1.本发明属于组织工程
技术领域：
：。更具体地，涉及一种基于法拉第波的高活性软骨组织的构建方法。
背景技术：
：：2.软骨组织由软骨细胞、基质及纤维构成，由于软骨组织内不含血管、神经和淋巴组织，因此其自我修复能力有限，而工程化软骨组织的出现为软骨损伤的修复和治疗提供了新的方案。3.工程化软骨组织的构建策略主要有“自上而下”和“自下而上”两种。将细胞及生长因子接种于宏观支架的软骨组织构建方法采用的就是“自上而下”的构建策略，其存在着细胞密度低、物质运输困难和细胞分布不均匀等缺陷。而采用“自下而上”的构建策略，以细胞、微组织或载细胞模块等为构造单元，通过生物打印或生物组装等构建软骨组织的方法则不存在上述缺陷，故逐渐成为构建工程化软骨组织的重要手段。4.3d生物打印是“自下而上”策略中应用最为广泛的组装方法，它可以实现多种细胞的有序排列，在构建梯度软骨结构中具备天然的优势；但3d生物打印过程中产生的剪切力会损伤细胞，降低细胞活性，且打印过程耗时较长，在打印大尺寸组织时效率较低，限制了其应用。相较于3d生物打印，法拉第波生物组装以非接触、非侵入方式将微尺度材料或细胞模块组装形成特定形状，可在几秒内实现场内模块的组装，具有更高的效率，因而在构建高活性工程化组织中更具优势。例如，chen等利用法拉第波组装由肝细胞、成纤维细胞和人脐静脉内皮细组成的细胞球，得到了高活性的肝脏组织(chenp,etal.advhealthcaremater,2015,4,1937–1943)。vahidserpooshan等利用法拉第波驱使心肌细胞球快速聚集形成心脏微组织，组装后的细胞活性和代谢水平均维持在较高水平，组装得到的心脏微组织具备天然心肌组织收缩舒张的功能(serpooshanv,etal.biomaterials,2017,131,47-57)。5.虽现有技术中已有利用法拉第波成功组装肝脏组织和心肌组织的报道，但均需先获得相应的细胞球。软骨组织与肝脏组织和心肌组织等高细胞密度的组织不同，软骨组织中含量最丰富的是细胞外基质(ecm)，仅含有少量软骨细胞。因此，现有利用法拉第波组装细胞球获得高密度组织的方法并不适用于工程化软骨组织的构建。技术实现要素：6.本发明要解决的技术问题是克服现有法拉第波组装方法不适用于构建工程化软骨组织的缺陷和不足，提供一种基于法拉第波的高活性软骨组织的构建方法。7.本发明的第一个目的是提供一种基于法拉第波的高活性软骨组织的构建方法。8.本发明的第二个目的是提供所述方法构建得到的工程化高活性软骨组织。9.本发明的第三个目的是提供构建得到的工程化高活性软骨组织在软骨损伤修复、构建软骨疾病模型或药物筛选中的应用。10.本发明上述目的通过以下技术方案实现：11.本发明提供了一种基于法拉第波的高活性软骨组织的构建方法，包括以下步骤：12.s1.将用于构建软骨组织的种子细胞接种于微载体，构建载细胞模块；13.s2.将步骤s1所得载细胞模块均匀分散于组装驱动液中，利用法拉第波声场驱动载细胞模块进行组装、固定和培养。14.作为可选择的实施方式，步骤s1所述种子细胞为骨髓间充质干细胞、骨髓瘤细胞或软骨细胞。15.具体地，所述骨髓瘤细胞为小鼠骨髓瘤细胞atdc5。16.具体地，所述骨髓间充质干细胞为大鼠骨髓间充质干细胞rbmscs。17.作为可选择的实施方式，步骤s1所述微载体为明胶基多孔微球、胶原基多孔微球、透明质酸基多孔微球、硫酸软骨素基多孔微球中的一种或多种。18.作为一种优选的实施方式，步骤s1所用微载体为明胶基多孔微球，所述多孔微球的大小为200～300μm，孔径为10～30μm。19.本发明发现负载于明胶基多孔微球的细胞与未负载于明胶基多孔微球的细胞相比，负载于明胶基多孔微球的细胞的软骨细胞标志基因的表达情况更接近软骨细胞，细胞表现出更高的活性。从组装结果来看，利用负载于明胶基多孔微球的细胞，可以通过法拉第波驱动组装的方法组装得到工程化的软骨组织，且所得工程化的软骨组织与天然软骨组织在组成和结构上相似，具有高活性。软骨组织中除含有少量的软骨细胞外，还含有大量的细胞外基质(ecm)，ecm在软骨组织的结构、力学性能和生理功能中发挥重要作用，是工程化构建软骨组织中不可忽视的重要特征。聚集的明胶基微球可以充当丰富的ecm，如以单细胞、微组织块、类器官、细胞球等为组装单元，由于缺乏足够的ecm，即使能够成功组装获得工程化组织，其组成与结构也与天然软骨组织存在明显差异，不具有高活性。20.具体地，步骤s1中所述单个微载体上接种50～200个细胞。21.具体地，步骤s1中所述载细胞模块的直径小于1mm。22.具体地，步骤s2中所述组装驱动液为甲基丙烯化明胶溶液，组装后通过照射蓝光使其固定。23.甲基丙烯酰化明胶(gelma)为双键改性明胶，本发明所用甲基丙烯酰化明胶为gelma-30，其改性后的氨基取代度为30±5％。24.更具体地，所述甲基丙烯化明胶溶液的质量体积浓度为8％(w/v)；照射蓝光的时间为40s。25.具体地，步骤s2中所述载细胞模块与组装驱动液的用量为每2.5万个载细胞模块分散于1.2ml的组装驱动液中。26.具体地，步骤s2中所述法拉第波声场驱动的驱动条件为：正弦波，频率80hz，振幅经过功率放大器放大后为2～3v。27.具体地，步骤s2中所用组装腔室的形状是圆柱形，直径为20mm，深度为1.5mm。28.