一种检测诊断系统性红斑狼疮相关疾病致病基因的DNA文库及其应用

一种检测诊断系统性红斑狼疮相关疾病致病基因的dna文库及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种通过高通量靶向测序技术检测诊断系统性红斑狼疮相关疾病致病基因的dna文库及其应用。


背景技术：

2.系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，sle)是一种自身免疫性疾病，起病隐匿，临床表现多样。是一种多系统、器官受累的自身免疫性疾病，其由于细胞和体液免疫功能障碍，产生多种自身抗体。可累及皮肤、浆膜、关节、肾及中枢神经系统等，并以自身免疫为特征，患者体内存在多种自身抗体。易感基因-环境等因素相互作用导致异常免疫反应(即自身免疫异常)，产生致病性自身抗体和免疫复合物并沉积于组织，激活补体，引起炎症，如果未得到及时干预，可导致多脏器功能受损严重，甚至危及生命。病情呈反复发作与缓解交替过程。
3.目前系统性红斑狼疮的病因尚不清楚。可能因素包括：1.遗传易感性，2.雌激素3.环境：紫外线，药物，精神压力，吸烟等4.感染：病毒感染。然而，临床上患者诊断系统性红斑狼疮后，严重干扰患者的生活质量。其诊断初期，第一年的死亡率为5％，是个重大的危害患者健康的疾病。近年来，研究已发现数个系统性红斑狼疮的致病基因，其中部分为常染色显性遗传的模式。此外，目前临床上的诊断，往往依赖于患者的临床表现的特异的自身免疫抗体。由于其临床表现的非特异性、多样性。因此，在临床上经常需要与多种其他自身免疫性疾病相鉴别，而这些自身免疫性疾病部分也有明确的遗传学致病基因。
4.目前，临床实验室检测基因突变大多采用传统的一代测序sanger测序法，而如果同时检测系统性红斑狼疮相关疾病的众多基因，不仅耗时费力，而且检测效率底线，更重要的是需要大量的基因样本，延长受检者疾病诊断的等待期。第二代基因测序(next generation sequencing，ngs)也称高通量测序，与传统的sanger测序技术相比具有高通量等优势。由于系统性红斑狼疮的发病率高、临床表现多样，因此结合遗传学进展、临床医学知识，筛选系统性红斑狼疮相关疾病的致病基因，可以高效、快捷的帮助临床诊断系统性红斑狼疮。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一在于提供一种能够提高诊断准确率、降低经济、时间成本的通过靶向高通量测序技术检测诊断系统性红斑狼疮相关疾病致病基因的dna文库。
6.本发明的目的之二在于提供所述dna文库的应用。
7.本发明的目的通过如下技术方案实现：
8.一种基于高通量测序技术诊断系统性红斑狼疮相关疾病的dna文库，该文库包括18个系统性红斑狼疮相关疾病的致病基因，其中，所述18个系统性红斑狼疮相关疾病的致病基因如下表所示：
[0009][0010]
本发明提供的dna文库覆盖包括系统性红斑狼疮、皮肤型红斑狼疮、临床上易与系统性红斑狼疮混淆的自身免疫性淋巴细胞增生综合征、白癜风伴系统免疫性疾病为主要临床表现的遗传病，包含18个系统性红斑狼疮相关基因。这18个基因选择基于高质量文献报道和公认的临床遗传基因数据库(如omim数据库、clinvar数据库、hgmd数据库)。这18个基因上的致病突变为增加疾病的易感性，也可以联合致病导致复杂表型，本发明首次做到可以全覆盖的对其进行测序。
[0011]
本发明根据18个系统性红斑狼疮相关疾病致病基因，设计能覆盖上述基因外显子及毗邻
±
20bp内含子区域的测序引物目标区域文库，文库利用高通量进行测序，寻找致病位点，明确系统性红斑狼疮的遗传学病因，为临床诊断和鉴别诊断系统性红斑狼疮提供诊断依据。
[0012]
一种上述dna文库在制备诊断试剂盒中的应用，所述试剂盒用于诊断系统性红斑狼疮的致病基因。
[0013]
所述应用包括下列步骤：
[0014]
收集临床上考虑诊断系统性红斑狼疮受检者的临床资料及临床生物样本，包括但不限于来自受检者的外周血、体液、组织器官样本如毛囊、含有口腔上皮细胞的唾液等；
[0015]
a)提取基因组dna；
[0016]
b)高通量测序平台自动合成覆盖列表1基因的扩增引物池，对目标区域进行超多重pcr扩增；
[0017]
c)对扩增产物进行酶切，并连接上barcode；
[0018]
d)将连接产物进行pcr扩增，并纯化；
[0019]
e)点入芯片，上高通量测序仪进行测序；
[0020]
f)得到的测序数据进行生物信息学处理，分析疾病相关的突变位点，得到的突变位点进行sanger测序法验证并家系中共分离验证。
[0021]
较之现有技术而言，本发明的优点在于：
[0022]
1.系统性红斑狼疮临床表现多样复杂、需要鉴别的疾病多样化。因此明确系统性红斑狼疮的诊断，对于指导临床诊疗非常重要。由于其临床表现多样，更存在遗传异质性和表型差异，对相关疾病的致病基因的测序和分析有助于对临床不典型临床表现病例做出准确的诊断。本发明旨在探索系统性红斑狼疮相关疾病的遗传学病因，不仅能帮助临床诊断，同时能指导诊疗。
[0023]
2.基因诊断有助于临床遗传咨询和产前诊断等。因系统性红斑狼疮相关疾病对个人健康的危害巨大，基因检测可为患者本人及其家属提供更多的遗传信息。考虑到其家族聚集性的特征，甚至可以帮助其患者家属提早发现并识别疾病。
[0024]
