过氧化物酶阻断剂及使用喷印方式的组织化学染色方法与流程

1.本发明涉及一种过氧化物酶阻断剂，尤其是涉及一种具有较佳存放稳定性的阻断剂以及透过喷印方式进行组织化学染色的方法。


背景技术：

2.免疫组织化学染色技术(immunochemistry)是应用免疫学基本原理-抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的染色剂染色来确定组织切片或者细胞内抗原，并对其定位、定性或定量的技术。此组织化学染色技术普遍用于现代病理诊断工作中，具有相当重要的作用。
3.过氧化物酶(peroxidase)是一种普偏存在人体器官组织的细胞里酶(enzyme)，例如血红细胞、肾脏和肝脏组织等。现行一般可透过免疫组织化学染色法对过氧化物酶进行染色(peroxidase stain；pox)的方式，例如使用二氨基联苯胺(diaminobenzidine，dab)染色法，来对人体组织细胞进行诊断。二氨基联苯胺染色法的原理是利用过氧化物酶氧化过氧化氢(hydrogen peroxide)，使其分解而释放出原生态的氧(单原子氧)，原生态的氧会氧化二氨基联苯胺，使之变成棕黑色颗粒状的沉淀物，透过颜色深浅可用来诊断、判断过氧化物酶的活性。在现行的过氧化物酶染色方法中，是通过以水作为主要基质，例如是内含水约95％，稀释调配成所需的过氧化氢溶液后，利用滴落法将过氧化氢溶液加至组织切片与过氧化物酶反应。然而，因水溶液会促使过氧化氢分解，以水作为主要基质调配的过氧化氢溶液稳定不佳且不易存放，往往随着存放时间自行氧化分解，而导致阻断过氧化物酶的效果不佳，影响组织化学染色后的背景值偏高，不易判读。再者，由于此以水为主要基质调配的过氧化氢溶液随着存放时间自行分解，也会导致前后进行组织化学染色后的结果不一致。由于此传统阻断剂的过氧化氢溶液含水比例过高，使得过氧化氢溶液易与墨盒内的金属弹簧反应产生气体，而无法将现行的过氧化物酶阻断剂填充于墨盒内，阻碍了使用自动化喷印方式进行组织化学染色的可能性。
4.因此，有需要一种新改良的过氧化物酶阻断剂以及可使用喷印方式的组织染色方法，以克服现有技术上的缺陷。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种具有较佳稳定性和阻断效果的过氧化物酶阻断剂以及可使用喷印方式的组织染色方法。
6.本发明提供一种过氧化物酶阻断剂，此阻断剂的组成以重量百分比计包含：70～99％的水溶性有机溶剂、0.5～10％的过氧化氢、0.4～20％的水，以及0.1～0.5％的界面活性剂，其中，该阻断剂具有一黏度范围介于1～10厘泊(cps)。
7.较佳地，该过氧化物酶阻断剂的该水溶性有机溶剂包含醇类、醇醚类或二醚类。
8.较佳地，该过氧化物酶阻断剂的醇类水溶性有机溶剂包含单元醇类或多元醇类。
9.较佳地，该过氧化物酶阻断剂的醇类的该水溶性有机溶剂是选自由甲醇、乙醇、丙
醇、异丙醇、丁醇、乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、四乙二醇、聚乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、二丙二醇、三丙二醇、聚丙二醇、丙三醇、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2,3-丁二醇、丁三醇、新戊二醇、1,5-戊二醇、戊五醇、1,6-己二醇及己六醇所构成的群组。
10.较佳地，该过氧化物酶阻断剂的醇醚类的该水溶性有机溶剂包含一单边封端处为具有甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基或新丁基的多元醇。
11.较佳地，该过氧化物酶阻断剂的醇醚类的该水溶性有机溶剂是选自由乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚、乙二醇单丙醚、乙二醇单丁醚、乙二醇单叔丁醚、二乙二醇单甲醚、二乙二醇单乙醚、二乙二醇单丁醚、聚乙二醇单甲醚、丙二醇单甲醚、丙二醇单乙醚、二丙二醇单甲醚、二丙二醇单丙醚、二丙二醇单丁醚及三丙二醇单甲醚所构成的群组。
12.较佳地，该过氧化物酶阻断剂的二醚类的该水溶性有机溶剂包含至少两边的封端处为多元醇。