具体地，步骤s2所述培养包括组装后的载细胞模块的普通培养和诱导培养；若利用本发明所述构建方法构建工程化的软骨组织所有的种子细胞为骨髓瘤细胞或骨髓间充质干细胞时，在完成组装、固定后，先置于完全培养基中培养7天使细胞增殖，然后将培养基更换为成软骨分化培养基进行成软骨诱导培养。29.具体地，骨髓瘤细胞atdc5所用成软骨分化培养基为：f12/deme基础培养基、10％胎牛血清、1％双抗和1×its。30.具体地，骨髓间充质干细胞rbmscs所用成软骨分化培养基为：f12/deme基础培养基、10％胎牛血清、1％双抗、1×its、10ng/mlbfgf、10ng/mltgf-β1、100nm/l地塞米松(分子量：392.46100)、40g/ml脯氨酸，50g/ml抗坏血酸。31.本发明同时还申请保护利用上述方法构建得到的工程化高活性软骨组织以及所述软骨组织在软骨损伤修复、构建软骨疾病模型或药物筛选中的应用。32.本发明具有以下有益效果：33.本发明提供了一种基于法拉第波的高活性软骨组织的构建方法，利用本发明所述方法，不仅可以制备得到工程化的软骨组织，且所得软骨组织的活性高。本发明克服了现有法拉第波组装方法不适用于构建软骨组织的不足，同时为工程化高活性软骨组织的来源提供了新的构建方法，操作简单，实用性好。附图说明34.图1为本发明所述基于法拉第波的高活性软骨组织的构建方法的流程图。35.图2为组装固定培养不同天数后的载小鼠骨髓瘤细胞微球活死细胞染色结果。36.图3为组装固定培养不同天数后的载小鼠骨髓瘤细胞微球中的细胞增殖的定量实验结果，图中***代表p＜0.001。37.图4为小鼠骨髓瘤细胞诱导成软骨分化0、14、28天后的细胞骨架和细胞核染色结果。38.图5为小鼠骨髓瘤细胞诱导成软骨分化0、7、14、21和28天后rt-qpcr检测结果，图中*代表p＜0.05，**代表p＜0.01，***代表p＜0.001。39.图6为组装固定诱导成软骨分化培养28天后的载小鼠骨髓瘤细胞微球活死细胞染色及细胞骨架和细胞核染色结果；其中，上图为活死细胞染色结果，下图为细胞骨架和细胞核染色结果。40.图7为小鼠骨髓瘤细胞atdc5接种于明胶基多孔微球培养不同天数后的活死细胞染色结果。41.图8为小鼠骨髓瘤细胞atdc5接种于明胶基多孔微球培养7天后不同深度细胞的数量和分布情况。42.图9为二维平板培养的骨髓间充质干细胞与负载于明胶基多孔微球的骨髓间充质干细胞的prg4基因的表达量检测结果，图中*代表p＜0.05，***代表p＜0.001。43.图10为不同浓度gelma溶液固定后的载细胞微球中的活死细胞染色结果。44.图11为组装固定培养不同天数后的载骨髓间充质干细胞微球的活死细胞染色结果。45.图12为组装固定培养不同天数后的载骨髓间充质干细胞微球中的细胞的增殖实验结果，图中***代表p＜0.001。46.图13为骨髓间充质干细胞诱导成软骨分化0、14、28天后的细胞骨架和细胞核染色结果。47.图14为骨髓间充质干细胞诱导成软骨分化0、7、14、21和28天后的rt-qpcr检测结果，图中*代表p＜0.05，***代表p＜0.001。48.图15为组装固定诱导成软骨分化培养28天后的载骨髓间充质干细胞微球活死细胞染色及细胞骨架和细胞核染色结果；其中，上图为活死细胞染色结果，下图为细胞骨架和细胞核染色结果。具体实施方式49.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
：常规试剂、方法和设备。50.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。51.实施例1基于法拉第波的高活性软骨组织的构建方法52.本发明所述基于法拉第波的高活性软骨组织的构建方法包括以下步骤：53.s1.将用于构建软骨组织的种子细胞接种于微载体，构建载细胞模块；54.s2.将步骤s1所得载细胞模块均匀分散于组装驱动液中，利用法拉第波声场驱动载细胞模块进行组装、固定、培养。55.本实施例以小鼠骨髓瘤细胞atdc5和明胶基多孔微球为例，详细说明本发明所述基于法拉第波的高活性软骨组织的构建方法，所述构建方法的流程如图1所示。56.1、构建载细胞模块57.具体步骤如下：58.(1)接种：制备小鼠骨髓瘤细胞atdc5细胞悬液，将所得细胞悬液均匀加至微载体上，待细胞悬液全部浸入微载体；本实施例所用微载体为华龛生物的明胶基微载片(3dtabletrixtm微载片tm，货号为f01-100)，其在吸收细胞悬液中的培养基后会分散成数万个单个的明胶基多孔微球，细胞悬液被吸收后，应无多余细胞悬液流出；本实施例在单个微载体(明胶基多孔微球)上接种了100个细胞；59.(2)贴壁培养：细胞接种结束后，在非tc6孔板的孔间缝隙中滴加2mlpbs，防止培养液蒸发过快，放入细胞培养箱中孵育2小时，使细胞贴壁；60.(3)补液：待细胞贴壁后，向孔中加入8ml完全培养基，放入细胞培养箱中培养；添加培养基时应避免培养基直接冲刷已接种了细胞的微载体，添加培养基后可用枪头轻轻扰动微载体，使其均匀分布，无需完全打散，使微载体团块(载细胞模块)的直径不超过1mm即可，本实施例所述载细胞模块的直径在200～500μm；61.(4)换液：将培养板静置2～5分钟，待微载体全部沉入孔底后，轻轻倾斜培养板，弃除50～70％培养基，补加8ml新鲜培养基，待确保细胞粘附于多孔微球后即可进行组装。