肝癌标志物SOAT1单克隆抗体制备及其应用

肝癌标志物soat1单克隆抗体制备及其应用
技术领域
1.本发明属于免疫学领域，具体涉及一种肝癌标志物soat1单克隆抗体与应用。


背景技术：

[0002] 肝癌（liver cancer）是全球较为常见的恶性肿瘤，其病死率在所有癌症中位居第二(1)。肝癌主要分为原发性肝癌和转移性肝癌。原发性肝癌的病灶来源于肝脏本身，包括肝细胞癌和胆管细胞癌等，其中肝细胞癌占原发性肝癌的95%(2)；转移性肝癌则由其他组织来源的恶性肿瘤转移形成，如胃癌、大肠癌等。肝癌起病隐匿，初期症状并不明显，晚期才会出现腹胀、恶心、消瘦、梗阻性黄疸、不明原因的发热等临床症状(3)。肝癌的危险因素众多，主要有肝炎病毒（乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒）感染、接触黄曲霉毒素、酗酒、肥胖和糖尿病等(4)。目前临床上诊断肝癌以病理学、影像学、血清生化检查及多种分子技术相关的检测手段(5)为主，仍缺乏有效诊断早期肝癌的方法。因此，寻找更为准确和早期的标志物及诊断方法是亟需解决的问题。
[0003]
肝癌作为最常见恶性肿瘤之一，其高死亡率及高侵袭性给患者及家庭带来巨大医疗经济负担。因此，针对肝癌的早期筛查及早期诊断对改善预后、延长患者生存期具有重大意义。甲胎蛋白（afp）是临床广泛使用的肝癌血清标志物，但其灵敏度和特异性较低，仅有三分之一的肝癌患者afp水平高于100ng/ml；而在无恶性肿瘤情况下，慢性肝病患者血清afp也有所升高(9)。近年来脱-γ-羧基凝血酶原（dcp）也开始用于早期肝癌的诊断，但样本量少，检测质量各异，需更多高质量研究进一步证明dcp在肝癌诊断中的可行性(10)。所以，开发一种新的具有高特异性及灵敏度的肝癌诊断标志物是当务之急。
[0004]
近年来，脂质代谢的改变与癌症发生发展之间的关系受到众多学者的关注。有研究指出，脂肪细胞可通过增加 cpt1a 和电子转运链复合蛋白水平来驱动脂肪酸代谢，促进乳腺癌细胞的增殖及迁移，从而加速癌症的进展(11)。此外，wang等(12)人发现三个脂质代谢相关基因在肝细胞肝癌中高表达；并与癌症预后紧密联系，可作为肝细胞肝癌独立预后因素。胆固醇作为脂质代谢中的重要一员，参与了癌症发生发展的过程。有研究指出，添加胆固醇可逆转熊果酸抑制肝细胞肝癌生长的作用(13)。而另一项关于p53抑制肝细胞肝癌生长的机制研究证明了，p53通过抑制甲羟戊酸途径，减少胞内胆固醇含量，发挥抑制肝癌细胞增殖的作用(14)。
[0005]
固醇o-酰基转移酶（sterol o-acyltransferase，soat），又称脂酰辅酶a-胆固醇酰基转移酶（acyl coenzyme a-cholesterol acyltransferasel，acat），是一种定位于内质网膜，能催化胆固醇转化成胆固醇酯，并将其储存在胞质脂肪滴中的蛋白质(6)。人体中共存在两个soat基因，分别为acat1和acat2。由acat1翻译而成的soat1主要表达于肾上腺、肾脏、卵巢和肝脏等；而由acat2翻译形成的soat2多表达于肠细胞中(7)。2019年，jiang等发现在乙型肝炎病毒相关性早期肝细胞肝癌中，soat1水平显著上调，且其高表达与肝癌预后不良密切相关(8)。因此，soat1有望成为诊断肝癌及判断预后的新标志物。soat1是一种调控细胞内胆固醇酯储存的关键酶，其高表达在神经胶质瘤、肾细胞癌、肾上腺皮质癌、乳
腺癌等多种癌症中已被证明与不良预后相关(15-18)。ren等人分析tcga数据库发现，soat1在肝细胞肝癌及胆管癌中上调最为明显，且soat1的高表达与肝细胞肝癌患者的不良预后相关(19)。与此同时，chen等人通过免疫组化比较肝癌及癌旁组织中soat1的表达情况发现，soat1在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织(20)。由此推测，soat1单独或与其他血清学标志物联合检测或提高早期肝癌检出率。运用原核表达系统进行蛋白表达具有蛋白不溶、构象不稳及低纯化率等缺点，而融合标签的使用，可增强目的蛋白的表达、提高蛋白溶解度(21)。
[0006] 参考文献1. 陈瑶, 杨训俊, 陈涵斌, 陈国荣. soat1在肝细胞癌组织中的表达及其临床意义[j]. 温州医科大学学报. 2021;51(01):35-9.2. kulik l, el-serag hb. epidemiology and management of hepatocellular carcinoma. gastroenterology. 2019;156(2):477-91 e1.3. dimitroulis d, damaskos c, valsami s, davakis s, garmpis n, spartalis e, et al. from diagnosis to treatment of hepatocellular carcinoma: an epidemic problem for both developed and developing world. world j gastroenterol. 