高产异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌的选育方法

1.本发明涉及一种高产氨基酸的高通量筛选方法，尤其是一种异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌高通量筛选方法，属于生物医药和大健康产业。


背景技术：

2.l-异亮氨酸是人体八种必需氨基酸之一，同时又是三种支链氨基酸之一，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中具有特别重要的地位。因此，已被广泛应用于食品、动物饲料和医药等行业。l-异亮氨酸的生产方法主要有蛋白质水解法、化学合成法和生物发酵法。生物发酵法因其原料成本低、易于控制、节能环保成为工业化生产的首选方法。目前，国内异亮氨酸的产量还不高，生产技术相对国外还具有较大差距，高产菌株的选育成为异亮氨酸产量提高的重要环节。
3.常温常压等离子体(artp)诱变育种技术是由清华大学自主研发的一种微生物基因组快速突变技术。该技术具有成本低、操作简便、安全性高以及等离子体产生条件温和富含大量活性粒子、突变谱广、突变率高等优点，被广泛用于细菌、真菌、微藻等微生物的生物育种。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本发明使用artp诱变仪对谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)进行处理，然后通过添加适宜浓度的磺胺胍抗性标记初筛，再将初筛菌株接种至多孔板发酵培养后取上清液进行茚三酮显色反应检测，实现高通量筛选，在国内外还未见报道。
5.本技术发明目的是提供高产异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌，谷氨酸棒杆菌b1，保藏编号：cctccno：m 2019118，分类命名corynebacterium glutamicum b1，保藏日期：2019年3月1号，保藏地点：湖北，武汉，武汉大学，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。本发明建立了一套高通量筛选流程，高产菌株artp诱变筛选主要步骤：将原始菌株培养后，先进行artp诱变条件的优化，然后通过磺胺胍抗性标记进行初筛，挑选丰度饱满的菌落，接种到多孔板中培养，提取发酵上清液与茚三酮试剂在一定条件下反应，挑选出在od
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下吸光值较大的菌株对应的发酵上清液
7.，进行薄层层析法针对性对照检测，再经摇瓶复筛培养，提取上清液，利用氨基酸分析仪检测其异亮氨酸含量。具体高产异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌的选育方法，包括如下步骤，其流程见图1。
6.(1)以谷氨酸棒杆菌为对象，在30-37℃，100-200r/min的摇床中培养一段时间，再经过常温常压等离子体诱变处理30-180s；
7.(2)待诱变处理后接种到磺胺胍培养基中，在30-37℃培养1-2天；
8.(3)将步骤(2)得到的菌株利用茚三酮进行特异性显色反应后识别出优势菌株，将该优势菌株在种子培养基中培养后，再在发酵培养基中培养，进行氨基酸分析检测复筛后，筛选得到产量最高的菌株corynebacterium glutamicumb1。
9.所述的常温常压等离子体诱变的辐射功率为100-120w，氦气流量为3-10l/min，诱变时间为 120-150s。
10.所述的磺胺胍培养基中含有0.05-0.4mg/ml的磺胺胍。
11.所述的步骤(3)中菌株与茚三酮采用多孔板进行特异性显色反应，多孔板包括48-96孔板。所述的将多孔板的优势菌株先在种子培养基中，在30-37℃、100-200r/min下培养1-2天；再以5-10％的接种量接种至发酵培养基中，再在30-37℃、100-200r/min下培养1-2天，进行氨基酸分析检测复筛后，可以得到性能稳定的高产菌株corynebacterium glutamicum b1。所述的种子液培养基g/l包括：葡萄糖5-10g/l，蛋白胨1-5g/l，氯化钠1-5g/l，牛肉浸粉1-3g/l，磷酸氢二钠0.03-1g/l；
12.发酵培养基g/l包括：葡萄糖5-10g/l，蛋白胨2-7g/l，氯化钠1-5g/l，牛肉浸粉1-3g/l，磷酸氢二钠0.3-1g/l，酵母浸粉1-5g/l，硫酸铵1-6g/l。针对上述的工艺步骤本发明的技术方案系统考察了本方法的artp诱变致死率的影响
13.使用不同的时间(0、60、90、120、150、180、210、240s)进行诱变处理，将诱变的菌体放入到1ml的生理盐水中振摇1min，取100ul涂布到平板培养基上37℃培养2天，计算致死率。