62.按照培养需求更换培养基时，应待微载体全部沉降于孔底后，小心弃除培养基，避免微载体损失，再加入新鲜培养基。63.2、法拉第波驱动组装64.本发明经预实验筛选，最终选择用甲基丙烯酰化明胶(gelma)作为法拉第波驱动组装过程中的驱动液和固定液。甲基丙烯酰化明胶(gelma)为双键改性明胶，本发明所用甲基丙烯酰化明胶为gelma-30，其改性后的氨基取代度为30±5％。65.gelma-30溶液的配制方法如下：66.(1)配制0.25％(w/v)引发剂标准溶液67.取10mlpbs溶液加入装有引发剂(lap)的棕色瓶中(内含0.025glap)；40～50℃水浴加热溶解15分钟，期间振荡数次；68.(2)配制gelma溶液69.取所需质量的gelma放入容器(离心管/玻璃瓶/烧杯)中，用引发剂标准溶液室温溶解，将所得gelma溶液用0.22μm无菌针头过滤器灭菌，避光保存，用于后续细胞培养及组装实验。70.法拉第波驱动组装的具体过程如下：71.以实施例1中培养24小时后(此时细胞已粘附于多孔微球上)所得载细胞模块作为组装单元，将其均匀分散于gelma溶液中，1.2ml组装驱动液中加入2.5万个载细胞模块，将含载细胞模块的gelma溶液转移至法拉第波驱动装置的组装腔室(本实施例所用组装腔室的形状是圆柱形，直径为2.0mm，深度为1.5mm)中静置，待载细胞模块均匀沉积到组装腔室底部后，设置驱动条件(法拉第波的驱动条件为正弦波，频率为80hz，振幅经过功率放大器放大后为2～3v)，利用法拉第波声场驱动载细胞模块组装形成图案，通过蓝光照射(40s)使其固定形成凝胶，从而固定组装结果；将固定后的载细胞模块转移到完全培养基中培养7天，待细胞增殖一段时间后，诱导atdc5细胞成软骨分化并表征其分化水平。72.所述诱导成软骨分化过程如下：73.将组装得到的载细胞微球固定后，于完全培养基中培养7天，待细胞数量较多，将培养基更换为成软骨分化培养基，每2天更换一次培养基，于体外诱导其成软骨分化，并通过细胞骨架和细胞核染色以及rt-qpcr检测细胞表型和基因表达量的变化。74.小鼠骨髓瘤细胞atdc5所用成软骨分化培养基成分为：f12/deme基础培养基、10％胎牛血清、1％双抗和1×its。75.3、实验结果76.在诱导成软骨分化前，本发明通过活死细胞染色试验(细胞活死染色试剂盒厂家：efl，货号：efl-cld-001)和cck8试剂盒(biosharp，货号：bs350b-500t)对用完全培养基培养了不同天数(1、3、5、7d)的组装固定后的载细胞微球中的细胞活性和增殖情况进行了检测。组装固定培养不同天数后的载小鼠骨髓瘤细胞微球活死细胞染色结果如图2所示，其中活细胞被钙黄绿素染为绿色，死细胞被碘化丙啶将染为红色。由图2所示结果可知，随着培养时间的延长，死细胞数量逐渐减少，活细胞数量逐渐增加。组装固定培养不同天数后的载小鼠骨髓瘤细胞微球中的细胞增殖(cck8试剂盒)的定量实验结果如图3所示，由图3所示结果可知，组装固定后的细胞维持着较高的增殖速率。上述结果表明，利用本发明所述方法组装后的细胞具有较好的活性和增殖速率。77.本发明利用罗丹明标记的鬼笔环肽(tritcphalloidin)和4,6-联脒-2-苯基吲哚(dapi)对成软骨诱导分化培养不同天数后的细胞进行了细胞骨架和细胞核染色实验，以此对细胞表型变化进行观察。其中，罗丹明标记的鬼笔环肽(tritcphalloidin)将肌动蛋白(细胞骨架)染为了红色，4,6-联脒-2-苯基吲哚(dapi)将细胞核染为了蓝色。小鼠骨髓瘤细胞atdc5诱导成软骨分化0、14、28天后的细胞骨架和细胞核染色结果如图4所示，由图4所示结果可知，随着分化时间的延长，atdc5细胞由原本的梭形逐渐变圆，趋近于软骨细胞的细胞形态。78.col2a1基因编码ii型胶原蛋白的α-1链，此胶原蛋白存在于软骨和玻璃体中，该基因突变与软骨发育不良、早发性家族性骨关节炎等疾病相关；aggrecan(简写agg，又称acan)基因编码软骨特异蛋白聚糖核心蛋白，此蛋白是软骨组织细胞外基质的主要成分，主要用于抵抗软骨的压迫；prg4基因编码蛋白多糖4，其是一种高度糖基化的分泌型粘蛋白样蛋白，在滑膜组织、软骨和肝脏中高度表达，在关节内发挥边界润滑作用，并通过控制粘附依赖的滑膜生长和抑制滑膜细胞与软骨表面的粘附，防止蛋白质从滑膜液沉积到软骨上；sox9基因编码的蛋白在软骨细胞分化过程中起作用，缺乏可导致骨骼畸形综合征；以上四种基因的表达量增加都可以证明骨髓间充质干细胞及骨髓瘤细胞向软骨细胞方向分化。因此，本发明通过检测上述四种基因的表达量变化，对成软骨诱导分化后的细胞进行表征。79.小鼠骨髓瘤细胞atdc5诱导成软骨分化0、7、14、21和28天后rt-qpcr检测结果如图5所示，将未分化的atdc5的目的基因相对表达量设为1，由图5所示的rt-qpcr检测结果可知，随着分化时间的延长，ii型胶原(col2a1)及蛋白聚糖(aggrecan)的表达水平显著增高，细胞的基因型也趋近于软骨细胞，表明加入诱导软骨分化培养基后，随着培养时间的延长细胞成软骨分化程度逐渐增强。80.组装固定诱导成软骨分化培养28天后的载小鼠骨髓瘤细胞微球活死细胞染色及细胞骨架和细胞核染色结果如图6所示，由图6所示结果可知，培养28天后的多孔微球通过细胞紧密连接在一起，且维持着较高的细胞活性，表明利用本发明所述方法可以得到高活性的组织。