一种小米抗氧化活性肽的制备方法

1.本发明涉及多肽制备技术领域，特别涉及一种小米抗氧化活性肽的制备方法。


背景技术：

2.生物活性肽是一类天然存在于植物、动物、和微生物等生物体内，或动、植物蛋白经蛋白酶酶解，以及通过人工化学合成或用生物工程方法获得的，具有多种特殊生理活性的多肽类物质，是蛋白质中20种天然氨基酸以酰胺键组成的从二肽到复杂线性、环形结构的低分子肽或多肽类物质的总称。生物活性肽具有多种生理功能，其生物活性随着氨基酸的组成和排列顺序不同而发生改变。有研究表明，生物活性肽的抗增殖、抗微管蛋白和细胞毒性等生理功能，使得它们具有抗癌的潜能，这在癌症治疗中将有不可估量的作用。研究发现蛋白质经水解后得到的多肽，比原蛋白质具有更好的营养性；蛋白质经消化道的酶作用后并不一定完全以游离的氨基酸形式被吸收，而主要是以低肽(特别是二肽、三肽)的形式被吸收。通过生物代谢实验也证明了低肽的吸收率确实比游离氨基酸更好，且比氨基酸更易通过小肠黏膜而被机体吸收利用。低肽比游离氨基酸的渗透压低，食后不会引起腹泻等不良反应；同时，低肽又具较低抗原性，不会引起过敏反应。因此，可以利用低肽来为那些由日常饮食不能充分满足蛋白质需要的特殊人群补充蛋白。由此可见，低肽的食用安全性极高，是当前全球食品界最热门的研究课题和极具发展前景的功能因子。
3.小米是我国的传统农作物，其历史悠久，种植面积广泛，种植面积远高于其他杂粮。小米中富含多种营养物质，如蛋白质、矿物质、膳食纤维和抗氧化物等营养成分与其他传统谷物相比含量相当甚至更高。小米素有滋阴补肾、清热利尿、养胃之功效，深受我国人民的喜爱。但目前国内外对于小米的加工方式较为单一，对其功能性的研究更是匮乏，本研究旨在探索小米的生理功能，提升小米的营养价值，开拓小米食品的市场。
4.我国小米蛋白资源丰富，但由于技术等方面的限制，对小米蛋白高附加值的开发利用还远远不够，因此，深入研究开发制备小米蛋白肽的新技术以及克服小米蛋白肽制备过程中的主要影响因素，将对整个小米加工产业的发展具有重要的意义。新工艺和新技术的开发和应用，将大大提高国内外对于小米的深加工和综合利用水平。提升小米蛋白和小米肽的产业化技术水平，不仅会大大改善加工企业的经济效益和竞争力，同时而且也会带动企业对小米的收购，稳定和提高小米的价格。


