一种同步改良棉花纤维长度和强度性状的分子育种方法

1.本发明涉及棉花分子育种技术领域，具体涉及一种同步改良棉花纤维长度和强度性状的分子育种方法。


背景技术：

2.棉花是一种重要的经济作物，棉花的生产在人们的生活中和国民经济的发展中都发挥着举足轻重的作用。随着棉纺织技术水平和装备的不断更新，纺织企业对纱线质量水平要求大幅提高，对原棉质量的要求也越来越高，不同纺纱装备对纤维品质指标的要求有所不同，其中纤维长度和纤维强度对于高效率纺纱非常重要。培育纤维长度和强度更好的生产品种既是纺织工业纺高档纱和出高档棉制品的要求，同时也是实现棉花机械化采收的要求之一。
3.海岛棉纤维品质好，具有长、强、细的特性，但适应性差、产量低，而陆地棉适应性广，产量高，但纤维品质一般，因此挖掘海岛棉的优异纤维品质相关基因，将海岛棉优异纤维品质基因渐渗到陆地棉背景中，同步改良棉花的产量相关性状和棉纤维品质性状，对我国陆地棉纤维品质的改良有着重要的意义。
4.棉花纤维长度和强度是纤维品质的主要性状，都属于多基因控制的复杂数量性状。品质性状及产量性状之间存在复杂的相关关系，尤其是主要纤维品质性状与产量性状之间存在显著或不显著负相关，给棉花纤维品质与产量的同步改良带来了难度。由于传统育种的整个过程中的选择主要是表型选择，而且表型性状易受环境等外在条件的影响，致使传统育种依据表型选择周期长、成本高、准确性差、选择效率低。随着分子标记技术的兴起和广泛应用，将分子标记辅助选择技术应用于目标性状的遗传改良，对于培育纤维品质优异的棉花新品种具有重要指导作用。
5.分子标记既不受个体组织和发育阶段的限制，也不受环境条件的影响，能够对基因型实现直接操作。利用该技术可以快速、准确的进行目的基因检测和定向改良，育种年限大大缩短。分子标记辅助选择技术是目前突破常规育种瓶颈，提高育种中选择效率的有效方法(song et al.,2016；zhang et al.,2016)。
6.渐渗系(又叫染色体片段代换系cssls，或导入系)，基因组中只含有少数供体亲本的染色体片段，大部分遗传背景与受体亲本一致，减少了遗传背景的干扰，提高了qtl检测的准确性。近几年，南京农业大学张天真团队首次培育了陆地棉tm-1背景的海岛棉染色体片段渐渗系，并对纤维品质进行了qtl定位(wang et al.，2012)；通过全基因组ssr标记筛选找到了39个与衣分、铃重、子指、纤维长度、强度、马克隆值有关的qtls。中国农业科学院棉花研究所袁有禄团队利用陆地棉背景的海岛棉染色体片段代换系群体及其分离群体，定位了大量棉花纤维品质相关qtls(zhai et al.，2016；song et al.，2017；guo et al.，2018；li et al.，2019；shi et al.，2020)，这为棉花陆海渐渗系分子标记辅助育种奠定了重要基础。将分子标记辅助选择技术应用于陆海渐渗系的遗传改良，并在陆海渐渗系群体中进行qtl定位，鉴定与产量性状和棉纤维品质性状相关的主效位点，进一步系统的研究棉
纤维发育的分子调控机制，对于培育优良的棉花新品种具有重要指导作用，对于满足纺高支纱的需求、推动植棉业可持续的发展以及提高我国原棉在世界市场上的竞争力都具有重要意义(王鹏等，2009；wang et al.，2012；fang et al.，2014)。


技术实现要素：

7.为了克服传统育种中表型选择准确性差、效率低、周期长、成本高等许多缺点，解决纤维长度和强度育种进展缓慢的问题。本发明以两套不同陆地棉遗传背景的渐渗系群体(中棉所45
×
海1的bc4f
3:5
和中棉所36
×
海1的bc5f
3:5
渐渗系)进行了qtl定位，在16号染色体的标记区间cgr6894-bnl2634内的ssr标记bnl2634位点附近(位置见图1中左侧连锁群)同时定位到了纤维长度和强度的qtl qfl-c16-1和qfs-c16-1。qfl-c16-1的lod值和贡献率分别为13.43和16.95％，qfs-c16-1的lod值和贡献率分别为10.37和13.37％，能同时提高纤维长度和强度，来自海岛棉。进一步从中棉所45
×
海1培育的bc4f
3:5