81.上述结果表明，利用本发明所述方法，可以将骨髓瘤细胞构建得到高活性的工程化软骨组织。82.实施例283.本发明利用上述方法将小鼠骨髓瘤细胞atdc5接种于明胶基多孔微球后分别培养了1、3、5、7天，通过活死细胞染色实验观察了微球上细胞的活性和增殖情况。培养7天后，还通过激光共聚焦显微镜观察了微球不同深度细胞的数量和分布情况，即从多孔微球顶部开始，分别观察10、20、30、40、50和60μm处横截面上细胞的数量和分布情况。84.小鼠骨髓瘤细胞atdc5接种于明胶基多孔微球培养不同天数后的活死细胞染色结果如图7所示，由图7可知，活细胞数量多，死细胞数量少，且随着培养天数的延长，细胞数量明显增多，表明明胶基多孔微球没有细胞毒性且可以维持细胞的增殖。明胶基多孔微球不同深度细胞的数量和分布情况如图8所示，由图8所示结果可知，细胞不仅存在于微球的表面，微球的内部也含有细胞，表明细胞可以迁移到微球内部。上述结果表明，明胶基多孔微球有利于细胞的粘附、生长、增殖和迁移，由此可以得到负载足够数量细胞的载细胞微球，可作为组装模块进行后续实验。85.本发明通过将接种于明胶基多孔微球的骨髓间充质干细胞和二维平板培养的骨髓间充质干细胞置于相同培养条件下，分别诱导分化培养了0、7、14、21和28天后，检测了细胞prg4基因(软骨细胞标志基因)的表达量。二维平板培养的骨髓间充质干细胞与负载于明胶基多孔微球的骨髓间充质干细胞的prg4基因的表达量检测结果如图9所示，由图9所示结果可知，与生长于二维平板的细胞相比，负载于明胶基多孔微球的骨髓间充质干细胞的软骨细胞标志基因表达量更接近软骨细胞，细胞表现出更高的活性。从组装结果来看，利用负载于明胶基多孔微球的细胞，可以通过法拉第波驱动组装的方法组装得到工程化的软骨组织，且所得工程化的软骨组织与天然软骨组织在组成和结构上相似，具有高活性。软骨组织中除含少量的软骨细胞外，还含有大量的细胞外基质(ecm)，ecm在软骨组织的结构、力学性能和生理功能中发挥重要作用，是工程化构建软骨组织中不可忽视的重要特征。聚集的明胶基微球可以充当丰富的ecm，如以单细胞、微组织块、类器官、细胞球等为组装单元，由于缺乏足够的ecm，即使能够成功组装获得工程化组织，其组成与结构也与天然软骨组织存在明显差异，不具有高活性。86.实施例387.本实施例检测了固定液(甲基丙烯酰化明胶溶液)浓度对细胞活性的影响。88.本发明利用实施例1所述gelma-30溶液的配制方法，分别配制了质量体积百分比(w/v)浓度为6％、7％、8％、9％和10％的gelma溶液，在利用法拉第波声场驱动组装形成图案后，分别用不同浓度的gelma溶液固定，固定后培养24小时，通过活死细胞染色试验观察细胞活性。不同浓度gelma溶液固定后的载细胞微球中的活死细胞染色结果如图10所示，由图10所示结果可知，当浓度为8％(w/v)时，只有少量死细胞出现，细胞活性较好，故确定固定液浓度为8％(w/v)，组装驱动液也采用相同的浓度。89.实施例490.本实施例以大鼠骨髓间充质干细胞rbmscs作为种子细胞，利用实施例1所述构建方法构建了工程化的软骨组织，除所用细胞和诱导成软骨分化培养基不同外，其余条件均与实施例1相同，驱动液和固定液，即gelma的浓度为8％(w/v)。91.在诱导成软骨分化前，本实施例通过活死细胞染色试验和cck8试剂盒对用完全培养基培养了不同天数(1、3、5、7d)的组装固定后的载细胞微球中的骨髓间充质干细胞的细胞活性和增殖情况进行了检测。组装固定培养不同天数后的载骨髓间充质干细胞微球的活死细胞染色结果如图11所示，由图11所示结果可知，随着培养时间的延长，死细胞数量逐渐减少，活细胞数量逐渐增加，表明细胞活性良好。组装固定培养不同天数后的载骨髓间充质干细胞微球中的细胞的增殖实验结果如图12所示，由图12可知，组装固定后的细胞维持着较高的增殖速率。上述结果表明，利用本发明所述方法组装后的骨髓间充质干细胞细胞具有较好的活性和增殖速率。92.骨髓间充质干细胞诱导成软骨分化0、14、28天后的细胞骨架和细胞核染色结果如图13所示，由图13所示结果可知，随着分化时间的延长，骨髓间充质干细胞由原本的梭形逐渐变圆，趋近于软骨细胞的细胞形态，表明随着诱导分化时间的延长，骨髓间充质干细胞的表型接近于软骨细胞。93.骨髓间充质干细胞诱导成软骨分化0、7、14、21和28天后的rt-qpcr检测结果如图14所示，由图14所示rt-qpcr检测结果可知，随着分化时间的延长，col2a1和prg4的表达水平显著性增高，细胞的基因型趋向于软骨细胞，表明随着诱导分化培养时间的延长细胞成软骨分化程度逐渐增强。94.组装固定诱导成软骨分化培养28天后的载骨髓间充质干细胞微球活死细胞染色及细胞骨架和细胞核染色结果如图15所示，其中，上图为活死细胞染色结果，下图为细胞骨架和细胞核染色结果。由图15所示结果可知，培养28天后的多孔微球通过骨髓间充质干细胞细胞紧密连接在一起，且维持着较高的细胞活性，表明利用本发明所述方法可以得到高活性的组织。95.上述结果表明，利用本发明所述方法，可以将骨髓间充质干细胞构建得到高活性的工程化软骨组织。96.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：。更具体地，涉及一种基于法拉第波的高活性软骨组织的构建方法。
