一种用于治疗SARS-CoV-2病毒感染的N蛋白多肽的制作方法

mononuclear cells)：
16.在某医院收集covid-19康复患者的临床信息与全血样本，全血取于绿色抗凝管中，每个个体收集全血16ml，并于6小时内分离pbmc用于实验或-80℃冻存。
17.步骤五、hla分型测序：
18.提取康复者全血dna，基于高通量测序技术进行hla分型鉴定。
19.步骤六、体外免疫系统激活实验验证hla分型对应的多肽激活t细胞免疫的有效性：
20.pbmc细胞与合成的肽段疫苗共培养，采用酶联免疫斑点(enzyme-linked immunospot,elispot)方法检测激活的t细胞ifn-γ分泌水平，在体外实验验证多肽的有效性。
21.本发明与现有技术相比的优点是：
22.本发明提出一种用于治疗sars-cov-2病毒感染的n蛋白多肽，该多肽是基于人工智能算法预测的sars-cov-2特异性抗原肽n
261-279
，其氨基酸序列为krtatkaynvtqafgrrgp，具有安全性好，合成速度快的优点。利用n蛋白多肽n
261-279
刺激hla-a*02:01、a*11:01和a*24:02分型的sars-cov-2感染康复者血液pbmc细胞，均能够检测到t细胞的强烈应答反应。本发明提出的n蛋白多肽n
261-279
是sars-cov-2的n蛋白中对hla-a*02:01、a*11:01和a*24:02分型的理想表位，该多肽非常适用目前临床hla-a*02:01、a*11:01和a*24:02分型患者的sars-cov-2感染的治疗。
附图说明
23.图1是本发明的肽段与hla-a分子的对接图；
24.图2是本发明的肽段刺激sars-cov-2感染康复者t细胞反应结果图；
25.图3是本发明的肽段刺激sars-cov-2感染康复者t细胞反应结果统计图。
具体实施方式
26.下面结合附图进一步详细描述本发明：
27.一种用于治疗sars-cov-2病毒感染的n蛋白多肽，所述的n蛋白多肽为如seq id no.1所示的特异性抗原肽n
261-279
，其氨基酸序列为krtatkaynvtqafgrrgp。
28.一种用于治疗sars-cov-2病毒感染的n蛋白多肽的应用，应用在药学上可接受的盐或酯或前药，所述的盐或酯或前药包含n蛋白多肽n
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。
29.本发明基于人工智能算法预测并筛选与hla高亲和力的sars-cov-2病毒特异性抗原肽，在体外进行化学合成后用于刺激人体免疫细胞，激活sars-cov-2特异性的细胞免疫。经过体外实验，发现n蛋白多肽n
261-279
是sars-cov-2的n蛋白中对hla-a*02:01、a*11:01和a*24:02分型的理想表位。本发明提出的n
261-279
肽段作为一种临床治疗和预防新型冠状病毒的方法，对当前预防和治疗新型冠状病毒的传播和感染具有重大意义。
30.下面通过实验证明特异性抗原肽n
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在治疗sars-cov-2病毒感染上有效性。
31.本发明n蛋白多肽的开发过程以下几个步骤：
32.步骤一、人工智能算法的优化：
33.构建前馈单层人工神经网络，设定23个参数值作为算法的评分向量。23评分向量
输入值均为0.05，另外肽段水溶性、和正常人类蛋白差异等均作为输入层的参数。输入数据集主要使用iebd数据库和文献提供的质谱数据，并通过已经验证过的数据集验证模型。
34.步骤二、预测多肽：
35.通过构建的模型，输入sars-cov-2病毒的m蛋白序列和hla序列信息可以获取与该hla分型的高亲和力多肽序列，我们挑选排名前0.5％的多肽作为候选肽段。根据多肽与hla亲和力、肽段的水溶性、免疫原性等指标筛选出与hla结合ic50低于500nm、水溶性强、免疫原性强的9氨基酸(9-mer)肽段。筛选出10条9氨基酸(9-mer)肽段，分别在肽段两端分别延长5个氨基酸，得到对应的19氨基酸(19-mer)的免疫肽段。
36.名称氨基酸序列n
99-117
gkmkdlsprwyfyylgtgpn
160-178
qlpqgttlpkgfyaegsrgn
176-194
srggsqassrsssrsrnssn
217-235
aalalllldrlnqleskmsn
235-253
sgkgqqqqgqtvtkksaaen
261-279
krtatkaynvtqafgrrgpn
300-318
hwpqiaqfapsasaffgmsn
311-329
psasaffgmsrigmevtpsn
320-338
igmevtpsgtwltytgaikn
356-374
hidayktfpptepkkdkkk