13.较佳地，该过氧化物酶阻断剂的二醚类的该水溶性有机溶剂是选自由乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、二乙二醇二甲醚、二乙二醇二乙醚、二乙二醇甲乙醚、三乙二醇二甲醚、四乙二醇二甲醚及二丙二醇二甲醚所构成的群组。
14.较佳地，该过氧化酶阻断剂的该界面活性剂包含聚山梨醇酯(tween 20)。
15.本发明还提供一种使用喷印方式的组织化学染色方法，其步骤包括：提供一承载座；置放一组织样本于该承载座上；侦测该组织样本，以定义出一喷印区域；喷印一过氧化物酶阻断剂至该喷印区域；以及喷印一染色剂至该喷印区域，以进行组织化学染色；其中，该过氧化物酶阻断剂的组成以重量百分比计包含：70～99％的水溶性有机溶剂、0.5～10％的过氧化氢、0.4～20％的水，以及0.1～0.5％的界面活性剂，且该过氧化物酶阻断剂具有一黏度范围介于1～10厘泊(cps)。透过自动化机台的喷印方式进行组织化学染色，可精确地在所需喷印的区域喷印阻断剂，可大幅减少阻断剂的用量，避免阻断剂浪费，节省成本。
16.较佳地，在该使用喷印方式的组织化学染色方法中，该组织样本包含含过氧化物酶的生物组织样本。
17.较佳地，在该使用喷印方式的组织化学染色方法中，该侦测步骤包含透过一镜头拍摄该组织样本，并透过辨识，定义该喷印区域。
18.较佳地，在该使用喷印方式的组织化学染色方法中，该染色剂包含二氨基联苯胺(dab)。
19.较佳地，在该使用喷印方式的组织化学染色方法中，喷印该染色剂的步骤在喷印该过氧化物酶阻断剂之后。
20.本发明实施例的过氧化物酶阻断剂是以水溶性有机溶剂取代传统中以水作为主要基质的阻断剂，藉此可减缓、减少过氧化氢的分解，改善阻断剂储存时的稳定性。也就是说，本发明实施例的过氧化物酶阻断剂具有较佳的稳定性，不因存放时间、温度等影响其阻断效果，在进行组织化学染色后，亦可获得较低的背景值的结果，增加判读的准确性。此外，由于本发明实施例的过氧化物酶阻断剂具有较佳的稳定，可避免因存放导致组织染色后的背景值深浅不一的问题，可维持染色后背景值一致。再者，本发明实施例的过氧化物酶阻断剂是以水溶性有机溶剂作为阻断剂的基质，降低了与墨盒内例如金属弹簧反应产生气体的可能性，故可更加稳定地装载填充于墨盒内，得以实现使用自动化喷印方式进行组织化学染色方法。另外，将过氧化物酶阻断剂填充于墨盒内，可有效地隔离阻断剂与外界空气接
触，同时也能提高过氧化物酶阻断剂储存的安定性。
附图说明
21.图1a-1b是使用传统阻断剂与本发明实施例的过氧化物酶阻断剂进行组织化学染色后的照片示意图。
22.图2是本发明实例过氧化物酶阻断剂的阻断效果的示意图。
23.图3a-3d是本发明另一实施例使用喷印方式进行组织化学染色步骤的示意图。
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承载座
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组织样本
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侦测镜头
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喷墨头
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阻断剂
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12
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染色剂
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14
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组织样本
具体实施方式
[0028]
为能详细了解本发明的技术特征及实用功效，并可依照说明书的内容来实施，进一步较佳实施例配合附图详细说明如下。可以了解的是下列实施例中的数值或其范围仅是用来说明本发明可具以实施的范例，本领域技术人员应当可依需要做些微调整、变化实施例的数值或范围，因此，实施例内容并不用以局限本发明。
[0029]