技术实现要素：

5.为了弥补现有技术的不足，本发明旨在提供一种小米抗氧化多肽的制备方法。
6.为解决上述问题，本发明提供了如下技术方案：
7.1.一种小米抗氧化活性肽的制备方法，包含以下步骤：小米蛋白的提取纯化，小米蛋白的酶解和多肽分离；其特征在于，
8.小米蛋白的提取纯化方法包括以下步骤：
9.称取一定量小米，用组织捣碎机粉碎，过80目筛，按料液比1：3-5加入正己烷，混合
后在室温下充分搅拌2-4h，然后静置1-3h，重复2-3次后倾去上清液，将沉淀物在通风橱风干后得脱脂小米粉；在小米粉中按1：10-15加入蒸馏水，然后用1mol/l的naoh溶液调ph至8-10，再用超声处理30-50min，磁力搅拌1-2h，接着5000-8000r/min离心10-15min，取上清液以1mol/l的盐酸调ph至3-4，然后收集沉淀，透析除盐，最后冷冻干燥得到小米蛋白粉；
10.小米蛋白的酶解和多肽分离包括以下步骤：
11.首先将小米蛋白粉溶解为4-6％(w/v)的溶液，然后将ph值调为9-10，然后在沸水浴中加热15-30min，再降温至55-65℃，加入5000-8000u/g底物的alcalase 3.0t碱性蛋白酶，反应1-2h，然后再迅速升温至100℃灭酶10-15min，然后再降温至40-50℃，将ph值调为7.5-8.5，中性蛋白酶的添加量为2000-3000u/g底物，反应2-4h后迅速升温至100℃将酶灭活10-15min，5000-7000r/min，离心时间为15-25min离心后取上清液，再冷冻干燥得一种小米抗氧化活性肽。
12.优选的，每次冷冻干燥之前需要在-80-60℃下预冻18-24h，然后再冻干24-30h。
13.本发明一种小米抗氧化活性肽的制备方法制得的小米活肽肽段0.5-1kd。
14.按照本发明的两种酶的组合反应，就能产生0.5-1kd这个范围内的具有很好抗氧化性的小米蛋白降解多肽，其他组合条件就是不行。
15.本发明以小米为原料，首先采用碱溶酸沉法以及超声辅助提取其中的蛋白质，其次采用复合酶法水解小米蛋白，获取小米多肽，并在蛋白酶筛选、单因素影响测定实验基础上，以多肽得率为指标，设计四因素三水平正交试验对中性蛋白酶和alcalase 3.0t碱性蛋白酶酶解小米蛋白制取小米多肽工艺进行了优化，选取最优工艺参数，最后得到的小米活肽肽段0.5-1kd。
16.本发明的优点是：
17.(1)采用复合酶法多级水解小米蛋白，提高了小米蛋白的水解度和酶的利用率。
18.(2)本发明制得的小米多肽，制备方法操作简单，处理条件温和。
19.(3)根据水解蛋白酶的酶学特性，调节蛋白溶液的ph值，水解温度，水解时间，分阶段控制酶的水解环境水解。采用该种方法不仅提高了酶的水解活力，还减少了酶用量，缩短了酶解时间，节约能耗。
20.(4)经过双酶复合水解小米蛋白可得到具有高抗氧化活性的小米多肽，是新型天然抗氧化剂，本发明方法结合还原性的测定，小米多肽得率达到了28.5％。
21.本发明制备的小米多肽对abts自由基的清除率很高，在其浓度为1mg/ml时，清除率高达84％。
附图说明
22.图1为小米多肽制备流程
23.图2为本发明实施例1制备的小米多肽粉
24.图3为小米多肽及vc的还原能力
25.图4为小米多肽及vc对abts自由基的清除作用。
具体实施方式
26.下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本
发明。
27.实施例1
28.(1)小米蛋白的提取
29.步骤1：称取500g小米，用组织捣碎机粉碎，过80目筛；
30.步骤2：向经步骤1处理过的小米粉中按料液比1：3加入正己烷，混合后在室温下充分搅拌，每次至少搅拌2h，搅拌结束后静置1h，倾去上清液(黄色的，含正己烷、水和脂肪)，再加入新正己烷继续搅拌，重复多次后倾去上清液，将沉淀物在通风橱风干后得脱脂小米粉。
31.步骤3：向经步骤1处理后的小米粉中按料液比1：10加入蒸馏水，然后用1mol/l的naoh溶液将体系ph值调至10，再用超声处理30min，常温下用数显恒温磁力搅拌2h，接着5000r/min离心15min，取上清液以1mol/l的盐酸调ph至3(小米蛋白等电点)，然后收集沉淀，透析除盐，-60℃下预冻24h，然后再冻干30h。
32.(2)小米抗氧化活性肽的制备