2017;23(29):5282-94.4. cabrera r, nelson dr. review article: the management of hepatocellular carcinoma. aliment pharmacol ther. 2010;31(4):461-76.5. ronot m, purcell y, vilgrain v. hepatocellular carcinoma: current imaging modalities for diagnosis and prognosis. dig dis sci. 2019;64(4):934-50.6. long t, sun y, hassan a, qi x, li x. structure of nevanimibe-bound tetrameric human acat1. nature. 2020;581(7808):339-43.7. sakashita n, miyazaki a, takeya m, horiuchi s, chang ccy, chang t-y, et al. localization of human acyl-coenzyme a:cholesterol acyltransferase-1 (acat-1) in macrophages and in various tissues [j] the american journal of pathology. 2000;156(1).8. jiang y, sun a, zhao y, ying w, sun h, yang x, et al. proteomics identifies new therapeutic targets of early-stage hepatocellular carcinoma. nature. 2019;567(7747):257-61.9. grandhi ms, kim ak, ronnekleiv-kelly sm, kamel ir, ghasebeh ma, pawlik tm. hepatocellular carcinoma: from diagnosis to treatment. surg oncol. 2016;25(2):74-85.10. 德吉, 杨丽, 王一平. 脱-γ-羧基凝血酶原诊断原发性肝癌的系统评价[j]. 中国循证医学杂志. 2020;20(07):798-808.11. balaban s, shearer rf, lee ls, van geldermalsen m, schreuder m, shtein hc, et al. adipocyte lipolysis links obesity to breast cancer growth: adipocyte-derived fatty acids drive breast cancer cell proliferation and migration. cancer metab. 2017;5:1.
12. wang w, zhang c, yu q, zheng x, yin c, yan x, et al. development of a novel lipid metabolism-based risk score model in hepatocellular carcinoma patients. bmc gastroenterol. 2021;21(1):68.13. kim gh, kan sy, kang h, lee s, ko hm, kim jh, et al. ursolic acid suppresses cholesterol biosynthesis and exerts anti-cancer effects in hepatocellular carcinoma cells. int j mol sci. 2019;20(19).14. moon sh, huang ch, houlihan sl, regunath k, freed-pastor wa, morris jpt, et al. p53 represses the mevalonate pathway to mediate tumor suppression. cell. 2019;176(3):564-80 e19.15. bemlih s, poirier md, el andaloussi a. acyl-coenzyme a: cholesterol acyltransferase inhibitor avasimibe affect survival and proliferation of glioma tumor cell lines. cancer biol ther. 2010;9(12):1025-32.16. antalis cj, arnold t, rasool t, lee b, buhman kk, siddiqui ra. high acat1 expression in estrogen receptor negative basal-like breast cancer cells is associated with ldl-induced proliferation. breast cancer res treat. 