14.研究表明，等离子体中的活性粒子作用于微生物，能够使微生物细胞壁/膜的结构及通透性改变，并引起基因损伤，进而使微生物基因序列及其代谢网络发生显著变化，最终导致微生物产生突变。诱变时间和作用强度对微生物致死率的影响较大。致死率过低或过高都不利于筛选。结果见如图2所示。
15.从图2可以看出artp对corynebacteriumglutamicum的杀伤力较大，在60-120s之间呈直线增长方式，在处理时间为120s时致死率达到88％左右，180s的时候致死率达到了98.44％，当处理时间达到240s的时候，菌体基本上全部不能存活。为了保证一定的突变率，选择相应的诱变时间至关重要。实验表明，选择致死率达到95％以上的对应的辐射时间为宜。
16.更进一步的本技术发明还系统考察了磺胺胍浓度对菌株抑制率的影响
17.磺胺胍为天冬氨酸的结构类似物，通过选育磺胺胍抗性突变株能遗传性地解决天冬氨酸对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的反馈抑制。同时0、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4mg/ml 等不同浓度的磺胺胍对细胞的抑制程度不同，因此需要优化磺胺胍浓度使筛选效果达到最佳。选取不同的磺胺胍浓度进行研究。不同磺胺胍浓度对corynebacterium glutamicum的抑制率如图3所示。
18.从图3可以看出磺胺胍对corynebacteriumglutamicum的抑制效果明显。在低浓度 (0.1mg/ml)时，抑制作用较小，当磺胺胍浓度达到0.3mg/ml时，抑制效果增强，抑制率达到97％左右。当磺胺胍浓度达到0.4mg/ml时，菌体不能生长。为了在能使菌体能够生长的同时又能达到筛选效果，选取0.3mg/ml左右的磺胺胍浓度添加量作为筛选培养基的最佳添加量，用于磺胺胍抗性标记筛选。
19.另外，本发明的技术方案进行了优势菌株的高通量筛选
20.由于诱变产生的突变体多，所以需要建立一种高通量的快速筛选方式。先将平板上诱变的菌株用竹签接种到24孔1ml的培养基中，在37℃、300r/min的微孔板恒温摇床中培养，取培养24、36、48h的菌液离心取上清液20μl至96圆孔深孔板中，每个孔板加入240μ
l0.5％的茚三酮溶液，70℃水浴8min，然后冷却至室温，用酶标仪测其吸光度，以没有添加茚三酮溶液的吸收光强度为空白对照，筛选出氨基酸含量较高的突变株。并将诱变菌株在平板培养基上连续传代10次，再进行发酵培养，检测菌株的产酸能力，研究其遗传稳定性。
21.图4显示了以原始菌株吸光强度为1.0时，42个诱变菌株培养48h时的相对吸光强度。由图可见，大多数诱变菌株的相对吸光强度高于原始菌株，有三株诱变菌株b1、d6、e5的相对吸光值高于原始菌株20％以上，将诱变菌株b1、d6、e5和原始菌株w进行摇瓶发酵培养，利用氨基酸分析仪检测48h时的异亮氨酸产量。复筛结果如表1。
22.表1谷氨酸棒杆菌诱变复筛的结果
[0023][0024]
由表1可以看出，诱变菌株b1、d6、e5的摇瓶复筛产量相对原始菌株而言，依然表现出较好的异亮氨酸生产性能，其产量分别增加了62.03％、30.89％、14.19％。由此可见本实验的筛选方法是行之有效的。
[0025]
最后，本发明的技术方案得到的菌株进行了遗传稳定性考察
[0026]
为了检验优势诱变菌株corynebacterium glutamicumb1能否保持稳定的遗传特性，将诱变菌株b1连续传代培养10次，并同时进行发酵培养，检测发酵上清液在570nm下的吸光强度，结果如图5所示，从第1代到第10代菌株的吸光强度基本保持稳定，可见该诱变菌株具有良好的遗传稳定性。
[0027]
本发明的技术方案建立了高效的高产异亮氨酸菌株的筛选方法是artp诱变育种的难点。在异亮氨酸的合成路径中，天冬氨酸对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶存在着反馈抑制作用，若解除该反馈抑制能使代谢流更加通畅，从而增加异亮氨酸的产量。磺胺胍是天冬氨酸的结构类似物，如果将磺胺胍加入培养基中用于菌株的筛选，可望得到磺胺胍抗性突变株，就能遗传性的解除天冬氨酸对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的反馈抑制，使天冬氨酸大量合成。利用茚三酮与氨基酸的显色反应，可初步比较发酵液中游离氨基酸含量，然后结合多功能酶标仪可望实现多孔板的高通量筛选。
[0028]
通过将artp随机诱变与磺胺胍定向抑制微生物产酸代谢途径中的关键酶相结合，增大诱变菌株向异亮氨酸积累方向突变的几率，使筛选到优良菌株的概率升高，减少筛选的工作量，为产酸菌株的选育提供了高效的筛选方法，为其他高产异亮氨酸菌株的筛选提供重要参考。
附图说明
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图1为异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌高通量筛选方法的工艺流程图。
