一种重组表达载体、降解苯酚的基因工程菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种重组表达载体、降解苯酚的 基因工程菌及其应用。


背景技术：

2.苯酚是一种具有高毒性和腐蚀性且难以被自然生态系统净化的有机污染 物，广泛存在于石油、化工、冶金、煤气等工业生产所排放的废水中。苯酚不 仅对人和动植物等有明显的毒害作用，而且不合理的排放还会导致生态环境的 污染。因此，它是我国及其他一些国家优先控制的污染物。
3.微生物法处理含酚废水具有处理效率高、能源消耗少、处理费用低、设备 投资较少、运行相对简单等优点。在受酚类化合物及其衍生物污染的环境中， 已经筛选并分离到多种能够降解苯酚的高效微生物菌种，通过对其降解性质、 降解条件、对苯酚的耐受性及降解效率进行研究，进而将其投入到废水处理系 统中，得到较好的处理效果。
4.微生物对苯酚的好氧降解过程是利用苯酚羟化酶将苯酚催化转化为邻苯二 酚，邻苯二酚通过两条不同的途径形成碳氢化合物，最终生成乙酰辅酶a、琥 珀酸、乙酸和丙酮酸等中间产物，进入三羧酸循环，为微生物的新陈代谢提供 所需要的能量。苯酚羟化酶的活性在微生物对苯酚的降解能力中起决定性作用。
5.如何保持降酚菌株的高降解活性、提高降解速率是生物法处理含酚废水的 主要问题。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于解决现有技术中存在的降酚菌株的苯酚羟化酶活性较 低，对苯酚的降解速率不高的问题，提供一种重组表达载体、降解苯酚的基因 工程菌及其应用。
7.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种重组表达载体， 含有苯酚羟化酶基因，所述苯酚羟化酶基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
8.优选地，扩增所述苯酚羟化酶基因的引物序列如seq id no.2和seq idno.3所示。
9.优选地，所述苯酚羟化酶基因来自美棒状杆菌(corynebacterium callunae)yz01，所述美棒状杆菌yz01保藏于武汉中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为：cctcc no:m2022554。
10.本发明同时提供一种降解苯酚的基因工程菌，该基因工程菌含有上述重组 表达载体。
11.优选地，所述基因工程菌的宿主菌为大肠杆菌bl21。
12.本发明还提供上述基因工程菌在降解苯酚中的应用。
13.本发明所具有的有益效果：本发明从美棒状杆菌中克隆得到苯酚羟化酶基 因，构建重组表达载体后，转化入大肠杆菌，表达得到苯酚羟化酶；测定其酶 活为105.8u/ml，比
活度达到了12.3u/mg，具有较高的酶活，可用于高效降解 含酚废水，在工业废水处理中具有非常广泛的应用前景。
附图说明
14.图1为实施例1中pcr扩增得到的苯酚羟化酶基因片段的电泳图；
15.图2为实施例1中苯酚羟化酶基因成功插入表达载体的电泳验证图；
16.图3为实施例2中蛋白质电泳检测苯酚羟化酶的表达情况；
17.图4为实施例3中苯酚羟化酶酶活性测定图。
具体实施方式
18.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。
19.pet-32a质粒购自湖南丰晖生物科技有限公司；kpni、ecori以及10
×
m buffer 均购自宝生物工程(大连)有限公司；pcr产物纯化及胶回收试剂盒购自北京 擎科生物有限公司；t4 dna ligase以及10
×
t4 dna ligase buffer均购自宝生物 工程(大连)有限公司；大肠杆菌感受态细胞bl21购自宝生物工程(大连)有 限公司；美棒状杆菌(corynebacterium callunae)yz01筛选于绵阳某绝缘材料厂 的活性污泥中，分类命名为：escherichia coli phea1；于2022年05月03日保 藏于武汉的中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉，武汉大学；保藏编 号为：cctcc no:m2022554。
20.实施例1构建重组表达载体
21.1、pcr扩增苯酚羟化酶基因
22.将美棒状杆菌yz01中的苯酚羟化酶基因序列导入primer 5软件设计引物， 引物序列如seq id no.2和seq id no.3所示。以美棒状杆菌yz01的dna为 模板，进行pcr扩增获得目的片段。pcr反应体系25ul：模板(总dna)0.5 ul、上下游引物各0.5ul、2
×
pcrmix 12.5ul和ddh2o 11ul。pcr反应条件：95℃ 3min；95℃30s；55℃30s；72℃60s；循环数34；72℃5min。以1％琼脂糖凝 胶电泳验证并回收pcr扩增产物，扩增得到的片段与全基因组测序注释的基因 长度基本一致(附图1)，并将回收后的基因片段寄至北京擎科生物有限公司进 行测序，目的片段苯酚羟化酶基因序列如seq id no.1所示。
23.将测序返回结果与genebank数据库中的数据进行blast比对，结果表明 与基因相似度≥98％，可以确定克隆得到的基因片段为苯酚羟化酶基因。
24.2、重组质粒构建