患者父母或本人可通过基因检测指导生育。系统性红斑狼疮相关疾病有常染色显性、常染色体隐性多种遗传模式，只有进行基因检测才能够提供准确的健康和生殖指导。发现基因携带者，也可以提前进行临床指导，如避免紫外线光照、染色等其他可导致系统性红斑狼疮的诱因。
[0025]
3.本技术的dna文库是基于查阅大量文献，并采用omim、clinvar等权威数据库提供的疾病-基因相关性筛选方法，从众多的系统性红斑狼疮相关疾病致病基因中选择的18个基因。所选基因兼顾了全面性、准确性和科学性。本发明优选18个系统性红斑狼疮相关疾病致病基因，建立针对51个系统性红斑狼疮致病基因的目标区域文库，文库利用高通量测序技术进行测序，寻找致病突变，为临床诊断提供遗传学和分子生物学依据。
[0026]
综合来看，本发明具有准确、快速、灵活、低成本的特点，本发明涉及的18个基因检测区域能够检测对系统性红斑狼疮的病因诊断和鉴别诊断有着重要的意义和临床价值。
附图说明
[0027]
图1是实施例1中对先证者样本的18个系统性红斑狼疮相关基因建立目标区域靶向dna文库的质控信息。
[0028]
图2是实施例1中对先证者样本的18个系统性红斑狼疮相关基因的目标区域进行测序的数据覆盖信息。
[0029]
图3是实施例1中对先证者样本的18个系统性红斑狼疮相关基因的目标区域进行测序的数据量信息。
具体实施方式
[0030]
本发明提供了一种检测诊断系统性红斑狼疮相关疾病致病基因的dna文库及其应用。
[0031]
基于高通量测序技术诊断系统性红斑狼疮相关疾病的dna文库，该文库包括18个系统性红斑狼疮相关疾病的致病基因，其中，所述18个系统性红斑狼疮相关疾病的致病基因如下表所示。
[0032]
表1
[0033][0034]
同时，本发明还提供了一种上述dna文库在制备诊断试剂盒中的应用，所述试剂盒用于诊断系统性红斑狼疮的致病基因。
[0035]
所述应用包括下列步骤：
[0036]
收集临床上考虑诊断系统性红斑狼疮受检者的临床资料及临床生物样本，包括但不限于来自受检者的外周血、体液、组织器官样本如毛囊、含有口腔上皮细胞的唾液等。
[0037]
a)提取基因组dna；
[0038]
b)高通量测序平台自动合成覆盖列表1基因的扩增引物池，对目标区域进行超多重pcr扩增；
[0039]
c)对扩增产物进行酶切，并连接上barcode；
[0040]
d)将连接产物进行pcr扩增，并纯化；
[0041]
e)点入芯片，上高通量测序仪进行测序；
[0042]
f)得到的测序数据进行生物信息学处理，分析疾病相关的突变位点，得到的突变位点进行sanger测序法验证并家系中共分离验证。
[0043]
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。
[0044]
实施例
[0045]
收集临床上考虑诊断系统性红斑狼疮受检者的临床资料及临床生物样本，包括但不限于来自受检者的外周血、体液、组织器官样本如毛囊、含有口腔上皮细胞的唾液等。
[0046]
提取基因组dna
[0047]
测定dna浓度，鉴定质量及制备工作液：应用thermo nano drop 2000分光光度计检测提取的外周血基因dna的浓度，质控要求为：dna浓度需不低于20ng/μl；a260/280值介于1.8～2.0之间，对于质量不合格的dna需重新提取；将质检合格的dna原液用low te稀释为5ng/μl，标记为工作液，-80℃下冻存。
[0048]
dna文库制备-扩增目的片段
[0049]
消化扩增产物，将上述上机完成后，合2管为1管，这时每个样品的体积为20μl。向每个样品中加入2μlfupa，这样每个反应的体积为22μl，振荡上pcr仪。
[0050]
加标签和公用接头，向上面消化完的体系中，加入如下试剂，配制好体系后，振荡离心，上pcr仪。
[0051][0052]
纯化产物并扩增，上机完成后，静置2分钟，稍离心把壁上水蒸气甩下。
[0053]
片段选择及产物纯化；
[0054]
使用qubit测定建库后浓度；
[0055]
运行油包水pcr扩增反应，准备及运行ot2，运行es富集连接成功的isp珠子，运行proton进行测序。
[0056]
一代验证(sanger验证)对二代测序引物未覆盖到的基因片段，以及点突变进行一代测序，使用primer premier 5软件进行设计引物，由奥科公司进行引物合成，每条引物为2或4od，使用page胶纯化，收到后用溶液te将其溶解稀释为100pmol储存液，-20摄氏度保存，进行pcr反应时将测序引物储存液用无菌纯净水稀释为10pmol工作液。
[0057]
测序仪运行完成后，下载对应的vcf文件，上传至thermo fisher scientific网页对突变进注释，然后剔除如下几个数据库中正常人带有的常见变异(1000genomes project数据库，ncbi dbsnp数据库，ucsc common snp数据库和esp数据库)，移除最小等位基因频率大于等于1％的突变。去除内含子上的无功能突变以及外显子上的同义突变，并对剩余突变使用sift和polyphen2软件进行功能评分，若sift值大于0.5，认为其为中性，不会造成功能上的改变，若值小于0.05，预测其为破坏性，polyphen2预测值越接近1，其破化蛋白质功能的可能性越大，越接近0，可能性越小。
[0058]
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。