渐渗系群体中选择出来的纤维品质表现突出的优质代换系mbi7561(lu et al.,2017)，并携带有目标性状qtl：16号染色体qfl-c16-1和qfs-c16-1海岛棉渐渗片段。利用mbi7561与其轮回亲本构建含有2106个单株的分离大群体(bc5f2群体)，在群体中进行确认目标性状qtl。从上述bc5f2群体中筛选到含qfl-c16-1和qfs-c16-1渐渗片段、其他渐渗片段尽可能少的单株，与中棉所45进一步构建了bc6f2近等基因系群体及bc6f
2:3
株行群体，增加新标记，结合bc6f2及bc6f
2：3
群体进行海岛棉纤维长度和强度qtl的精细定位，鉴定到新标记gl16
250bp
同时与纤维长度和强度qfl-c16-1和qfs-c16-1同时连锁。
8.本发明利用不同陆海渐渗系群体通过多环境qtl筛选鉴定，标记加密精细定位，筛选出与纤维长度和强度qtl紧密连锁的分子标记，可应用于标记辅助选择育种。
9.本发明的目的是提供来自海岛棉海1与纤维长度和强度紧密连锁的分子标记。
10.本发明的再一目的是提供一种陆地棉纤维长度和强度辅助育种方法。
11.本发明的再一目的是提供上述来自海岛棉海1与纤维长度和强度紧密连锁的分子标记的应用。
12.本发明提供的技术方案是：一种来自海岛棉海1与棉花纤维长度主效qtl和强度主效qtl同时紧密连锁的分子标记，所述分子标记为gl16
250bp
，该分子标记正向引物序列为tcatgccctctttcgcgta，反向序列为gtaatcttatgccctccatgact，扩增长度为250bp的海1的dna片段，与棉花纤维长度性状有关的qtl qfl-c16-1和棉花纤维强度性状有关的qtl qfs-c16-1都紧密连锁，qtl qfl-c16-1和qtl qfs-c16-1都位于第16号染色体上120.54cm位置的ssr标记gl16
250bp
附近。
13.一种同步改良棉花纤维长度和强度性状的分子育种方法，该方法包括以下步骤：
14.(1)对海岛棉海1及其衍生品系(品种)有关的育种群体中，提取单株dna，使用与上述棉花纤维长度主效qtl和强度主效qtl同时紧密连锁的分子标记gl16
250bp
对群体单株的基因型进行分子检测；
15.(2)对检测结果进行分析，选择带有海岛棉海1特征条带的植株。其中，所述与棉花棉花纤维长度主效qtl和强度主效qtl紧密连锁的分子标记gl16
250bp
的特异性引物序列和扩增的目的片段长度如下：正向引物序列为tcatgccctctttcgcgta，反向引物序列为gtaatcttatgccctccatgact，扩增长度为250bp的海1的dna片段。
16.具体地，本发明所述的分子标记gl16
250bp
是通过以下方法按照下列步骤获得的：
17.(1)纤维长度和强度在两套不同遗传背景的渐渗系群体中的初定位
18.我们利用海岛棉海1为供体亲本、两个高产陆地棉品种(中棉所36和中棉所45)为受体亲本培育了两套不同陆地棉遗传背景的不同回交世代的种间群体和高代回交自交的渐渗系群体(中棉所45
×
海1的bc4f
3:5
和中棉所36
×
海1的bc5f
3:5
渐渗系)(石玉真硕士学位论文，2009)，构建了陆海种间高密度的遗传图谱(shi et al.,2015)。利用两套不同陆地棉遗传背景渐渗系群体的多环境的表型数据和分子检测数据进行了qtl定位，在16号染色体的标记区间cgr6894-bnl2634内的ssr标记bnl2634位点附近(位置见图1中左侧连锁群)同时定位到了纤维长度和强度的qtl qfl-c16-1和qfs-c16-1，(qfl-c16-2)lod值和贡献率的最大值都是最高的，分别为13.43和16.95％，(qfs-c16-3)lod值和贡献率的最大值都是最高的，分别为10.37和13.37％，能同时提高纤维长度和强度，来自海岛棉(表1；shi et al.,2020))。
19.(2)目标纤维长度qtl和强度qtl的进一步确认
20.从中棉所45
×
海1培育的bc4f
3:5
渐渗系群体中选择出来的纤维品质表现突出的优质代换系mbi7561，并携带16号染色体qfl-c16-1和qfs-c16-1海岛棉渐渗片段。利用mbi7561与其轮回亲本杂交、自交构建含有2106个单株的分离大群体(bc5f2群体)，2014年种植在安阳。利用bc5f2分离大群体的表型数据和基因型数据，采用王健康的qtl icimapping v4.1软件进行纤维qtl定位，在标记bnl2634/gh056附近也定位到纤维长度和强度的qtl(表3)。