背景技术：
：：2.软骨组织由软骨细胞、基质及纤维构成，由于软骨组织内不含血管、神经和淋巴组织，因此其自我修复能力有限，而工程化软骨组织的出现为软骨损伤的修复和治疗提供了新的方案。3.工程化软骨组织的构建策略主要有“自上而下”和“自下而上”两种。将细胞及生长因子接种于宏观支架的软骨组织构建方法采用的就是“自上而下”的构建策略，其存在着细胞密度低、物质运输困难和细胞分布不均匀等缺陷。而采用“自下而上”的构建策略，以细胞、微组织或载细胞模块等为构造单元，通过生物打印或生物组装等构建软骨组织的方法则不存在上述缺陷，故逐渐成为构建工程化软骨组织的重要手段。4.3d生物打印是“自下而上”策略中应用最为广泛的组装方法，它可以实现多种细胞的有序排列，在构建梯度软骨结构中具备天然的优势；但3d生物打印过程中产生的剪切力会损伤细胞，降低细胞活性，且打印过程耗时较长，在打印大尺寸组织时效率较低，限制了其应用。相较于3d生物打印，法拉第波生物组装以非接触、非侵入方式将微尺度材料或细胞模块组装形成特定形状，可在几秒内实现场内模块的组装，具有更高的效率，因而在构建高活性工程化组织中更具优势。例如，chen等利用法拉第波组装由肝细胞、成纤维细胞和人脐静脉内皮细组成的细胞球，得到了高活性的肝脏组织(chenp,etal.advhealthcaremater,2015,4,1937–1943)。vahidserpooshan等利用法拉第波驱使心肌细胞球快速聚集形成心脏微组织，组装后的细胞活性和代谢水平均维持在较高水平，组装得到的心脏微组织具备天然心肌组织收缩舒张的功能(serpooshanv,etal.biomaterials,2017,131,47-57)。5.虽现有技术中已有利用法拉第波成功组装肝脏组织和心肌组织的报道，但均需先获得相应的细胞球。软骨组织与肝脏组织和心肌组织等高细胞密度的组织不同，软骨组织中含量最丰富的是细胞外基质(ecm)，仅含有少量软骨细胞。因此，现有利用法拉第波组装细胞球获得高密度组织的方法并不适用于工程化软骨组织的构建。技术实现要素：6.本发明要解决的技术问题是克服现有法拉第波组装方法不适用于构建工程化软骨组织的缺陷和不足，提供一种基于法拉第波的高活性软骨组织的构建方法。7.本发明的第一个目的是提供一种基于法拉第波的高活性软骨组织的构建方法。8.本发明的第二个目的是提供所述方法构建得到的工程化高活性软骨组织。9.本发明的第三个目的是提供构建得到的工程化高活性软骨组织在软骨损伤修复、构建软骨疾病模型或药物筛选中的应用。10.本发明上述目的通过以下技术方案实现：11.本发明提供了一种基于法拉第波的高活性软骨组织的构建方法，包括以下步骤：12.s1.将用于构建软骨组织的种子细胞接种于微载体，构建载细胞模块；13.s2.将步骤s1所得载细胞模块均匀分散于组装驱动液中，利用法拉第波声场驱动载细胞模块进行组装、固定和培养。14.作为可选择的实施方式，步骤s1所述种子细胞为骨髓间充质干细胞、骨髓瘤细胞或软骨细胞。15.具体地，所述骨髓瘤细胞为小鼠骨髓瘤细胞atdc5。16.具体地，所述骨髓间充质干细胞为大鼠骨髓间充质干细胞rbmscs。17.作为可选择的实施方式，步骤s1所述微载体为明胶基多孔微球、胶原基多孔微球、透明质酸基多孔微球、硫酸软骨素基多孔微球中的一种或多种。18.作为一种优选的实施方式，步骤s1所用微载体为明胶基多孔微球，所述多孔微球的大小为200～300μm，孔径为10～30μm。19.本发明发现负载于明胶基多孔微球的细胞与未负载于明胶基多孔微球的细胞相比，负载于明胶基多孔微球的细胞的软骨细胞标志基因的表达情况更接近软骨细胞，细胞表现出更高的活性。从组装结果来看，利用负载于明胶基多孔微球的细胞，可以通过法拉第波驱动组装的方法组装得到工程化的软骨组织，且所得工程化的软骨组织与天然软骨组织在组成和结构上相似，具有高活性。软骨组织中除含有少量的软骨细胞外，还含有大量的细胞外基质(ecm)，ecm在软骨组织的结构、力学性能和生理功能中发挥重要作用，是工程化构建软骨组织中不可忽视的重要特征。聚集的明胶基微球可以充当丰富的ecm，如以单细胞、微组织块、类器官、细胞球等为组装单元，由于缺乏足够的ecm，即使能够成功组装获得工程化组织，其组成与结构也与天然软骨组织存在明显差异，不具有高活性。20.具体地，步骤s1中所述单个微载体上接种50～200个细胞。21.具体地，步骤s1中所述载细胞模块的直径小于1mm。22.具体地，步骤s2中所述组装驱动液为甲基丙烯化明胶溶液，组装后通过照射蓝光使其固定。23.甲基丙烯酰化明胶(gelma)为双键改性明胶，本发明所用甲基丙烯酰化明胶为gelma-30，其改性后的氨基取代度为30±5％。24.更具体地，所述甲基丙烯化明胶溶液的质量体积浓度为8％(w/v)；照射蓝光的时间为40s。25.具体地，步骤s2中所述载细胞模块与组装驱动液的用量为每2.5万个载细胞模块分散于1.2ml的组装驱动液中。26.具体地，步骤s2中所述法拉第波声场驱动的驱动条件为：正弦波，频率80hz，振幅经过功率放大器放大后为2～3v。27.具体地，步骤s2中所用组装腔室的形状是圆柱形，直径为20mm，深度为1.5mm。28.