OsPIL16基因或其蛋白在调控水稻茎粗中的应用

ospil16基因或其蛋白在调控水稻茎粗中的应用
技术领域
1.本发明属于农业生物技术领域，具体涉及ospil16基因或其蛋白在调控水稻茎粗中的用途。


背景技术：

2.近年来，随着人口的不断增长、环境的不断恶化以及耕地面积的不断减少，水稻生产力和种植面积下降，导致水稻产量正面临着严峻的危机。提高产量已成为水稻生产的重要任务，然而伴随高产的是倒伏问题。水稻倒伏后，植株冠层结构遭到破坏，光合能力减弱，结实率、千粒重也随之降低。与此同时，还严重影响了水稻的外观、蒸煮食味和营养品质。水稻自身的抗倒伏能力是由茎秆的性状形态决定的，其中茎粗对抗倒伏影响较大。因此，有关提高水稻自身茎粗的遗传机制一直是水稻遗传育种学家研究的热点。
3.水稻茎粗是影响抗倒伏和水稻产量的一个重要影响因子，是典型的数量性状，由多个基因控制，国内外有许多学者对该性状进行了研究。经过多年研究，目前在水稻茎粗的分子遗传机理方面已取得一定成就，但供育种可用的基因还较少，且通过基因工程技术提高水稻茎粗的报道仍相当有限，因此利用基因工程技术选择可供育种的基因是研究的重点。
4.ospil16基因是水稻中光敏色素相互作用因子(pif)家族的一员，由nakamura等人(2007)通过同源性分析在水稻基因组中鉴定获得。目前已知该基因参与到水稻的株高、穗长、分蘖数调控和环境耐受性等方面，未见其与水稻茎粗相关的报道。