本发明实施例揭露一种具有较佳稳定的过氧化物酶阻断剂(peroxidase blocking buffer)。首先，取重量百分比为70～90％的水溶性有机溶剂作为阻断剂的主要基质成份，接着添加含水稀释的过氧化氢水溶液，其中水的重量百分比为0.4～20％，而过氧化氢的重量百分比为0.5～10％。最后，再将重量百分比0.1～0.5％的界面活性剂加入上述溶液中，并搅拌约5分钟，以配制完成本发明实施例的过氧化物酶阻断剂。在此基质是指组成阻断剂中的最主要成份，也可以是指例如其成份的组成重量百分比大于50％以上。在另一实施例中，界面活性剂也可依需求调整重量百分比为0.01～2％，较佳可以是0.05％，而，上述过氧化氢的重量百分比较佳也可以是3～5％。
[0030]
上述水溶性有机溶剂较佳可以是醇类、醇醚类或二醚类。在醇类为水溶性有机溶剂的实施例中，可以是单元醇类或多元醇类，且较佳可以是选自由甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、四乙二醇、聚乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、二丙二醇、三丙二醇、聚丙二醇、丙三醇、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2,3-丁二醇、丁三醇、新戊二醇、1,5-戊二醇、戊五醇、1,6-己二醇及己六醇所构成的群组。而，在醇醚类为水溶性有机溶剂的实施例中，可以是一单边封端处为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基或新丁基的多元醇，且较佳可以是选自由乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚、乙二醇单丙醚、乙二醇单丁醚、乙二醇单叔丁醚、二乙二醇单甲醚、二乙二醇单乙醚、二乙二醇单丁醚、聚乙二醇单甲醚、丙二醇单甲醚、丙二醇单乙醚、二丙二醇单甲醚、二丙二醇单丙醚、二丙二醇单丁醚及三丙二醇单甲醚所构成的群组。在另一以二醚类为水溶性有机溶剂的实施例中，可以是包含至少两边封端处为多元醇的二醚类，且较佳可以是选自由乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、二乙二醇二甲醚、二乙二醇二乙醚、二乙二醇甲乙醚、三乙二醇二甲醚、四乙二醇二甲醚及二丙二醇二甲醚所构成的群组。可以了解的是，上述水溶性有机溶剂的实施例仅是用来说明本发明可具体实施的方式，也可以是其他具有类似性质的有机溶剂，在此并不用以限
制本发明。上述界面活性剂较佳可以是tween 20的聚山梨醇酯或其它合适的界面活性剂(nonionic surfactant)。
[0031]
在配制完成实施例的过氧化物酶阻断剂后，取一组织样本，以进行组织化学染色法(immunohistochemistry,ihc)。将上述实施例的过氧化物酶阻断剂加至组织样本切片，经过约15～30分钟让组织样本切片的过氧化物酶与阻断剂进行反应，接着，再将染色剂加至上述组织样本切片，静置约5～10分钟，进行反应呈色后，可观察组织样本的染色状况。在一实施例中，上述染色剂较佳可以是二氨基联苯胺(diaminobenzidine，dab)或其它相似的染色剂。而，组织样本可以是任何含有过氧化物酶的组织样本，例如肝脏或肾脏组织、血细胞等。值得一提的是，在上述加入染色剂前，可先以一洗涤剂清洗、移除过氧化物酶阻断剂。上述洗涤剂较佳可以是磷酸盐缓冲液(pbst)或tris-hcl缓冲液(tbst)。
[0032]
图1a-1b是分别使用传统的过氧化物酶阻断剂与本发明实施例的过氧化物酶阻断剂阻断后，进行组织化学染色后照片的示意图。在图1a是使用传统的过氧化物酶阻断剂的对照组，而图1b是使用本实施例的过氧化物酶阻断剂的组织化学染色照片。从图1a可看出，使用传统的过氧化物酶阻断剂的组织染色的背景值较高，其阻断效果较差，而本发明实施例的过氧化物酶阻断剂具有较佳的阻断效果，使得组织样本在染色后的背景值较低，如图1b。本发明实施例的阻断剂可改善、避免因背景值高而影响染色结果判读等的问题。再者，本实施例的过氧化物酶阻断剂具有较佳的稳定性，不因存放时间造成阻断剂分解而导致前后组织化学染色结果的不一致，本发明实施例的过氧化物酶阻断剂确实可使得组织化学染色结果较具有一致性的背景值。
[0033]