33.取第一步所得的小米蛋白粉加入蒸馏水，制成浓度为4％(w/v)的小米蛋白溶液，充分搅拌后用1mol/lnaoh溶液调节ph值为10，再加热至100℃维持15min，使小米蛋白结构变得疏松便于酶解。
34.将温度降温至碱性蛋白酶适宜的反应温度65℃，加入5000u/g的alcalase3.0t碱性蛋白酶，反应2h后迅速将温度升高到100℃将酶灭活10min，然后降温至50℃，再调整ph到8.5，加入2000u/g的中性蛋白酶，反应2h后迅速升温至100℃将酶灭活10min，然后5000r/min离心25min后取上清液，-60℃下预冻24h，然后再冻干30h。测小米多肽肽段0.5-1kd。
35.实施例2
36.(1)小米蛋白的提取
37.步骤1：称取500g小米，用组织捣碎机粉碎，过80目筛；
38.步骤2：向经步骤1处理过的小米粉中按料液比1：4加入正己烷，混合后在室温下充分搅拌5h，搅拌结束后静置3h，倾去上清液，重复2次后倾去上清液，将沉淀物在通风橱风干后得脱脂小米粉。
39.步骤3：向经步骤1处理后的小米粉中按料液比1：15加入蒸馏水，然后用1mol/l的naoh溶液将体系ph值调至9，再用超声处理50min，常温下用恒温磁力搅拌1h，接着8000r/min离心10min，取上清液以1mol/l的盐酸调ph至4(小米蛋白等电点)，然后收集沉淀，透析除盐，-80℃下预冻18h，然后再冻干24h。
40.(2)小米抗氧化活性肽的制备
41.取第一步所得的小米蛋白粉加入蒸馏水，制成浓度为6％(w/v)的小米蛋白溶液，充分搅拌后用1mol/lnaoh溶液调节ph值为9，再加热至100℃维持30min，使小米蛋白结构变得疏松便于酶解。
42.将温度降温至碱性蛋白酶适宜的反应温度55℃，加入8000u/g的alcalase3.0t碱性蛋白酶，反应1h后迅速将温度升高到100℃将酶灭活15min，然后降温至40℃，再调整ph到7.5，加入3000u/g的中性蛋白酶，反应4h后迅速升温至100℃将酶灭活15min，然后7000r/min离心15min后取上清液，-80℃下预冻18h，然后再冻干24h。测小米多肽肽段0.5-1kd。
43.本发明首次制备高得率的0.5-1肽段的多肽，其他方法，这个范围的肽段得率没有
这么高，而且抗氧化活性也是这个范围的多肽效果最好，自由基清除率高。
44.功能评价
45.1.小米抗氧化活性肽还原力的测定
46.将实施例1制得的小米多肽和vc的浓度设为0.05，0.1，0.5，1.0，5.0，10.0，25.0，50.0mg/ml，分别取1ml不同浓度的小米肽溶液(空白用1ml蒸馏水代替)，加入2.5ml 1％的铁氰化钾溶液和2.5mlph6.6的磷酸缓冲液(0.2mol/l)，将混合液在50℃水浴中反应20min。然后，向混合液中加入2.5ml10％的三氯乙酸(tca)溶液，混合后以3000r/min离心10min。取2.5ml的上清液，加入2.5ml蒸馏水和0.5ml 0.1％的三氯化铁。将溶液混匀后静置10min，然后在700nm下测定吸光度。吸光度越高表明还原力越高。所有的测定重复三次。
47.从图3可以看出对照组vc具有较强的抗氧化作用。小米多肽在本实验所选的浓度范围内，在低浓度下，还原力较弱，随浓度的增加，还原力逐渐增大，这说明小米多肽的还原力与浓度有较好的量效关系。
48.2.小米抗氧化活性肽对abts自由基清除率的测定
49.取7mmol/l的abts溶液5ml和140mmol高硫酸钾88μl。在室温下避光静置过夜，形成abts自由基储备液，在使用前先用ph7.4的磷酸盐缓存冲液稀释至a
734
＝0.700
±
0.002，制成abts

·
工作液。然后取abts

·
工作液4ml，加入1ml小米肽溶液，充分混合后，在25℃下静置6min，在734nm处测定吸光度值a
样
，同时取4mlabts

·
工作液，再加入1ml的乙醇溶液于734nm处测定吸光度值a
对照
。则abts

·
清除率为：
[0050][0051]
小米抗氧化活性肽对abts自由基的能力如图4所示，可以清楚地看到小米多肽和vc均对abts自由基具有很好的清除作用，在实验所选浓度范围内随着浓度的升高，对abts自由基的清除率也越来越高，在浓度为1mg/ml时就达到了84％，故小米多肽具有较强的abts自由基的清除作用。
[0052]
上述实例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。