2010;122(3):661-70.17. chen l, peng t, luo y, zhou f, wang g, qian k, et al. acat1 and metabolism-related pathways are essential for the progression of clear cell renal cell carcinoma (ccrcc), as determined by co-expression network analysis. front oncol. 2019;9:957.18. lacombe amf, soares ic, mariani bmp, nishi my, bezerra-neto je, charchar hds, et al. sterol o-acyl transferase 1 as a prognostic marker of adrenocortical carcinoma. cancers (basel). 2020;12(1).19. ren m, xu h, xia h, tang q, bi f. simultaneously targeting soat1 and cpt1a ameliorates hepatocellular carcinoma by disrupting lipid homeostasis. cell death discov. 2021;7(1):125.20. chen y, yang x, chen y, chen g, winkler ca, an p, et al. impacts of the soat1 genetic variants and protein expression on hbv-related hepatocellular carcinoma. bmc cancer. 2021;21(1):615.21. walls d, loughran st. tagging recombinant proteins to enhance solubility and aid purification. methods mol biol. 2011;681:151-75。


技术实现要素：

[0007]
本发明采用两端带有polyhis标签的pet-32a表达载体，该标签是目前使用最广的亲和标签，不会对蛋白质的表达和折叠产生影响，且带 his 标签的重组蛋白与ni(ii）-亚硝基三乙酸（ni2 nta）具有高亲和力，允许通过梯度浓度咪唑使结合的重组蛋白解离而达到纯化的效果。所获得的重组蛋白以包涵体的形式存在于胞质，难以溶解；因此，本发明使用梯度变性剂尿素溶解包涵体，之后通过透析的方法去除变性剂，使目的蛋白恢复天然构
象，最终得到可用于小鼠免疫的重组蛋白。在进行4次免疫后，小鼠血清效价达1：3200000，这说明重组sota1具有良好免疫原性。经细胞融合、亚克隆试验，最终筛得5株抗soat1单克隆抗体，分别命名为1f3、1g3、1d6、2f8、4d11。根据间接elisa结果可知，五株抗体均具有较高的效价亲和力。4d11能够在western-blot、免疫组化等试验中检测到soat1蛋白，这说明最终获得了一株能够特异识别肝癌细胞表达的soat1蛋白的单克隆抗体，最终完成本发明。
[0008]
本发明首先提供一种抗soat1特异性单克隆抗体，其重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别为cdr1：sfams；cdr2：asissggamyypdsvqg；cdr3：wtyygssygamds；和所述单克隆抗体的轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别为cdr1：kssqsllssgnqknylt；cdr2：wastres；cdr3：qndytyplt。
[0009]