21.(3)目标纤维长度qtl和强度qtl的精细定位
22.从上述bc5f2群体中筛选到含qfl-c16-1和qfl-c16-1渐渗片段、其他渐渗片段尽可能少的单株，与中棉所45进一步杂交、自交，构建了bc6f2近等基因系群体，2016年种植在安阳试验地，2020年在安阳种植成株系bc6f
2:3
，分别测定了731个bc6f2单株和105个bc6f
2:3
株行的纤维品质。选择区间内标记cgr6894、gh056及增加开发新标记对群体分子检测，经qtl定位，在该区间也同时定位到纤维长度和纤维强度的qtl，离新标记gl16最近，同时与新标记gl16紧密连锁(图1中右边的染色体红色区域)：加性效应都为正，增效基因来源于海岛棉海1，纤维长度的lod为24.6-6.19，贡献率为9.18-23.35％，纤维强度的lod为9.45，贡献率为2.98％，能同时提高纤维长度和强度分别为0.53-1.08mm和0.68cn/tex。标记gl16
250bp
与纤维长度和强度同时紧密连锁的是前人没有发现的(表5)。
23.同时与棉花棉花纤维长度主效qtl qfl-c16-1和强度主效qtl qfs-c16-1紧密连锁的分子标记gl16
250bp
的特异性引物序列和扩增的目的片段长度如下
24.正向引物序列为tcatgccctctttcgcgta，
25.反向引物序列为gtaatcttatgccctccatgact，
26.扩增长度为250bp的海1的dna片段。
27.本发明的有益效果如下：
28.本发明使用ssr标记gl16
250bp
在与海岛棉海1、mbi7561或含有目标片段的代换系等有关的育种群体中对纤维长度和强度性状进行分子标记选择，可提高陆地棉的纤维长度和强度。该方法所用的分子标记gl16
250bp
与纤维长度和强度性状的qtl：qfl-c16-1和qfs-c16-1(fl是纤维长度的英文单词fiber length的缩写。qtl的命名：q 性状名称英文缩写 染色
体缩写及序号 qtl的序号。如：qfl-c16-1表示在第16条染色体上控制纤维长度和强度的第1个qtl。)同时紧密连锁。该纤维长度和强度性状的qtl：qfl-c16-1和qfs-c16-1位于染色体c16上，来源于海岛棉海1的一个渐渗片段上，对提高纤维长度的贡献率为9.18-23.35％，加性效应为0.53-1.08mm，同时对提高纤维强度的贡献率为2.98％，加性效应为0.68cn/tex。
29.使用本发明所述分子标记可以在苗期预测纤维长度和强度的高低并进行淘汰，获得纤维长度和强度同时得到提高的陆地棉单株或品系或品种，提高纤维长度和强度性状的选择效率，辅助育种选择目标明确，节约成本。通过同时与纤维长度和强度性状qtl紧密连锁的分子标记在与海岛棉海1、mbi7561或含有目标片段的代换系等有关的育种群体中的分子标记选择，快速地提高现有陆地棉品种的纤维品质，加速棉花纤维品质的育种进程。
30.本发明不仅有助于筛选纤维长、纤维强的材料，有助于解决我国棉花纤维品质育种进展缓慢的问题，而且有助于克服现有育种技术对纤维品质鉴定存在的成本高、时间长、稳定性低、准确性差、效率低等不足，快速地提高现有陆地棉品种的纤维品质，大大加快我国高优质纤维新品种的培育与种子产业化进程，为今后海岛棉海1或mbi7561或含有目标片段的代换系等杂交、回交后代的纤维长度和强度性状育种利用提供了极大的便利，同时也为基因克隆奠定了基础。
附图说明
31.图1目标棉花纤维长度主效qtl和强度主效qtl的连锁标记在连锁图上的位置。
具体实施方式
32.下面通过具体实施例方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
33.实施例1：筛选分子标记
34.(1)纤维长度和强度在两套不同遗传背景的渐渗系群体中的初定位
35.我们利用海岛棉海1为供体亲本、两个高产陆地棉品种(中棉所36和中棉所45)为受体亲本培育了两套不同陆地棉遗传背景的不同回交世代的种间群体和高代回交自交的渐渗系群体(中棉所45
×
海1的bc4f
3:5
和中棉所36
×
海1的bc5f
3:5