技术实现要素：

5.本发明提供ospil16基因或其蛋白在调控水稻茎粗中的应用，为茎粗的遗传改良及培育水稻抗倒伏性和高产提供了良好的理论基础，也为进一步充分挖掘水稻生产潜力、提高水稻产量提供了科学依据。
6.本发明提供的技术方案如下：
7.如seq id no:1所示的氨基酸序列组成的ospil16蛋白或seq id no:2所示的编码所述蛋白的基因或含有所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物在调控水稻茎粗中的应用。
8.进一步的，所述调控水稻茎粗为提高水稻茎粗。
9.本发明还提供一种提高水稻茎粗的方法，抑制水稻ospil16基因的表达，和/或减少ospil16基因编码蛋白的活性。
10.本发明还提供一种培育粗茎水稻的方法，选出ospil16基因表达量降低或无表达，ospil16蛋白表达量降低或无表达，和/或ospil16基因蛋白活性降低或无活性的水稻植株，获得粗茎水稻。
11.进一步的，水稻育种时，至少一个亲本为权利要求4所述的粗茎水稻。
12.进一步的，将水稻中的ospil16基因敲除。
13.本发明还提供一种培育高产水稻的方法，选出ospil16基因表达量降低或无表达，ospil16蛋白表达量降低或无表达，和/或ospil16基因蛋白活性降低或无活性的水稻植株，获得粗茎水稻。
14.进一步的，将水稻中的ospil16基因敲除。
15.本发明还提供一种培育抗倒伏水稻的方法，选出ospil16基因表达量降低或无表达，ospil16蛋白表达量降低或无表达，和/或ospil16基因蛋白活性降低或无活性的水稻植株，获得粗茎水稻。
16.进一步的，将水稻中的ospil16基因敲除。
17.本发明的目的在于提供水稻ospil16基因的新用途。
18.本发明提供了水稻ospil16基因或其蛋白在调控水稻茎粗中的用途。
19.本发明还提供了一种提高水稻茎粗的方法，抑制水稻ospil16基因的表达，和/或减少ospil16基因编码蛋白的活性，即可。
20.本发明还提供了ospil16基因或其蛋白在筛选粗茎水稻中的用途。
21.本发明还提供了一种筛选粗茎水稻的方法，包括以下步骤：
22.选出ospil16基因表达量降低或无表达，ospil16蛋白表达量降低或无表达，和/或ospil16基因蛋白活性降低或无活性的水稻植株。
23.有益效果
24.水稻茎粗是一个影响水稻产量和抗倒伏性的关键因素，研究也发现，随着水稻茎秆变粗，穗粒数呈直线关系的上涨，产量上升。同时水稻茎秆变粗，抗倒伏能力也增强，促进水稻进行光合作用，促进水稻灌浆，也能进一步促进水稻产量的提升，因此筛选能使水稻茎秆变粗的基因，对水稻产量的提高具有重要意义。我们发现，水稻中ospil16基因被敲除后，茎粗显著提高，抗倒伏能力上升，产量也增加，为茎粗的遗传改良及培育水稻抗倒伏性和高产提供了良好的理论基础，也为进一步充分挖掘水稻生产潜力、提高水稻产量提供了科学依据，应用前景良好。
附图说明
25.图1为ospil16过表达株系oe22的电泳图：m：marker dl2000；1-10:t2代纯系鉴定pcr产物条带,11:阴性对照；12:阳性对照，质粒
26.图2为过表达株系oe9、oe22中ospil16表达量分析
27.图3为不同水稻株系的茎粗比较图；
28.图4为不同水稻株系的统计图。
具体实施方式
29.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
30.实施例1ospil16过表达株系的构建及鉴定
31.一、ospil16基因的过表达载体构建
32.前期已将ospil16基因全长(seq id no:2)从日本晴中克隆出来，ospil16编码一
个由506个氨基酸(seq id no:1)组成的蛋白。然后将含有bamhi kpni酶切位点的p1011载体双酶切，并在ospil16两端加上带有载体酶切位点两端序列的同源臂，利用dna回收试剂盒回收酶切后的载体和带有同源臂的ospil16，将ospil16与酶切后的载体同源重组，获得的载体命名为p1011-ospil16，并送去百格基因公司进行水稻转化，获得t0代转基因苗，并鉴定出阳性苗。
33.日本晴中的ospil16全长序列(seq id no:2，1518bp)
34.atgctacgcgggaacgacaccggcagcgacctggccgagctgctctgggacaacggcgccccggcgccgctcaggccgcctccgcctccgcccttccagcccttcacctgcagcgccgccgccaccacgtcgccgccggcgcacgactacctcttcatcaagaatctcatgcggggcggcggcgccgccaaccaccaccaccacgatgacgatgacgacgacgacgacgacgtgccgtggttgcattaccaccctgtcgtggacgacgacgacgacgccgacgctgacacggcgccgctgcctcccgactactgcgccgccttgctctccggcctctccgaccacctcccgccgcccgccgctgcggcgagcagggtggaccccgacccctgctcctcctcccacggcgccgtcgtcccgtccacgtccgccgccgccgccaagcaggctcgcacgagcggcggcggcggcggcggcgtcatgaacttcaccttcttctcgaggcctctgcagcagcgcccctccggcggcgagaccgcgtcggcgtcggcgtcggcggcggccacctcgaccgtccccgtcgagtcgacggtggtgcaggcggcgacgaaccggctgagaagcaccccgctcttctccgaccagaggatggcatggctgcacccgcccaagccgtcgccacgcgccgccgcaccgccgccgccgccgcctctggcccctaccactcggcaccgactcgacaccgccgccgcgacggcgacggtggcgcagaggttgccgccgtccgaggcaagagctcccgacgcgcccccgcctgccgcgaccgcgacggcgacgacctcgtccgtctgctccggcaacggcgaccggagacagctcaattggagggacagccacaacaaccagtccgccgagtggtcggccagtcaagacgagctggacctcgacgacgagctcgcaggcgtccaccggaggtcggcggcgaggagctccaagcgcagccgcaccgccgaagtccacaacctgtcagagcgggtaagcacacacaccatgcaccatccacaacacccgcgtcgtgtcatgacgtcatctcatctcgccattgaattgctttcgagctcgcagaggagaagagaccggatcaacgagaagatgcgggcgctgcaagagctcatcccaaactgcaacaagattgacaaggcgtcgatgctggaggaagccatcgagtacctcaagacgctgcagctgcaggtgcagatgatgtcgatggggacggggatgttcgtgccgccgatgatgctgccggcggcggcggcggcaatgcagcaccaccacatgcagatgcagcagatggccgggccaatggcggcggcggcgcatttcccccacctcggcgccgccgccgccatggggctcgccggcttcggcatgcccgccgccgcgcagttcccttgcccgatgttccccgccgcgccgccgatgtccatgttcgcgccgccgccgccgccgccgccgttccctcacgcggccgccaccgccgtcgagcagacgccgtctccgccgggagcagcagacgccggcaacgcccccgccgtgaagcaggcgtga。
35.ospil16氨基酸序列(seq id no:1)
36.mlrgndtgsdlaellwdngapaplrppppppfqpftcsaaattsppahdylfiknlmrgggaanhhhhdddddddddvpwlhyhpvvdddddadadtaplppdycaallsglsdhlpppaaaasrvdpdpcssshgavvpstsaaaakqartsggggggvmnftffsrplqqrpsggetasasasaaatstvpvestvvqaatnrlrstplfsdqrmawlhppkpspraaapppppplapttrhrldtaaatatvaqrlppseakapdapppaatatattssvcsgngdrrqlnwrdshnnqsaewsasqarldlddelagvhrrsaarsskrsrtaevhnlserrekrpdqredagaarahpklqqvdkasmleeaieylktlqlqvqmmsmgtgmfvppmmlpaaaaamqhhhmqmqqmagpmaaaahfphlgaaaamglagfgmpaaaqfpcpmfpaappmsmfapppppppfphaaataveqtpsppgaadagnapavkqa。
37.二、ospil16基因的过表达纯系鉴定
38.采用诺唯赞公司的植物基因组dna提取试剂盒提取ospil16转基因阳性植株的dna。取2μl转基因水稻dna作为模板，以检测引物。
39.f:5
’‑
:atgctcaccctgttgtttgg-3’(seq id no.3)，
40.r:5
’‑
cacgacagggtggtaatgc-3’(seq id no.4)进行pcr扩增，
41.扩增条件为：95℃预热5min；95℃,30s,62℃,30s,72℃,15s，共38个循环；72℃,10min。
42.扩增出长度为313bp的目的片段(见图2)，经测序证明该片段为重组载体p1011-ospil16的片段，证明重组载体已转化入水稻中，且根据纯系计算方法，10株以上单株为阳性即该株系为纯系，因此将其命名为oe22，oe9前期已鉴定出。
43.实施例2ospil16敲除株系构建及纯系鉴定
44.在百格公司进行ospil16的敲除载体的构建及水稻转化，并获得阳性苗，经鉴定获得ospil16敲除株系纯系，将其命名为ospil16-10，敲除位点如下：
45.wt：atgctacgcgggaacgacac
46.ospil16-10：atgctacgcgggaac..cac
47.实施例3ospil16过表达株系和敲除株系表达量测定
48.一、水稻总rna的提取以及cdna的合成
49.种植日本晴、oe9、oe22至三叶一心期，并按照takara公司rnaiso plus的产品使用说明书进行。将水稻样本在液氮中快速研磨成粉状，加入rnaiso plus，剧烈震荡之后于冰上放置一段时间，离心并吸取上清液，再加入氯仿抽提，将上清液与等量异丙醇混匀，以沉淀rna。离心去掉异丙醇之后用75％的酒精洗涤rna沉淀，待酒精挥发之后用depc水溶解rna。然后用抽提的总rna反转录cdna。cdna用takara公司的primescript
tm rt master mix(perfect real time)试剂合成。
50.二、荧光定量pcr分析基因表达
51.使用abi公司的7300荧光定量仪进行荧光定量分析基因表达。内参基因为qubi。内参基因及目的基因引物如下：
52.qubi-f 5'-tggtcagtaatcagccagtttgg-3'(seq id no.5)
53.qubi-r 5'-gcaccacaaatacttgacgaacag-3'(seq id no.6)
54.qospil16-f1 5'-ctccgcccttccagccct-3'(seq id no.7)
55.qospil16-r1 5'-cgccccgcatgagattcttg-3'(seq id no.8)
56.日本晴、oe9、oe22中ospil16表达量见图2。
57.实施例4ospil16调控水稻茎粗的效果验证
58.将已鉴定的ospil16敲除株系ospil16-10(16-10)和过表达株系oe9、oe22，分别种植于扬州市里下河农科所，待其成熟之后进行收获并统计茎粗。
59.其中，wt(野生型)统计30株，敲除株系16-10统计30株，过表达株系oe9和oe22各统计30株。
60.统计数据采用软件为prism5.0进行分析，分析方法为单因素方差分析(one-way anova)。
61.统计结果见表1。
62.表中标注：与wt相比，*为差异显著；**为差异极显著。
63.表1不同水稻株系的茎粗统计
64.株系茎粗(mm)
wt4.08
±
0.34oe93.23
±
0.23**oe223.19
±
0.18**16-104.74
±
0.22**
65.由表1可知，与野生型品种相比，ospil16过表达株系的茎粗显著变窄，而ospil16敲除株系的茎粗显著变宽，表明ospil16对调控水稻茎粗发挥重要作用。
66.综上，ospil16基因能够显著调控水稻茎粗，可用于茎粗的遗传改良及提高抗倒伏性和产量。