优选地，所述单克隆抗体的重链氨基酸序列为mnfgfsliflvlvlkgvqcevklvesgggfvkpggslklscaasgftfrsfamswvrqtpekrlewvasissggamyypdsvqgrftisrdsagnilylemsslrsedtamyycarwtyygssygamdswgqgtsvtvss；所述单克隆抗体的轻链氨基酸序列分别mesqtqvlmsllfwvsgtcgdivmtqspssltvtagekvtmsckssqsllssgnqknyltwyqqrpgqppklliywastresgvpdrftgsgsgtdftltissvqaedlavyycqndytypltfgagtklelk。
[0010]
本发明进而提供编码所述的单克隆抗体的核苷酸分子。
[0011]
本发明也提供表达载体，其包含所述的核苷酸分子。
[0012]
本发明还提供soat1单克隆抗体细胞株，其能分泌所述的抗soat1特异性单克隆抗体。
[0013]
进一步地，本发明提供所述的单克隆抗体在制备检测或诊断肝癌的试剂中的用途。还提供所述的单克隆抗体的检测或诊断肝癌的试剂盒。
[0014]
目前市面上用于检测人soat1抗原的单克隆抗体较少，而本发明中所获得的抗soat1单克隆抗体同时具备识别人肝癌细胞和肝癌组织中天然soat1蛋白的能力，且wb及ihc的抗体稀释比均在合适范围内；本发明的soat1单克隆抗体效价可达1：204800，与soat1抗原具有较强结合能力，具有较大的应用价值。
附图说明
[0015]
图1 目的基因的获取及重组载体的构建。其中，a：肝癌细胞huh-7总rna电泳图；b；阳性克隆菌落pcr电泳图；c：重组质粒双酶切产物电泳图（lane m：dna 分子质量标准；lane 1：酶切前；lane 2：酶切后）。
[0016]
图2 重组蛋白的表达及鉴定。其中，a：sds-page；b：western-blot（lane m：预染蛋白质相对分子质量标准；lane 1：诱导前；lane 2：诱导后；lane 3：超声后悬液；lane 4：超声上清；lane 5：超声沉淀）。
[0017]
图3 soat1蛋白的纯化。其中，a：不同浓度尿素中重组蛋白的溶解情况（lane m：预染蛋白质相对分子质量标准；lane 1-5：尿素浓度：8m、6m、4m、2m、1m；lane a-c：分别代表蛋白悬液、悬液离心后沉淀和悬液离心后上清）；b：重组蛋白纯度鉴定（lane m：预染蛋白质相对分子质量标准；lane 1-8：咪唑洗脱液浓度：20mm、30mm、50mm、70mm、90mm、100mm、200mm、300mm；lane 9：挂柱流穿液）。
[0018]
图4 免疫小鼠血清抗体效价检测。
[0019]
图5 单克隆抗体的纯化结果（lane m：预染蛋白质相对分子质量标准；lane 1：未
煮沸纯化前腹水；lane 2：煮沸纯化前腹水；lane 3：未煮沸的辛酸硫酸铵沉淀纯化后腹水；lane 4：煮沸后的辛酸硫酸铵沉淀纯化后腹水；lane 5：未煮沸的精纯后单克隆抗体；lane 6：煮沸的纯化后单克隆抗体）。
[0020]
图6 单克隆抗体亚型鉴定。
[0021]
图7 单克隆抗体效价。
[0022]
图8 western-blot检测huh-7细胞表达的soat1。
[0023]
图9 免疫组化检测肝癌组织中表达的soat1。其中，a：人正常心肌组织；b：人正常肝脏组织；c：高分化肝细胞癌（400
×
）。
具体实施方式
[0024]
本发明从肝癌细胞huh-7中获得soat1基因，构建soat1原核表达载体，以纯化后soat1蛋白作为免疫原免疫小鼠，通过细胞融合等技术制备了抗soat1单克隆抗体，这不仅为筛选抗soat1抗体提供原材料，还为进一步建立基于soat1的早期肝癌检测方法奠定基础。
[0025]
一、实验材料和方法1、材料大肠杆菌rosettagamib、质粒pet-32a、huh-7肝癌细胞和小鼠骨髓瘤细胞sp2/6均由本实验室提供；dmem培养基购自美国gibco公司；胎牛血清购自上海贝博生物科技有限公司；soat1上下游引物委托长沙擎科生物技术有限公司合成；构建载体相关的extaq酶、限制性核酸内切酶ecor i和xho i、dna标准品购自日本takara公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技公司；蛋白质标准品构自美国bio-rad公司；质粒小量抽提试剂盒、protein g柱及鼠来源抗6
×
his-tag单克隆抗体购自上海生工生物工程有限公司；雄性balb/c小鼠（6~8w）购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司；弗氏佐剂、ht及hat均购自sigma公司；gam-igg-hrp由厦门大学夏宁邵教授惠赠；山羊抗小鼠igg抗体购自长沙艾碧维生物科技有限公司；高敏ecl发光液购自莫纳（武汉）生物有限公司；人正常心肌、人肝癌组织石蜡切片均由湘雅二医院病理科惠赠；dab显色试剂盒购自武汉赛维尔科技有限公司；其余试剂均为国产或进口分析纯。
[0026]
2、实验方法1）目的基因的获取采用trizol法提取肝癌细胞huh-7总rna，逆转录获得sota1 cdna。根据genbank中soat1的cds序列，设计下列引物：f：5