37.步骤三、合成多肽：
38.利用化学合成法合成预测的sars-cov-2特异性多肽，分别为n
99-117
、n
160-178
、n
176-194
、n
217-235
、n
235-253
、n
261-279
、n
300-318
、n
311-329
、n
320-338
、n
356-374
，每种肽段纯度＞95％，共合成5mg肽段。取1mg溶于100μl无菌水中，制成母液，接着取一部分母液使用无菌水进行稀释，配制成工作液为200μg/ml。
39.步骤四、收集新冠病毒感染康复者的全血，分离pbmc(peripheral blood mononuclear cells)：
40.在某医院收集covid-19康复患者血液于绿色抗凝管中，每个个体收集血液16ml，并于6小时内分离pbmc用于实验或-80
°
冻存。首先将血液转移到干净的50ml离心管中，2000rpm，20℃离心10分钟；收集上层血清，-80℃冻存；向sepmatetm-50管底部加入ficoll-paque premium 1.077溶液，再向沉淀物中加入等体积的pbs，稀释血样并轻轻混合保持试管垂直，将稀释后的样品沿管壁加入sepmatetm-50管中，1200xg离心15min；然后将上层溶液离心并转移到一个新的50ml无菌离心管中，用pbs清洗沉淀物，共清洗2次；使用红细胞裂解液裂解细胞3分钟；最后用细胞冻存液悬浮细胞，被储存在液氮中，以便将来用于检测或直接用培养基悬浮用于检测。
41.步骤五、hla分型鉴定：
42.使用ex-dna全血基因组核酸提取试剂盒和np968全自动核酸提取仪进行全血dna的提取。按照说明书要求设置仪器自动化提取程序，dna提取完成后转移干净无核酸酶离心管中，-20℃保存。利用全血dna，hiseq x10等二代测序平台进行高通量测序鉴定hla分型。
43.步骤六、体外免疫系统激活实验验证hla分型对应的多肽激活t细胞免疫的有效
性：
44.a)细胞复苏并计数：从液氮中取出冻存pbmc细胞，于37℃水浴快速解冻。完全解冻后，台盼蓝染色计数活细胞数量。
45.b)细胞培养：按每孔5*10^6个细胞铺于24孔板。加入il-2(工作浓度20u/ml)、il-7(工作浓度20ng/ml)、合成的肽段(工作浓度2μg/ml)，于37℃(含5％co2)细胞培养箱培养10天。培养期间每三天半换液。
46.c)收细胞：培养10天后收取细胞。将细胞转移到离心管中，使用1*pbs清洗细胞3次，以去除培养液中的ifn-γ。使用1640培养液(含10％fbs)重悬细胞，并计数。
47.d)准备elispot板：配置35％乙醇，每孔加入35％乙醇孵育1min。无菌h2o洗涤5遍。每孔加100μl包被抗体(工作浓度15μg/ml)，4-8℃过夜孵育。
48.e)孵育细胞：用无菌1*pbs洗板5次。每孔加1640培养液(含10％fbs)，置于室温孵育至少30min。弃上清，加入细胞悬浮液，每孔细胞数2
×
10^4-2.5
×
10^5。
49.f)加入刺激物共培养：不含诱导物-h2o(阴性对照组)：加入无菌h2o 2μl；pha刺激(阳性对照组)：每孔加入10μl pha(工作浓度2.5μg/ml)；肽段刺激(实验组)：每孔分别加入1μl肽段n
99-117
、n
160-178
、n
176-194
、n
217-235
、n
235-253
、n
261-279
、n
300-318
、n
311-329
、n
320-338
、n
356-374
(工作浓度2μg/ml)。把板置于37℃培养箱(5％co2)，培养12-48小时。
50.g)显色：吸走细胞，用无菌1*pbs洗板5次。每孔加100μl检测抗体(工作浓度1μg/ml)，室温孵育2h。用无菌1*pbs洗板5次。每孔加100ul streptavidin-hrp，室温孵育1h。用无菌1*pbs洗板5次。每孔加入显色剂，室温避光孵育5-10min。
51.h)终止：加入无菌h2o终止。吸走上清，无菌h2o清洗3遍，晾干板，解剖镜下检测并统计斑点数。
52.i)结果分析：n
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肽与hla分子结合的核心序列展示如图1所示。使用10条预测的n蛋白肽段刺激康复者pbmc细胞，结果表明单肽n
99-117
、n
217-235
、n
261-279
、n
311-329
和n
320-338
刺激可产生显著的t细胞反应，其中单肽n
261-279
刺激在每位康复者中引起的t细胞反应最强烈(如图2和图3所示)。所以单肽n
261-279
是sars-cov-2的n蛋白中对hla-a*02:01、a*11:01和a*24:02分型的理想表位。
53.本发明的最佳实施例已被阐明，由本领域普通技术人员做出的各种变化或改型都不会脱离本发明的范围。