渐渗系)(石玉真硕士学位论文，2009)，构建了陆海种间高密度的遗传图谱(shi et al.,20015)。对408个(ccri36
×
hai1)bc5f
3:5
株系的陆海导入系群体开展了7个环境的纤维产量及品质性状鉴定(2009年安阳，2010年安阳，2011年的安阳，辽阳和石河子；2014年的石河子中棉所试验站及新疆农垦科学院试验基地)。同样，对322个(ccri45
×
hai1)bc4f
3:5
株系的陆海导入系群体开展了9个环境的纤维产量及品质性状鉴定(2009年安阳，2010年安阳；2011年安阳，库尔勒；2014年库尔勒，阿拉尔，周口；2015年安阳，周口)。采用ctab法(paterson et al.1993)提取上述2套渐渗系的dna，从上述图谱上每10cm遗传距离选择1个标记共挑选出来531个标记进行分子检测。利用两套不同陆地棉遗传背景渐渗系群体进行了qtl定位，两套不同陆地棉遗传背景的渐渗系群体(中棉所45
×
海1的bc4f
3:5
和中棉所36
×
海1的bc5f
3:5
渐渗系)进行了qtl定位，在16号染色体的标记区间cgr6894-bnl2634内的ssr标记bnl2634位点附近(位置见图1中左侧连锁群)同时定位到了纤维长度和强度的qtl qfl-c16-1和qfs-c16-1。qfl-c16-1的lod值和贡献率分别为24.6-6.19和9.18-23.35％，qfs-c16-1的lod值和贡献率分别为9.45和
2.98％，能同时提高纤维长度和强度，增效基因来自海岛棉(表1)(yuzhen shi et al.examining two sets of introgression lines across multiple environments reveals background independent and stably expressed quantitative trait loci of fiber quality in cotton,theoretical and applied genetics,2020,133:2075-2093)。
36.表1在16号染色体上能同时在两个不同遗传背景的陆海渐渗系中检测到的纤维长度和强度的qtl
37.qtls遗传背景染色体位置最近标记环境数lod值pve％qfl-c16-1ccri361665.97bnl263413.39-3.398.36-8.36qfl-c16-1ccri451665.97bnl263483.93-13.435.27-16.95qfs-c16-1ccri361665.97bnl263424.03-4.054.61-4.67qfs-c16-1ccri451665.97bnl263432.81-10.373.82-13.37
38.(2)目标纤维长度qtl和强度qtl的进一步确认
39.从中棉所45
×
海1培育的bc4f
3:5
渐渗系群体中选择出来的纤维品质表现突出的优质代换系mbi7561，并携带16号染色体qfl-c16-1和qfs-c16-1海岛棉渐渗片段。利用mbi7561与其轮回亲本杂交、自交构建含有2106个单株的分离大群体(bc5f2群体)，2014年种植在安阳，行长5m，行宽80cm，株距25cm。采用ctab法(paterson et al.1993)提取bc5f2群体单株dna，对这些单株进行农艺性状和纤维品质性状的测定。获得的表型数据见表2。
40.表2在bc5f2分离大群体中纤维长度和强度性状描述性统计分析
41.性状群体平均值最小值最大值标准差偏度峰度中棉所45纤维长度(mm)bc5f230.7623.5935.291.22-0.351.2929.48纤维强度(cn/tex-1
)bc5f231.4723.5039.602.13-0.010.3328.02
42.引物由上海生工和北京三博公司合成。ssr扩增反应体系为10μ1，其中超纯水6.40μ1，10
×
buffer 1.0μ1，10mm dntps 0.50μ1，正向引物(10μm)0.50μ1，反向引物(10μm)0.50μ1，模板dna(30ng/μ1)1.0μ1，taq dna聚合酶(5u/μ1)0.10μ1。ssr扩增反应程序：94℃预变性45s；94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸1min，29个循环。94℃变性60s，57℃退火45s，72℃延伸2min。扩增反应在biometra公司tgradient及bio-rad公司ptc-200上进行，扩增产物在8％的聚丙烯凝胶中进行电泳，按照张军(2000)的方法进行凝胶银染，记录结果。