具体地，步骤s2所述培养包括组装后的载细胞模块的普通培养和诱导培养；若利用本发明所述构建方法构建工程化的软骨组织所有的种子细胞为骨髓瘤细胞或骨髓间充质干细胞时，在完成组装、固定后，先置于完全培养基中培养7天使细胞增殖，然后将培养基更换为成软骨分化培养基进行成软骨诱导培养。29.具体地，骨髓瘤细胞atdc5所用成软骨分化培养基为：f12/deme基础培养基、10％胎牛血清、1％双抗和1×its。30.具体地，骨髓间充质干细胞rbmscs所用成软骨分化培养基为：f12/deme基础培养基、10％胎牛血清、1％双抗、1×its、10ng/mlbfgf、10ng/mltgf-β1、100nm/l地塞米松(分子量：392.46100)、40g/ml脯氨酸，50g/ml抗坏血酸。31.本发明同时还申请保护利用上述方法构建得到的工程化高活性软骨组织以及所述软骨组织在软骨损伤修复、构建软骨疾病模型或药物筛选中的应用。32.本发明具有以下有益效果：33.本发明提供了一种基于法拉第波的高活性软骨组织的构建方法，利用本发明所述方法，不仅可以制备得到工程化的软骨组织，且所得软骨组织的活性高。本发明克服了现有法拉第波组装方法不适用于构建软骨组织的不足，同时为工程化高活性软骨组织的来源提供了新的构建方法，操作简单，实用性好。附图说明34.图1为本发明所述基于法拉第波的高活性软骨组织的构建方法的流程图。35.图2为组装固定培养不同天数后的载小鼠骨髓瘤细胞微球活死细胞染色结果。36.图3为组装固定培养不同天数后的载小鼠骨髓瘤细胞微球中的细胞增殖的定量实验结果，图中***代表p＜0.001。37.图4为小鼠骨髓瘤细胞诱导成软骨分化0、14、28天后的细胞骨架和细胞核染色结果。38.图5为小鼠骨髓瘤细胞诱导成软骨分化0、7、14、21和28天后rt-qpcr检测结果，图中*代表p＜0.05，**代表p＜0.01，***代表p＜0.001。39.图6为组装固定诱导成软骨分化培养28天后的载小鼠骨髓瘤细胞微球活死细胞染色及细胞骨架和细胞核染色结果；其中，上图为活死细胞染色结果，下图为细胞骨架和细胞核染色结果。40.图7为小鼠骨髓瘤细胞atdc5接种于明胶基多孔微球培养不同天数后的活死细胞染色结果。41.图8为小鼠骨髓瘤细胞atdc5接种于明胶基多孔微球培养7天后不同深度细胞的数量和分布情况。42.图9为二维平板培养的骨髓间充质干细胞与负载于明胶基多孔微球的骨髓间充质干细胞的prg4基因的表达量检测结果，图中*代表p＜0.05，***代表p＜0.001。43.图10为不同浓度gelma溶液固定后的载细胞微球中的活死细胞染色结果。44.图11为组装固定培养不同天数后的载骨髓间充质干细胞微球的活死细胞染色结果。45.图12为组装固定培养不同天数后的载骨髓间充质干细胞微球中的细胞的增殖实验结果，图中***代表p＜0.001。46.图13为骨髓间充质干细胞诱导成软骨分化0、14、28天后的细胞骨架和细胞核染色结果。47.图14为骨髓间充质干细胞诱导成软骨分化0、7、14、21和28天后的rt-qpcr检测结果，图中*代表p＜0.05，***代表p＜0.001。48.图15为组装固定诱导成软骨分化培养28天后的载骨髓间充质干细胞微球活死细胞染色及细胞骨架和细胞核染色结果；其中，上图为活死细胞染色结果，下图为细胞骨架和细胞核染色结果。具体实施方式49.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
：常规试剂、方法和设备。50.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。51.实施例1基于法拉第波的高活性软骨组织的构建方法52.本发明所述基于法拉第波的高活性软骨组织的构建方法包括以下步骤：53.s1.将用于构建软骨组织的种子细胞接种于微载体，构建载细胞模块；54.s2.将步骤s1所得载细胞模块均匀分散于组装驱动液中，利用法拉第波声场驱动载细胞模块进行组装、固定、培养。55.本实施例以小鼠骨髓瘤细胞atdc5和明胶基多孔微球为例，详细说明本发明所述基于法拉第波的高活性软骨组织的构建方法，所述构建方法的流程如图1所示。56.1、构建载细胞模块57.具体步骤如下：58.(1)接种：制备小鼠骨髓瘤细胞atdc5细胞悬液，将所得细胞悬液均匀加至微载体上，待细胞悬液全部浸入微载体；本实施例所用微载体为华龛生物的明胶基微载片(3dtabletrixtm微载片tm，货号为f01-100)，其在吸收细胞悬液中的培养基后会分散成数万个单个的明胶基多孔微球，细胞悬液被吸收后，应无多余细胞悬液流出；本实施例在单个微载体(明胶基多孔微球)上接种了100个细胞；59.(2)贴壁培养：细胞接种结束后，在非tc6孔板的孔间缝隙中滴加2mlpbs，防止培养液蒸发过快，放入细胞培养箱中孵育2小时，使细胞贴壁；60.(3)补液：待细胞贴壁后，向孔中加入8ml完全培养基，放入细胞培养箱中培养；添加培养基时应避免培养基直接冲刷已接种了细胞的微载体，添加培养基后可用枪头轻轻扰动微载体，使其均匀分布，无需完全打散，使微载体团块(载细胞模块)的直径不超过1mm即可，本实施例所述载细胞模块的直径在200～500μm；61.(4)换液：将培养板静置2～5分钟，待微载体全部沉入孔底后，轻轻倾斜培养板，弃除50～70％培养基，补加8ml新鲜培养基，待确保细胞粘附于多孔微球后即可进行组装。62.按照培养需求更换培养基时，应待微载体全部沉降于孔底后，小心弃除培养基，避免微载体损失，再加入新鲜培养基。