接下来本发明提供多个不同配方组成的阻断剂实验例，并观察在不同配方组成下过氧化物酶阻断剂的阻断效果(background blocking)。表1陈列共10组实验例，除界面活性剂的tween 20重量维持不变外，其它成分如水溶性有机溶剂、水、过氧化氢在此10组实验例中皆不相同。依据上述步骤调配不同配方组成的过氧化物酶阻断剂，如实验例1或称实例1，取二乙二醇二乙醚的水溶性有机溶剂98.45克，并加入0.92克的水及0.5克的过氧化氢，以及0.13克的tween 20，混合并搅拌约5分钟，可得实例1的过氧化物酶阻断剂。然后，如上述步骤，将实例1的过氧化物酶阻断剂加至组织切片，经过约15～30分钟进行反应后，再加入二氨基联苯胺(dab)的染色剂，静置约5～10分钟，进行染色后，可观察其组织染色结果的背景值和阻断效果。其它实例2～10皆可依此步骤调配并进行组织化学染色，并以观察其背景值和阻断效果。值得一提的是，也可以是以上述醇类、醇醚类及二醚类中的任一有机溶剂取代表1各实例中的二乙二醇二乙醚的作为阻断剂的水溶性有机溶剂。因此，本发明的水溶性有机溶剂也不局限表1实例的揭露的成分。
[0034]
表1
[0035][0036][0037]
在图2中，是表1实例1～10的阻断效果示意图，以及两组分别是无添加任何阻断剂和添加传统的阻断剂的组织化学染色的对照组。在此，传统的过氧化物酶阻断剂是以水溶液为主要基质的阻断剂，因此水的重量百分比占比较高，使得传统的阻断剂较容易分解、稳定性差而不易存放，导致阻断效果较差如图2所示。在图中，本发明提出的实例1～10的阻断剂，采用二乙二醇二乙醚的水溶性有机溶剂作为过氧化物酶阻断剂的基质成份，皆具有优于对照组，无添加阻断剂和传统阻断剂的阻断效果。特别是，实例4的阻断剂配方组成更具有超过50％的阻断效果。由此可知，本发明实施例的采用水溶性有机溶剂取代传统阻断剂以水作为主要基质的过氧化物酶阻断剂确实具有明显优于传统的阻断剂的阻断效果。此处阻断效果可以是指组织化学染色后的背景值，背景值低可以推断为过氧化物酶阻断剂具有较佳的阻断效果，相反的，背景高可以推断为阻剂剂的阻断效果较差。
[0038]
由于本发明实施例过氧化物酶阻断剂是以水溶性有机溶剂作为主要基质成份，因此可减少、避免与墨盒内的例如金属弹簧进行反应产生气体的机会，可稳定地填充、装载于墨盒内，使自动化喷墨方式进行组织化学染色方法得以实现。为了使本发明实施例的过氧化物酶阻断剂可适用于喷墨方式喷涂，可以是具有一黏度范围介于1～10厘泊(cps)，且较佳的黏度范围为1～5厘泊(cps)。可以理解的是，只要不影响喷墨系统，过氧化物酶阻断剂的黏度也可以是其它合适的范围，并不以上述范围为限。接下来，本发明实施例提供一种使用喷墨方式喷印上述过氧化物酶阻断剂的组织化学染色方法。
[0039]
图3a-3d是本发明另一实施例使用喷墨方式的组织化学染色方法的流程示意图。如图3a所示，提供一例如是载玻片的承载座2，并在承载座2上置放组织样本4，接着，侦测组织样本4，以定义出一喷印区域。在一实施例中，可以是透过例如侦测镜头6拍摄组织样本4的照片，并透过计算机辨识欲喷印的位置或者以侦测镜头直接扫描的方式，以侦测和定义组织样本4的喷印区域。在此并不特别限定侦测组织样本的方式，只要以适当方式取得及定义喷印区域即可。在定义喷印区域后，透过一喷墨头8，将上述过氧化物酶阻断剂10喷印至组织样本4的喷印区域，如图3b。阻断剂10可与组织样本4内的过氧化物酶反应进行阻断，且在一实施例中，过氧化物酶阻断剂可以是具有一黏度范围介于1～10厘泊(cps)之间，较佳黏度范围也可以是介于1～5厘泊(cps)。之后，如图3c所示，透过喷墨头8，将染色剂12喷印至组织样本4的喷印区域，以进行组织化学染色。在图3d中，显示透过喷墨方式进行组织化学染色后的组织样本14。在此实施例中，染色剂10和组织样本4等可以是与上述实施例相同或相似材料，在此不再赘述。
[0040]
由于本发明实施例是透过喷墨方式喷印例如过氧化物酶阻断剂等，可精确地喷印阻断剂，例如透过控制欲喷印的位置和阻断剂用量，故可大大减少阻断剂的使用量。再者，在此实施例中，过氧化物酶阻断剂可填充于高封密的墨盒内，减少与空气接触造成阻断剂分解的机会，因此也可提高过氧化物酶阻断剂储存的安定性。除阻断剂可采用喷印外，在本发明实施例中，染色剂也可以是一同采用自动化喷印方式添加至组织样本，因此也可同时节省染色剂的用量，故可整体降低组织化学染色方法上的成本。
[0041]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明主张的权利范围，凡其它未脱离本发明所揭示的精神所完成的等效改变或修饰，均应包括在本发明的申请专利范围内。