´‑
cggaattcatgaaggaagtt
‑‑
ggcagtc-3
´
；r：5
´‑
ccgctcgagctaaaacacgtaacgacaag-3
´
,并分别加入ecor i和xho i的酶切位点，利用上述引物对soat1基因进行pcr扩增。反应条件：
①
94℃预变性2min；
②
94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；
③
72℃终延伸10min。pcr产物经1%琼脂糖凝胶电泳，目的条带进行胶回收并测定其浓度。
[0027]
2）重组载体构建将胶回收后的pcr产物和载体pet-32a分别进行ecor i/xho i双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，目的条带切胶回收。将纯化后的pcr产物及载体pet-32a进行连接，转化至大肠杆菌rosettagamib，挑取阳性克隆，pcr、酶切鉴定后送至公司测序。
[0028]
3）soat1重组蛋白诱导表达及鉴定挑取阳性菌落转接至3ml含氨苄青霉素的lb液体培养基，37℃，230rpm摇床培养过夜。隔日将已活化菌种以1：100的比例接种，37℃，230rpm继续培养。当od
600nm
达0.6时，添加0.1%iptg诱导8-9h，12000rpm，离心10min，收集菌体，超声破碎法破碎细菌，分别收集诱导前后菌液、超声混合物、离心后上清及沉淀，sds-page电泳分析目的蛋白表达情况。与此同时，以鼠来源抗6
×
his-tag单抗为一抗，羊抗鼠抗体为二抗，采用western-blot法鉴定目的蛋白。
[0029]
4）soat1重组蛋白纯化soat1蛋白在菌体中主要以包涵体形式存在。将soat1包涵体充分洗涤后，配置20倍体积于蛋白质的含有6m、5m、4m、3m、2m urea的pbs，将蛋白质混合物转移至透析袋中，分别按浓度从高到底透析，每3h更换一次。复性后，离心收集上清，采用镍柱亲和层析的方式纯化蛋白。sds-page电泳分析纯化后蛋白纯度并检测浓度。
[0030]
5）小鼠免疫及血清抗体效价检测采用纯化后的抗体对6-8w雄性balb/c小鼠进行免疫，共五轮。前四轮均使用皮下多点注射，每两周注射一次；在第四轮免疫结束后10天，以腹腔注射的方式进行第五轮免疫。每次免疫前取眼眶血，包被soat1蛋白，通过间接elisa测定小鼠血清抗体效价。
[0031]
6）细胞融合取已完成五轮免疫小鼠脾脏，充分研磨，收集脾细胞。在进行细胞计数后，将脾细胞和处于对数生长期的sp2/6细胞以5：1到10：1的比例混合，1300rpm，离心5min，弃上清。将离心管置于37℃温水中，1min内缓慢滴加peg溶液。混匀，静置1min.。3min内加入5ml预热dmem培养基，定容、离心。用含滋养层细胞的hat培养基重悬细胞，根据脾细胞数量进行铺板。培养10d后，更换成ht培养基。
[0032]
7）杂交瘤细胞筛选和克隆化培养当融合细胞出现较大细胞团时，包被soat1蛋白，采用间接elisa法筛选阳性克隆。将筛选出来的阳性孔扩大培养，待细胞长至60%，通过有限稀释法进行亚克隆。
[0033]
8）单克隆抗体大量制备及纯化取9w雄性balb/c小鼠，腹腔注射石蜡油450-600μl/只。10d-15d后，收集对数生长期杂交瘤细胞并调整其浓度至2
×
106个/ml，以同样的方式注射小鼠，剂量为500μl/只。7d后收集腹水，并通过辛酸硫酸铵沉淀和protein g柱亲和层析进行纯化。
[0034]
9）抗soat1单克隆抗体的性质分析a.抗体亚型鉴定收集阳性杂交瘤细胞株细胞上清，以抗igg1、igg2a、igg2b、igg3、igm、iggam抗体作为二抗，其中抗iggam为阳性对照，通过间接elisa鉴定各株抗体亚型。
[0035]
b.抗体效价测定采用间接elisa检测抗体效价，将纯化后各株抗体稀释至同一浓度（0.5mg/ml），随后梯度稀释至1：409600，分析od值对抗体效价进行评价。
[0036]
c.western-blot实验培养肝癌细胞huh-7，提取总蛋白，sds-page电泳，转膜，封闭，tbst洗涤。将获得的5株单抗1：500稀释后作为一抗，4℃孵育过夜；次日tbst洗涤后，加入hrp标记的山羊抗小鼠
抗体作为二抗孵育，tbst洗涤，ecl显色观察抗体结合效果。
[0037]
d.免疫组化鉴定组织切片经烤片、脱蜡、水化、柠檬酸钠抗原修复、3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶后，加入1：200稀释的纯化soat1抗体，4℃孵育过夜；次日pbst洗涤，加入二抗，室温孵育1h，pbst洗涤，dab显色，蒸馏水终止显色，苏木素复染细胞核，饱和碳酸锂返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，显微镜下观察抗体结合情况。
[0038]