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图2为谷氨酸棒杆菌artp致死率曲线。
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图3为不同浓度磺胺胍对corynebacteriumglutamicum抑制率曲线。
[0032]
图4为突变菌株的相对吸光强度。
[0033]
图5为诱变菌株连续传代十次的吸光强度。
具体实施方式
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实施例1
[0035]
从原始菌株corynebacterium glutamicum出发，经过artp在辐射功率为110w，氦气流量为8l/min诱变处理130s后，接种到0.2mg/ml浓度的磺胺胍培养基中34℃培养1天，挑选出丰度饱满的菌株，然后接种至96孔板液体培养基培养，利用氨基酸与茚三酮的特异性反应与相对应的菌株发酵上清液进行高通量筛选，挑选吸光强度最大的菌株，在葡萄糖8g/l、蛋白胨3g/l、氯化钠2g/l、牛肉浸粉2g/l、磷酸氢二钠0.04g/l种子培养基下35℃、180 r/min培养36h，进行种子培养，然后以8％(v/v)的接种量接种至发酵培养基葡萄糖8g/l，蛋白胨5g/l，氯化钠4g/l，牛肉浸粉2g/l，磷酸氢二钠0.8g/l，酵母浸粉4g/l，硫酸铵5g/l 中于35℃、180r/min培养36h，然后进行氨基酸分析检测复筛结果后，可以得到性能稳定的高产菌株corynebacterium glutamicumb1，产异亮氨酸比原始菌株提高55.6％。
[0036]
实施例2
[0037]
从原始菌株corynebacterium glutamicum出发，经过artp在辐射功率为100w，氦气流量为7l/min诱变处理150s后，接种到0.3mg/ml浓度的磺胺胍培养基中33℃培养1天，挑选出丰度饱满的菌株，然后接种至96孔板液体培养基培养，利用氨基酸与茚三酮的特异性反应与相对应的菌株发酵上清液进行高通量筛选，挑选吸光强度最大的菌株，在葡萄糖8g/l、蛋白胨3g/l、氯化钠2g/l、牛肉浸粉2g/l、磷酸氢二钠0.04g/l种子培养基下于34℃、150 r/min培养1-2天进行种子培养，然后以7％(v/v)的接种量接种至葡萄糖8g/l、蛋白胨5g/l、氯化钠4g/l、牛肉浸粉2g/l、磷酸氢二钠0.5g/l、酵母浸粉4g/l、硫酸铵5g/l的发酵培养基中35℃、150r/min培养40h，进行氨基酸分析检测复筛后，可以得到性能稳定的高产菌株corynebacterium glutamicumb1，产异亮氨酸比原始菌株提高60.8％。
[0038]
实施例3
[0039]
从原始菌株corynebacterium glutamicum出发，经过artp在辐射功率为120w，氦气流量为3l/min诱变处理120s后，接种到0.08mg/ml浓度的磺胺胍培养基中30℃培养1天，挑选出丰度饱满的菌株，然后接种至96孔板液体培养基培养，利用氨基酸与茚三酮的特异性反应与相对应的菌株发酵上清液进行高通量筛选，挑选吸光强度最大的菌株，在葡萄糖6g/l、蛋白胨1g/l、氯化钠5g/l、牛肉浸粉3g/l、磷酸氢二钠0.5g/l种子培养基下35℃、120r/min 培养36h，进行种子培养，然后以10％(v/v)的接种量接种至发酵培养基葡萄糖5g/l，蛋白胨 2g/l，氯化钠2g/l，牛肉浸粉1g/l，磷酸氢二钠0.2g/l，酵母浸粉2g/l，硫酸铵3g/l中于30℃、150r/min培养39h，然后进行氨基酸分析检测复筛结果后，可以得到性能稳定的高产菌株corynebacterium glutamicumb1，产异亮氨酸比原始菌株提高61.7％。
[0040]
实施例4
[0041]
从原始菌株corynebacterium glutamicum出发，经过artp在辐射功率为100w，氦气流量为10l/min诱变处理140s后，接种到0.4mg/ml浓度的磺胺胍培养基中37℃培养2天，挑选出丰度饱满的菌株，然后接种至96孔板液体培养基培养，利用氨基酸与茚三酮的特异性反应与相对应的菌株发酵上清液进行高通量筛选，挑选吸光强度最大的菌株，在葡萄糖
10 g/l、蛋白胨5g/l、氯化钠1g/l、牛肉浸粉1g/l、磷酸氢二钠0.07g/l种子培养基下于34℃、 200r/min培养1-2天进行种子培养，然后以5％(v/v)的接种量接种至葡萄糖10g/l、蛋白胨4 g/l、氯化钠5g/l、牛肉浸粉3g/l、磷酸氢二钠0.6g/l、酵母浸粉3g/l、硫酸铵6g/l的发酵培养基中37℃、170r/min培养45h，进行氨基酸分析检测复筛后，可以得到性能稳定的高产菌株corynebacterium glutamicumb1，产异亮氨酸比原始菌株提高63.5％。