植物的一个bHLH转录因子RdbHLH89及其编码基因和应用

植物的一个bhlh转录因子rdbhlh89及其编码基因和应用
技术领域
1.本发明涉及植物的一个bhlh转录因子rdbhlh89及其编码基因和应用，分离自杜鹃花，属于分子生物学领域。


背景技术：

2.bhlh类转录因子，是真核生物中广泛存在的一个较大的转录因子家族，因其具有保守的碱性－旋－环－螺旋(basic－helix－loop－helix)结构域而得名。bhlh结构域由约60个氨基酸构成，其中包括2个功能区域:一是碱性区域，负责与dna的结合，其在多肽链的n端，并含有大量碱性氨基酸，由大约15个氨基酸组成，其中有6个共有的氨基酸残基；二是hlh区域，分布在c端，主要由疏水氨基酸残基构成，其中含有既亲水又亲脂的α－螺旋，2个α－螺旋之间被不同长度的连接区(环)分开，形成螺旋－环－螺旋结构，利于hlh之间相互作用形成二聚体。bhlh转录因子通常通过形成同二聚体或异二聚体与靶基因启动子的不同部位相结合，从而对基因的转录发挥调控作用。
3.bhlh类转录因子参与调控植物类黄酮合成，类黄酮生物合成途径，从苯丙氨酸的直接前体开始，可分为三个阶段：第一阶段是苯丙氨酸在特异酶的作用下产生香豆酰-辅酶a；第二阶段是一分子的香豆酰-辅酶a与三分子的丙二酰辅酶a在特异酶的作用下形成二氢黄酮醇；第三阶段是二氢黄酮醇在特异酶的作用下产生无色花青素和黄酮醇，无色花青素进而被催化成各种稳定的花色苷。
4.转录因子bhlh常与myb和wd40蛋白形成“mbw”蛋白三元复合体其作用，通过形成复合体共同促进下游花色素苷合成途径关键结构基因表达，从而促进花色素苷合成。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供源于杜鹃花的bhlh类转录因子rdbhlh89及其编码基因。
6.本发明采用的技术方案为：
7.本发明提供的一个植物的bhlh类转录因子，名称为rhododendron basic－helix－loop－helix 89protein(简称rdbhlh89)，来源于杜鹃花品种
‘
胭脂蜜’(rhododendron yanzhimi)，其序列如seq id no.1所示。序列表中的seq id no.1由272个氨基酸残基组成，自氨基端(n端)第170位至第224位氨基酸残基为保守的bhlh结构域。
8.本发明还公开了上述的bhlh转录因子rdbhlh89的编码基因，其特征在于：
9.a)序列表中seq id no.2所示的dna序列；
10.b)编码序列表中seq id no.1蛋白质序列的多核苷酸序列。
11.序列表中的seq id no.2由1025个脱氧核苷酸组成，其编码序列为自5’端第58位至877位脱氧核苷酸，编码具有序列表中seq id no.1的氨基酸残基序列的蛋白质。
12.本发明还公开了上述的bhlh转录因子rdbhlh89在调控杜鹃花花色上的应用。
13.本发明所提供的调控杜鹃花花色形成的应用，是将所述编码杜鹃花bhlh类转录因子rdbhlh89的基因导入植物组织或细胞，杜鹃花花色获得调控。
14.所述编码杜鹃花bhlh类转录因子rdbhlh89的基因可通过含有rdbhlh89基因的植物表达载体导入外植体；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种双元农杆菌载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如pcxsn、pcambia2301、pcambia1301、pahc25或其他衍生植物表达载体；使用本发明的rdbhlh89基因构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种组成型、组织特异型、诱导型或增强型启动子；为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入具有抗性的抗生素标记(卡那霉素、潮霉素等)或抗化学试剂标记基因(如抗除草剂bar基因等)及可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或蛋白等(gus基因、gfp基因等)。
15.携带有rdbhlh89基因的植物表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。
16.本发明提供的rdbhlh89基因来自杜鹃花品种
‘
胭脂蜜’，实时定量pcr检测结果表明rdbhlh89基因在杜鹃花
‘
胭脂蜜’植株的根、茎、叶和花中均有表达，其中在花中的表达量最高。因此，rdbhlh89基因可作为目的基因导入杜鹃花，调控杜鹃花的花色，具有较高的实际应用价值。
附图说明
17.图1为rdbhlh89与其他植物bhlh结构域氨基酸序列的多重比对结果；
18.图2为rdbhlh89的系统进化树；
19.图3为rdbhlh89 mrna在不同组织器官中表达丰度的实时定量pcr检测结果。
具体实施方式
20.下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明，这些具体实施例不应以任何方式被解释为限制本发明的应用范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