63.2、法拉第波驱动组装64.本发明经预实验筛选，最终选择用甲基丙烯酰化明胶(gelma)作为法拉第波驱动组装过程中的驱动液和固定液。甲基丙烯酰化明胶(gelma)为双键改性明胶，本发明所用甲基丙烯酰化明胶为gelma-30，其改性后的氨基取代度为30±5％。65.gelma-30溶液的配制方法如下：66.(1)配制0.25％(w/v)引发剂标准溶液67.取10mlpbs溶液加入装有引发剂(lap)的棕色瓶中(内含0.025glap)；40～50℃水浴加热溶解15分钟，期间振荡数次；68.(2)配制gelma溶液69.取所需质量的gelma放入容器(离心管/玻璃瓶/烧杯)中，用引发剂标准溶液室温溶解，将所得gelma溶液用0.22μm无菌针头过滤器灭菌，避光保存，用于后续细胞培养及组装实验。70.法拉第波驱动组装的具体过程如下：71.以实施例1中培养24小时后(此时细胞已粘附于多孔微球上)所得载细胞模块作为组装单元，将其均匀分散于gelma溶液中，1.2ml组装驱动液中加入2.5万个载细胞模块，将含载细胞模块的gelma溶液转移至法拉第波驱动装置的组装腔室(本实施例所用组装腔室的形状是圆柱形，直径为2.0mm，深度为1.5mm)中静置，待载细胞模块均匀沉积到组装腔室底部后，设置驱动条件(法拉第波的驱动条件为正弦波，频率为80hz，振幅经过功率放大器放大后为2～3v)，利用法拉第波声场驱动载细胞模块组装形成图案，通过蓝光照射(40s)使其固定形成凝胶，从而固定组装结果；将固定后的载细胞模块转移到完全培养基中培养7天，待细胞增殖一段时间后，诱导atdc5细胞成软骨分化并表征其分化水平。72.所述诱导成软骨分化过程如下：73.将组装得到的载细胞微球固定后，于完全培养基中培养7天，待细胞数量较多，将培养基更换为成软骨分化培养基，每2天更换一次培养基，于体外诱导其成软骨分化，并通过细胞骨架和细胞核染色以及rt-qpcr检测细胞表型和基因表达量的变化。74.小鼠骨髓瘤细胞atdc5所用成软骨分化培养基成分为：f12/deme基础培养基、10％胎牛血清、1％双抗和1×its。75.3、实验结果76.在诱导成软骨分化前，本发明通过活死细胞染色试验(细胞活死染色试剂盒厂家：efl，货号：efl-cld-001)和cck8试剂盒(biosharp，货号：bs350b-500t)对用完全培养基培养了不同天数(1、3、5、7d)的组装固定后的载细胞微球中的细胞活性和增殖情况进行了检测。组装固定培养不同天数后的载小鼠骨髓瘤细胞微球活死细胞染色结果如图2所示，其中活细胞被钙黄绿素染为绿色，死细胞被碘化丙啶将染为红色。由图2所示结果可知，随着培养时间的延长，死细胞数量逐渐减少，活细胞数量逐渐增加。组装固定培养不同天数后的载小鼠骨髓瘤细胞微球中的细胞增殖(cck8试剂盒)的定量实验结果如图3所示，由图3所示结果可知，组装固定后的细胞维持着较高的增殖速率。上述结果表明，利用本发明所述方法组装后的细胞具有较好的活性和增殖速率。77.本发明利用罗丹明标记的鬼笔环肽(tritcphalloidin)和4,6-联脒-2-苯基吲哚(dapi)对成软骨诱导分化培养不同天数后的细胞进行了细胞骨架和细胞核染色实验，以此对细胞表型变化进行观察。其中，罗丹明标记的鬼笔环肽(tritcphalloidin)将肌动蛋白(细胞骨架)染为了红色，4,6-联脒-2-苯基吲哚(dapi)将细胞核染为了蓝色。小鼠骨髓瘤细胞atdc5诱导成软骨分化0、14、28天后的细胞骨架和细胞核染色结果如图4所示，由图4所示结果可知，随着分化时间的延长，atdc5细胞由原本的梭形逐渐变圆，趋近于软骨细胞的细胞形态。78.col2a1基因编码ii型胶原蛋白的α-1链，此胶原蛋白存在于软骨和玻璃体中，该基因突变与软骨发育不良、早发性家族性骨关节炎等疾病相关；aggrecan(简写agg，又称acan)基因编码软骨特异蛋白聚糖核心蛋白，此蛋白是软骨组织细胞外基质的主要成分，主要用于抵抗软骨的压迫；prg4基因编码蛋白多糖4，其是一种高度糖基化的分泌型粘蛋白样蛋白，在滑膜组织、软骨和肝脏中高度表达，在关节内发挥边界润滑作用，并通过控制粘附依赖的滑膜生长和抑制滑膜细胞与软骨表面的粘附，防止蛋白质从滑膜液沉积到软骨上；sox9基因编码的蛋白在软骨细胞分化过程中起作用，缺乏可导致骨骼畸形综合征；以上四种基因的表达量增加都可以证明骨髓间充质干细胞及骨髓瘤细胞向软骨细胞方向分化。因此，本发明通过检测上述四种基因的表达量变化，对成软骨诱导分化后的细胞进行表征。79.小鼠骨髓瘤细胞atdc5诱导成软骨分化0、7、14、21和28天后rt-qpcr检测结果如图5所示，将未分化的atdc5的目的基因相对表达量设为1，由图5所示的rt-qpcr检测结果可知，随着分化时间的延长，ii型胶原(col2a1)及蛋白聚糖(aggrecan)的表达水平显著增高，细胞的基因型也趋近于软骨细胞，表明加入诱导软骨分化培养基后，随着培养时间的延长细胞成软骨分化程度逐渐增强。80.组装固定诱导成软骨分化培养28天后的载小鼠骨髓瘤细胞微球活死细胞染色及细胞骨架和细胞核染色结果如图6所示，由图6所示结果可知，培养28天后的多孔微球通过细胞紧密连接在一起，且维持着较高的细胞活性，表明利用本发明所述方法可以得到高活性的组织。81.