e.抗体可变区分析提取4d11杂交瘤细胞rna，送至金斯瑞生物科技股份有限公司测序。
[0039]
二、实验结果1、目的基因的获取及重组载体的构建提取肝癌细胞huh-7总rna，电泳后发现，rna在琼脂糖凝胶上呈现明显的三条带，分别是28s、18s和5s（图1中a）。条带明亮清晰可用于后续逆转录实验。将soat1 rna逆转录成cdna为模板进行pcr，经琼脂糖凝胶电泳，发现在1500bp附近有明显条带，提示sota1基因可能扩增成功。酶切连接后将重组载体转化至大肠杆菌感受态细胞中，涂板，待长出菌落，随机挑取进行菌落pcr，筛选阳性菌落。电泳后发现，菌落均在1500bp位置出现特异性条带（图1中b），初步确定重组载体转化成功。为进一步鉴定，提取菌落pcr阳性细菌的质粒，进行ecor i/xho i双酶切并电泳，结果显示，重组载体被切割成两部分，目的片段大小与预期相符（图1中c）,表明重组载体构建成功。将质粒送去测序发现，重组载体序列基本正确，未明显发生突变，可用于后续实验。
[0040]
2、soat1重组蛋白的表达及鉴定将测序基本正确的重组载体诱导表达，超声破碎后，进行sds-page电泳。结果显示，诱导后组和超声沉淀组均在50kd处出现明显蛋白条带（图2中a），这初步说明重组蛋白表达成功且主要以包涵体形成存在于菌体中。为进一步确定该条带是我们所需的目的蛋白，采用抗6
×
his-tag作为一抗进行western-blot验证。wb结果表明，抗his抗体能够识别所表达蛋白且位置符合预期（图2中b）。综上得出，经iptg诱导后，菌株成功表达带his标签的soat1重组蛋白。
[0041]
3、soat1重组蛋白纯化通过梯度浓度尿素对蛋白包涵体进行缓慢复性，sds-page凝胶电泳表明，在8m、6m、4m尿素溶解条件下，50kd处可见明显条带（图3中a），这说明包涵体最低可被4m尿素溶解。在后续镍柱亲和层析中，soat1重组蛋白可在20mmol/l、30mmol/l和50mmol/l咪唑中洗脱下来（图3中b），且纯度较高，可用于下一步小鼠免疫。
[0042]
4、免疫小鼠血清抗体效价检测小鼠进行免疫后，用重组soat1蛋白检测血清抗体效价。免疫前检测值作为阴性对照，以2.1倍阴性值作为检测结果的阳性临界值。结果显示，经四轮免疫后，小鼠血清抗体滴度明显升高，效价可达1：3200000（图4）。
[0043]
5、单克隆抗体的纯化与鉴定结果显示，纯化后抗体泳道中出现3条带，分别是：24kda的轻链、55/70kda的重链和100kda的重链聚合体；此外，未纯化腹水泳道有杂蛋白条带出现，纯化后抗体（包括初纯和精纯）泳道杂蛋白明显减少，且精纯抗体泳道目的蛋白更为明显（图5）。这说明纯化后单
克隆抗体的纯度和浓度显著提高，基本达到后续实验要求。经过纯化后，最终共获得5株抗soat1单克隆抗体，分别命名为1f3、1g3、1d6、2f8、4d11。采用bca法测定并计算得到单克隆抗体浓度，结果如下：1f3：0.55mg/ml；1g3：0.55mg/ml；1d6：0.57mg/ml；2f8：0.56mg/ml；4d11：0.75mg/ml。
[0044]
6、单克隆抗体亚型鉴定利用间接elisa法，对筛选得到的杂交瘤细胞稳定分泌的抗体进行亚型鉴定，结果显示：1f3是igg2a型，其余四株单抗均是igg1型（图6）。
[0045]
7、单克隆抗体效价测定由图7可知，1f3、2f8、4d11效价均达到1：204800；1d6和1g3效价达到1：102400。
[0046]
8、western-blotwestern-blot的结果显示，在1：500的稀释比下，1d6和4d11可以识别huh-7细胞中的soat1蛋白。
[0047]
9、免疫组化选取4d11用于免疫组化鉴定。结果显示，肝癌切片上出现棕色阳性灶（红圈标注），说明4d11可以识别肝癌组织切片中的soat1蛋白（图9）。
[0048]
10、抗体可变区分析测序结果如下：重链氨基酸全长序列（140 aa）：mnfgfsliflvlvlkgvqcevklvesgggfvkpggslklscaasgftfrsfamswvrqtpekrlewvasissggamyypdsvqgrftisrdsagnilylemsslrsedtamyycarwtyygssygamdswgqgtsvtvss。
[0049]
重连可变区序列：cdr1：sfams；cdr2：asissggamyypdsvqg；cdr3：wtyygssygamds。
[0050]
轻链氨基酸全长序列（133 aa）：mesqtqvlmsllfwvsgtcgdivmtqspssltvtagekvtmsckssqsllssgnqknyltwyqqrpgqppklliywastresgvpdrftgsgsgtdftltissvqaedlavyycqndytypltfgagtklelk。
[0051]
轻链可变区序列：cdr1：kssqsllssgnqknylt；cdr2：wastres；cdr3：qndytyplt。