械方式对于组织进行碎化后，可配合酶处理或edta的方式进一步对细胞进行分离处理。
45.以下，参照图2和图8，说明作为本发明的实施方式中的细胞组织碎化器的整体结构：
46.承载座11放置在试验台上，承载座11上固定连接有导向立杆12和碎化容器13，承载座11上固定连接有第一升降驱动器25，通过第一升降驱动器25控制升降座21在导向立杆12上进行升降；
47.升降座21上固定连接有转动驱动器22，转动驱动器22的输出轴与转轴23通过联轴器连接，转轴23上固定连接有刀头24，刀头24的侧部安装有刀片，通过转轴23带动刀片转动，实现对于组织进行碎化的作用；
48.通过第一升降驱动器25控制升降座21在导向立杆12上进行升降，能够通过刀头24对组织进行捣碎处理；
49.第一升降驱动器25可选用液压缸或电动伸缩杆；
50.参照图8和图10，关于刀头24上的刀片结构的具体表示；
51.刀片设置有多个，多个刀片交错连接有向刀头24外侧，并曲折向外延伸，刀片延伸方向具体为图10所示；
52.根据组织的硬度，对刀头24进行更换，对刀片长度进行调整，改变刀片与存料箱31内壁之间的距离，使刀片与软组织材料接触效果提高，同时使组织碎化过程更加稳定；
53.参照图3和图6，是本发明的存料箱31、连接架33和滤网夹持座41在细胞组织碎化器的主体结构上拆离后分开表示的图：
54.存料箱31容纳在碎化容器13内，存料箱31上固定连接有连接架33，连接架33上固定连接有多个密封圈34，密封圈34与碎化容器13的滑口17内壁抵接，用作密封和提高连接架33移动过程中的稳定性；
55.滤网夹持座41通过紧固件固定连接在存料箱31上，滤网夹持座41双侧的中间部分安装有滤网；
56.双层结构的两部分能够相互拆开，通过紧固件进行锁定，为使滤网能够在滤网夹持座41中部牢固固定，并防止滤网变形，滤网夹持座41上的双层结构分别固定连接有多个楞，上下两组楞之间的延伸方向为横竖分布或呈一定角度错开设置；
57.滤网夹持座41上侧固定连接的多个楞之间的空间能够容纳刀头24碎化的组织碎片，使其能够穿过滤网后进入到存料箱31内；
58.其中，刀头24经高速转动切换到低速转动后，一定量的组织碎片通过滤网夹持座41之间的滤网进入到存料箱31内收集，脱离与刀头24的接触；
59.之后在刀头24经低速转动重新切换到高速转动后，将滤网夹持座41上嵌入的部分大块未穿过滤网的组织碎片重新卷出，进行粉碎处理；
60.滤网夹持座41上固定连接有限位柱42，限位柱42的上侧能与刀头24主体的圆盘结构下端面抵接，实现限位作用，使刀片与滤网夹持座41上侧面之间留有一定间隙；
61.进一步地，刀片与滤网夹持座41上侧面之间始终能够留有一定间隙，使第一升降驱动器25带动转轴23上的刀头24对组织进行捣碎时，不会对滤网夹持座41造成损坏；
62.进一步地，如图7所示，存料箱31顶部内侧设有斜面，对滤网夹持座41进行承载托起，增加刀头24对组织进行捣碎时，存料箱31对滤网夹持座41的支承效果；
63.以下，参照图7，说明作为本发明对存料箱31内的组织碎片和缓冲液进行低温处理的实施例：
64.存料箱31的底部设有导温片35，连接架33内设有导温柱，连接架33顶部的主体架为导热材质例如铜材质；
65.通过在连接架33顶部的主体架上通过导热元件例如铜片连接制冷设备例如半导体制冷片的制冷端，将低温通过导温柱传导到导温片35处，对存料箱31内的组织碎片和缓冲液进行低温处理，进一步减少机械处理中对于组织碎片的温度损伤和机械损伤；
66.以下，参照图7，说明作为本发明对存料箱31在碎化容器13内竖向移动，使存料箱31内的组织碎片和缓冲液进行排出的实施例：