上述结果表明，利用本发明所述方法，可以将骨髓瘤细胞构建得到高活性的工程化软骨组织。82.实施例283.本发明利用上述方法将小鼠骨髓瘤细胞atdc5接种于明胶基多孔微球后分别培养了1、3、5、7天，通过活死细胞染色实验观察了微球上细胞的活性和增殖情况。培养7天后，还通过激光共聚焦显微镜观察了微球不同深度细胞的数量和分布情况，即从多孔微球顶部开始，分别观察10、20、30、40、50和60μm处横截面上细胞的数量和分布情况。84.小鼠骨髓瘤细胞atdc5接种于明胶基多孔微球培养不同天数后的活死细胞染色结果如图7所示，由图7可知，活细胞数量多，死细胞数量少，且随着培养天数的延长，细胞数量明显增多，表明明胶基多孔微球没有细胞毒性且可以维持细胞的增殖。明胶基多孔微球不同深度细胞的数量和分布情况如图8所示，由图8所示结果可知，细胞不仅存在于微球的表面，微球的内部也含有细胞，表明细胞可以迁移到微球内部。上述结果表明，明胶基多孔微球有利于细胞的粘附、生长、增殖和迁移，由此可以得到负载足够数量细胞的载细胞微球，可作为组装模块进行后续实验。85.本发明通过将接种于明胶基多孔微球的骨髓间充质干细胞和二维平板培养的骨髓间充质干细胞置于相同培养条件下，分别诱导分化培养了0、7、14、21和28天后，检测了细胞prg4基因(软骨细胞标志基因)的表达量。二维平板培养的骨髓间充质干细胞与负载于明胶基多孔微球的骨髓间充质干细胞的prg4基因的表达量检测结果如图9所示，由图9所示结果可知，与生长于二维平板的细胞相比，负载于明胶基多孔微球的骨髓间充质干细胞的软骨细胞标志基因表达量更接近软骨细胞，细胞表现出更高的活性。从组装结果来看，利用负载于明胶基多孔微球的细胞，可以通过法拉第波驱动组装的方法组装得到工程化的软骨组织，且所得工程化的软骨组织与天然软骨组织在组成和结构上相似，具有高活性。软骨组织中除含少量的软骨细胞外，还含有大量的细胞外基质(ecm)，ecm在软骨组织的结构、力学性能和生理功能中发挥重要作用，是工程化构建软骨组织中不可忽视的重要特征。聚集的明胶基微球可以充当丰富的ecm，如以单细胞、微组织块、类器官、细胞球等为组装单元，由于缺乏足够的ecm，即使能够成功组装获得工程化组织，其组成与结构也与天然软骨组织存在明显差异，不具有高活性。86.实施例387.本实施例检测了固定液(甲基丙烯酰化明胶溶液)浓度对细胞活性的影响。88.本发明利用实施例1所述gelma-30溶液的配制方法，分别配制了质量体积百分比(w/v)浓度为6％、7％、8％、9％和10％的gelma溶液，在利用法拉第波声场驱动组装形成图案后，分别用不同浓度的gelma溶液固定，固定后培养24小时，通过活死细胞染色试验观察细胞活性。不同浓度gelma溶液固定后的载细胞微球中的活死细胞染色结果如图10所示，由图10所示结果可知，当浓度为8％(w/v)时，只有少量死细胞出现，细胞活性较好，故确定固定液浓度为8％(w/v)，组装驱动液也采用相同的浓度。89.实施例490.本实施例以大鼠骨髓间充质干细胞rbmscs作为种子细胞，利用实施例1所述构建方法构建了工程化的软骨组织，除所用细胞和诱导成软骨分化培养基不同外，其余条件均与实施例1相同，驱动液和固定液，即gelma的浓度为8％(w/v)。91.在诱导成软骨分化前，本实施例通过活死细胞染色试验和cck8试剂盒对用完全培养基培养了不同天数(1、3、5、7d)的组装固定后的载细胞微球中的骨髓间充质干细胞的细胞活性和增殖情况进行了检测。组装固定培养不同天数后的载骨髓间充质干细胞微球的活死细胞染色结果如图11所示，由图11所示结果可知，随着培养时间的延长，死细胞数量逐渐减少，活细胞数量逐渐增加，表明细胞活性良好。组装固定培养不同天数后的载骨髓间充质干细胞微球中的细胞的增殖实验结果如图12所示，由图12可知，组装固定后的细胞维持着较高的增殖速率。上述结果表明，利用本发明所述方法组装后的骨髓间充质干细胞细胞具有较好的活性和增殖速率。92.骨髓间充质干细胞诱导成软骨分化0、14、28天后的细胞骨架和细胞核染色结果如图13所示，由图13所示结果可知，随着分化时间的延长，骨髓间充质干细胞由原本的梭形逐渐变圆，趋近于软骨细胞的细胞形态，表明随着诱导分化时间的延长，骨髓间充质干细胞的表型接近于软骨细胞。93.骨髓间充质干细胞诱导成软骨分化0、7、14、21和28天后的rt-qpcr检测结果如图14所示，由图14所示rt-qpcr检测结果可知，随着分化时间的延长，col2a1和prg4的表达水平显著性增高，细胞的基因型趋向于软骨细胞，表明随着诱导分化培养时间的延长细胞成软骨分化程度逐渐增强。94.组装固定诱导成软骨分化培养28天后的载骨髓间充质干细胞微球活死细胞染色及细胞骨架和细胞核染色结果如图15所示，其中，上图为活死细胞染色结果，下图为细胞骨架和细胞核染色结果。由图15所示结果可知，培养28天后的多孔微球通过骨髓间充质干细胞细胞紧密连接在一起，且维持着较高的细胞活性，表明利用本发明所述方法可以得到高活性的组织。95.上述结果表明，利用本发明所述方法，可以将骨髓间充质干细胞构建得到高活性的工程化软骨组织。96.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12当前第1页12
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