43.利用bc5f2分离大群体的表型数据和基因型数据，采用王健康的qtl icimapping v4.1软件(http：//www.isbreeding.net/software/？type＝detail&id＝18)进行纤维qtl定位，在标记bnl2634/gh056附近也定位到纤维长度和强度的qtl(表3)。
44.表3在群体bc5f2中进一步定位的16号染色体上目标纤维长度qtl和强度qtl
45.qtls染色体位置最近标记lod值pve(％)addqfl-c16-11664.58gh0567.080.430.16qfs-c16-11664.58gh05613.640.780.44
46.(3)目标纤维长度qtl和强度qtl的精细定位
47.从上述bc5f2群体中筛选到只含qfl-c16-1和qfl-c16-1渐渗片段、其他渐渗片段尽可能少的单株，与中棉所45进一步杂交、自交，构建了bc6f2近等基因系群体，2016年种植在安阳试验地，行长5m，行宽80cm，株距25cm。2020年在安阳种植成株系，行长3m，行宽80cm，株
距25cm。分别测定了731个bc6f2单株和105个bc6f2:3株行的纤维品质。获得的2个世代的纤维长度和强度表型数据见表4。
48.表4在bc6f2和bc6f2:3分离群体中纤维长度和强度性状描述性统计分析
[0049][0050]
采用ctab法(paterson et al.1993)提取bc6f2单株的dna，选择区间内标记cgr6894、gh056及增加开发新标记对群体分子检测，经qtl定位，在该区间也同时定位到纤维长度和纤维强度的qtl，离新标记gl16
250bp
最近，与新标记gl16
250bp
紧密连锁(图1中右边的染色体红色区域)：加性效应都为正，增效基因来源于海岛棉海1，纤维长度的lod为24.6-6.19，贡献率为9.18-23.35％，纤维强度的lod为9.45，贡献率为2.98％，能提高纤维长度和强度分别为0.53-1.08mm和0.68cn/tex。标记gl16
250bp
与纤维长度qtl和强度qtl紧密连锁的是前人没有发现的(表5)。
[0051]
表5在近等基因系群体bc6f2和bc6f2:3中精细定位的16号染色体上目标纤维长度qtl和强度qtl
[0052][0053][0054]
同时与棉花棉花纤维长度主效qtl qfl-c16-1和强度主效qtl qfs-c16-1紧密连锁的分子标记gl16
250bp
的特异性引物序列和扩增的目的片段长度如下：正向引物序列为tcatgccctctttcgcgta，反向引物序列为gtaatcttatgccctccatgact，扩增长度为250bp的海1的dna片段。
[0055]
实施例2：陆地棉纤维长度和强度性状同时提高的分子标记选择方法
[0056]
使用实施例1获得的分子标记gl16
250bp
在与海岛棉海1、mbi7747或含有目标片段的代换系等有关的育种群体中进行分子标记选择，包括以下步骤：
[0057]
(1)dna提取：以海岛棉海1为供体亲本，陆地棉品种或品系(如中棉所60、鲁棉研28，新陆早50，冀08)为受体亲本，进行杂交、回交，获得分离群体，或者以海岛棉海1为供体亲本，陆地棉品种(如中棉所60、鲁棉研28，新陆早50，冀08)为受体亲本杂交高代回交获得的代换系及其衍生品系，或者代换系mbi7561或含有目标片段的代换系与陆地棉品种杂交、回交的后代群体，在苗期采用ctab法(paterson et al.1993)提取分离群体单株dna；
[0058]
(2)使用分子标gl16
250bp
对上述(1)群体单株的基因型进行分子标记检测；
[0059]
(3)对检测结果进行分析；
[0060]
(4)选择带有海岛棉海1特征条带的植株，这些中选单株的纤维长度和强度都得到不同程度的提高。
[0061]
通过本发明可获得纤维长度和强度得到提高的陆地棉品种(系)，可加速棉花纤维品质的育种进程。