67.承载座11上固定连接有第二升降驱动器35，第二升降驱动器35的活动端与连接架33顶部的主体架相连，通过启动第二升降驱动器35，使存料箱31侧部的排料口32能够与碎化容器13侧部的出料管14连通，将存料箱31内的组织碎片和缓冲液能够一同排出；
68.为了平衡碎化容器13底部的气压，使碎化容器13底部设有通气口16，通气口16还贯穿承载座11，由于存料箱31的上侧外沿始终与碎化容器13内壁抵接，能够保持设备内部的密封状态，因此碎化容器13内的细胞材料不会从碎化容器13底部的通气口16处流出；
69.图3中的滑口17位于碎化容器13内壁处的位置形成槽口；
70.连接架33在存料箱31上的连接位置如图7所示，能使存料箱31的上侧外沿始终位于槽口顶部的上方，从而实现密封效果；
71.另外，出料管14的位置相对设置在碎化容器13中部的靠下位置，连接架33在碎化容器13内滑动过程中，不会对碎化容器13的密封性造成影响；
72.出料管14上还设有阀门15，用于控制物料的排出速度；
73.参照图2、图4和图8，是本发明的将带有刀头24的转轴23插入到碎化容器13内，通过固定座51和拆卸盖61对碎化容器13顶部遮挡的具体表示：
74.碎化容器13上固定连接有固定座51，固定座51上托起有拆卸盖61，拆卸盖61上转动连接有两个锁定旋钮71，通过锁定旋钮71转动，实现拆卸盖61在固定座51上的拆装；
75.拆卸盖61上还固定连接有密封套62，转轴23贯穿弹性材质的密封套62，插入到碎化容器13内，之后在转轴23的底部安装刀头24，再将转轴23与转动驱动器22的输出轴相连；
76.转动驱动器22可选用步进电机或伺服电机；
77.参照图10-11，是本发明的锁定旋钮71结构的具体表示：
78.锁定旋钮71底部插接连接有横片72，通过紧固件固定连接在锁定旋钮71下端，锁定旋钮71的侧部安装有弹性套73，弹性套73上沿斜面竖向安装有多个金属片75，锁定旋钮71的中部竖杆穿过拆卸盖61，锁定旋钮71的下侧通过弹簧连接有套环74，套环74套在竖杆外侧。
79.以下，参照图9-11，说明作为本发明通过锁定旋钮71、横片72、弹性套73和套环74将拆卸盖61与固定座51之间进行锁定与能够使二者脱离的实施例：
80.横片72连接在拆卸盖61的下侧位置，弹簧能使套环74下端抵在拆卸盖61上侧；
81.按压锁定旋钮71并转动90度后，能够使横片72卡在固定座51下沿位置，利用弹簧实现自锁功能，增加设备的密封效果，实现锁定拆卸盖61与固定座51的作用，锁定旋钮71继续转动90度后，二者能够脱离；
82.以下，参照图1、图6和图8，说明作为本发明通过锁定旋钮71的使用，将存料箱31内的缓冲液带入到滤网上侧的实施例：
83.同时启动第一升降驱动器25和第二升降驱动器35，将转轴23连同连接架33一同升降，将存料箱31内的缓冲液带入到滤网上侧的空间内，此过程中，能够对滤网上侧粘连的组织碎片进行冲散，使冲散的组织碎片能够顺利穿过滤网进入到存料箱31内。
84.以下，参照图3-7，说明作为本发明通过排料口32与出料管14连通瞬间产生的压力变化将组织碎片送入到存料箱31内后排出的实施例：
85.利用锁定旋钮71将拆卸盖61与固定座51之间进行锁定，实现一定程度的密封作用；
86.在需要将组织碎片连同缓冲液一起排出时，存料箱31升起，弹性套73和金属片75起到一定的密封增强作用，进一步提高密封性，此过程中，碎化容器13内部压力增高；
87.在存料箱31在碎化容器13内竖向升起至排料口32与出料管14连通时，物料从排料口32排出到出料管14处，此时，碎化容器13内部压力减小，在压力瞬间变化的过程中，能够使组织碎片进入到存料箱31内的顺畅度提高。