25.用kpn i和ecor i限制性内切酶对目的基因片段及克隆表达载体pet-32a 进行双酶切。将双酶切后的目的基因片段与克隆表达载体pet-32a相连接，获得 重组表达载体。
26.目的基因的酶切体系(20ul)及条件为：ddh2o 6ul、目的基因片段10ul、 10
×
mbuffer 2ul、kpni 1ul、ecori 1ul；温度37℃，时间3h。克隆表达载体的酶 切体系(20ul)及条件为ddh2o 8ul、pet-32a 8ul、10
×
m buffer 2ul、kpni 1ul、 ecori 1ul；温度37℃，时间3h。
27.连接反应体系(10ul)及条件如下：目的基因片段7ul、pet-32a载体1ul、 t4 dnaligase 1ul、10
×
t4 dna ligase buffer 1ul；温度16℃、时间2h。
28.3、重组表达载体的验证
29.将上述构建的重组表达载体通过化学转化方法转入e.coli dh5α。
30.其具体步骤为：
31.(1)在冰上融化e.coli dh5α感受态细胞，用移液枪吸取10ul连接产物加 入到感受态细胞中，用枪头轻柔搅拌均匀冰浴30min；
32.(2)42℃热激细胞90s，不要摇动，轻移至冰浴2-3min后加入900ullb培 养基，37℃，220rpm在摇床水平震荡1-1.5h；
33.(3)取100ul转化产物，涂布于包含50ug/ml的氨苄青霉素的lb平板上， 37℃过夜培养，挑取单菌落，分别接种于含有50ug/ml的氨苄青霉素的lb液 体培养基，37℃，220rpm培养10h，提取质粒。重组质粒经pcr及双酶切鉴定 目的片段已经成功插入了表达载体(附图2)。
34.实施例2构建重组表达菌株并诱导表达苯酚羟化酶
35.1、转化大肠杆菌感受态细胞bl21
36.取实施例1中验证成功的重组表达载体采用实施例1中的化学转化方法转入 大肠杆菌bl21感受态细胞，得到重组表达菌株。
37.2、苯酚羟化酶基因的高效表达及sds-page电泳分析
38.对转化获得的重组表达菌株进行氨苄青霉素筛选，挑取阳性克隆至5ml含 有50ug/ml氨苄青霉素的lb培养基的pa瓶中，37℃、220rpm震荡过夜培养， 次日以2％接种量接种于100ml含有50ug/ml氨苄青霉素的lb培养基中，37℃ 培养至菌液浓度od
600
＝0.7-1.0时，添加1mmol/l的iptg诱导，以未导入质粒 的空白表达菌株以及导入空质粒的表达菌株做对照，20℃诱导表达20h。取出菌 液，分别装入离心管中，2000r/min离心10分钟，收集上清细胞培养液和菌体， 菌体加入蒸馏水重悬，并用超声波细胞破碎仪进行破碎，再进行12000r/min离 心10分钟，取重组菌、未导入质粒的空白表达菌株及导入空质粒的表达菌株的 上清细胞破碎液和细胞培养液各10ul分别与10ul上样缓冲液混合，沸水浴 10min，进行sds-page(6％分离胶、5％浓缩胶)电泳检测蛋白表达情况(附 图3)。
39.如附图3的sds-page电泳图所示，泳道1为蛋白maker条带，泳道2、3 为未导入质粒的空白表达菌株，泳道4、5为导入空质粒的表达菌株，泳道6、7 为导入目的质粒的表达菌株，其中泳道6和7的条带在蛋白分子量大小93kda 附近，且表达量很高，而对照组泳道2、3、4、5在相应位置均未出现条带，说 明泳道6、7的条带为目的基因表达条带，且与计算出的蛋白分子量一致。说明 本实施例获得了苯基羟化酶基因的高效表达。
40.实施例3苯酚羟化酶酶活性测定
41.对实施例2中iptg诱导重组表达菌株表达得到的苯酚羟化酶粗酶进行活性 检测，具体采用kredich的方法测定苯酚羟化酶的酶活性。反应体系：0.15mmol/lnadh、1mmol/l fad、1mmol/l苯酚、1mmol/l edta、50mmol/l磷酸钾 缓冲液(ph 7.5)，总体积2ml，最后加入100μl苯酚羟化酶粗蛋白在温度30℃ 的条件下起始反应。在340nm处测定吸光值变化，如附图4所示，添加粗酶后， 在前3min反应较快，od衰减值达到了0.103，之后衰减值变化不大。空白组几 乎无衰减，证明粗酶具有活力，根据光度法酶活测定公式和酶活定义计算可得， 酶活为105.8u/ml，比活度为12.3u/mg，说明该苯酚羟化酶粗酶具有较高的酶 活。
42.光度法酶活测定计算公式：
43.δa：溶液吸光度变化量，无单位。
44.ε：发光物质的摩尔吸光系数，单位l(mol
·
cm)。
45.b：光程，即光线穿过溶液的距离，通常为bisebei透光面宽度，单位cm。
46.t：反应时间，单位min。
[0047]v反
：反应体积，单位ml。
[0048]
综上，本发明从美棒状杆菌中克隆得到苯酚羟化酶基因，构建重组表达载 体后转入大肠杆菌，获得重组表达菌株，在iptg的诱导下表达得到苯酚羟化酶； 通过实施例3中对苯酚羟化酶粗酶的酶活性测定，其酶活为105.8u/ml，比活度 达到了12.3u/mg，具有非常高的酶活，可用于高效降解含酚废水，在工业废水 处理中具有非常广泛的应用前景。
[0049]
本发明的说明书和附图被认为是说明性的而非限制性的，在本发明基础上， 本领域技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中一 些技术特征做出一些替换和变形，均在本发明的保护范围内。