21.实施例1：杜鹃花rdbhlh89的克隆
22.利用生物信息学和常规聚合酶链式反应(pcr)相结合的方法克隆杜鹃花bhlh类转录因子编码基因rdbhlh89的dna序列，具体方法为：
23.选用杜鹃花的叶片作为实验材料，用植物基因组提取试剂盒(takara)提取杜鹃花
‘
胭脂蜜’基因组的dna。根据前期杜鹃花转录组中bhlh类转录因子的氨基酸序列，设计一对特异引物(引物由上海生物工程公司合成)：
24.正向引物：5
’‑
aatgagctggaaatgactgtgatg-3’，
25.反向引物：5
’‑
aggagtctaaaatggtactaagcatgg-3’。
26.采用hieffzero topo-tacloning kit零背景topo-ta克隆试剂盒进行pcr扩增，以杜鹃花的基因组为模板进行常规聚合酶链式反应(pcr)。
27.50μlpcr反应体系：正、反向10μm的引物各2.0μl，1.0μl cdna样品，2
×
taq plus master mix(vazyme)25μl，20μl双蒸水。pcr反应条件：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，60℃复性30秒，72℃延伸30秒，35个循环后，72℃延伸7分钟。将扩增得到的约819bp dna片段用凝胶回收试剂盒(杭州爱思进生物技术有限公司)按试剂盒提供的方案回收该片段，用
pgem-t vector系统(promega公司，美国)按试剂盒说明克隆该片段，测序(上海生物工程公司)。序列分析表明该序列编码的氨基酸序列与bhlh类蛋白的保守区片段高度同源，因此确定获得了rdbhlh89基因片段。
28.实施例2：rdbhlh89的序列信息分析与dna结合域的同源性进化分析
29.本发明的rdbhlh89基因片段cdna为1025bp，开放阅读框部分位于58-877bp处。dnastar软件分析表明rdbhlh89共编码272个氨基酸，蛋白的相对分子量为30115.23，理论等电点为5.24，小于7，说明其为酸性蛋白。将此蛋白氨基酸残基序列在国际基因库(genbank)中进行搜索，发现rdbhlh89所编码的蛋白含有一个在bhlh类转录因子中很保守的结构域，即自氨基端(n端)第157位至第207位氨基酸残基，共51个氨基酸，与已报道的bhlh类转录因子是一致的。序列的同源性比对分析可以为基因功能的研究提供一些有用信息。用dnastar软件绘制rdbhlh89与在genbank中登陆并且有文献报道的来自其他植物的bhlh类转录因子的系统进化树。系统进化分析表明rdbhlh89主要与双子叶植物山茶的bhlh类转录因子的亲缘关系最近。据此推测其与花色调控相关(见图2)。
30.实施例3：rdbhlh89转录本的组织表达特征
31.用实时定量pcr的方法检测rdbhlh89在杜鹃花植株中的组织分布情况，并采取以下措施保证检测结果的可靠性：a、用扩增级别dnase i消化提取的总rna中可能存在的少量的基因组dna的污染，为检测基因组dna是否消除干净，可取出一部分用dnasei消化消化的总rna样品进行常规pcr反应，当发现没用扩增条带产生时，再进行反转录步骤；b、由于rdbhlh89基因没有内含子，且在杜鹃花中可能有其同家族成员，所以扩增产物尽量不放在其cdna的编码区，特别是编码很保守的bhlh结构域的区域，为了进一步验证实时定量pcr扩增的条带是否就是rdbhlh89，将pcr产物切胶回收进行测序。具体方法为：取杜鹃花成株期根、茎、叶和花(盛花期)为材料提取总rna为模板，依据所获得的cdna片段序列设计rdbhlh89基因实时定量pcr的引物(引物由上海生物工程公司合成)：
32.正向引物：5
′‑
gggtctgtttgcggaggat-3
′
；
33.反向引物：5
′‑
cgcttctgcttcggcttt-3
′
。
34.以杜鹃花
‘
胭脂蜜’的actin(激动蛋白)cdna为内参，实时定量pcr引物为(引物由上海生物工程公司合成)：
35.正向引物：5
′‑
cggtgccctgaaatcctgtt-3
′
；
36.反向引物：5
′‑
aaacgctcagccattccagg-3
′
。
37.实验步骤如下：先取1μg总rna加入扩增级别dnase i(sigma，usa)室温放置30分钟来去除基因组dna的污染，然后加入停止缓冲液(50mm edta)，70℃加热10分钟变性dnase i和rna；然后采用宝生物工程(大连)有限公司的反转录试剂盒按照试剂盒说明书进行反转录，每个样品取21μg总rna，在42℃下反应1小时，在70℃加热10分钟后取出，置于冰上，以使反转录酶使活；最后取1μl翻转录产物进行实时定量pcr扩增。用sybr green i染料，在abi stepone仪上进行。数据处理采用abi 2中的2-δδct方法计算基因相对表达量。pcr反应条件为：95℃5min,循环1次；95℃10s，60℃30s，共40个循环，72℃单点检测信号。检测结果表明rdbhlh89在所检测的组织中呈现一种组成型表达的模式，而根中的表达量最低，叶其次，在花中的表达量最高(图3)，说明该基因是组成型表达。
38.39.