一种基于聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠的制备方法

1.本发明涉及一种基于聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠的制备方法。


背景技术：

2.脱氧核糖核酸(dna)是一种携带生物细胞中合成蛋白质所必需的遗传信息的核酸，是生物体发育和正常运转所必需的。dna分析由于其固有的特异性和技术能力，使得检测灵敏、快速对临床诊断、基因组学和食品安全有着至关重要的作用。在复杂的生物样品中，dna的含量相对较低(相对于其他成分)，因此样品中含有的蛋白质、多糖、磷脂和代谢物会严重干扰dna检测。
3.传统dna检测方法如苯酚/氯仿抽提法，异丙醇沉淀法，甲酰胺裂解法等主要借助沉淀，离心和过滤步骤，耗时耗力且提取效率低下。近年来，新的dna提取方法如液-液萃取法、液-液微萃取法、固相萃取法、磁固相微萃取法等得到了越来越多的研究。在以上提及这些方法中，磁固相微萃取因其低成本、少用有机溶液、过程简单、省时省力等优点，被广泛用于dna的富集检测。同时，磁固相微萃取中使用的磁性纳米颗粒(mnps)可以利用外部磁场快速收集，从而避免了因离心步骤产生的剪切力导致核酸降解损失。
4.在实际应用中，通常需要对磁性纳米颗粒(mnps)进行合适的表面修饰，一方面是为防止裸露的磁性纳米颗粒氧化和团聚，另一方面可以实现对核酸的高通量、自动化提取。常用于表面修饰的材料包括氨基硅烷化试剂、二巯基丁二酸、壳聚糖、聚乙烯亚胺、聚乙烯醇等。聚乙烯醇因其生物相容、无毒、低成本等优点，被广泛用于磁性纳米颗粒的修饰。基于聚乙烯醇修饰的fe3o4，材料表面富含大量的羟基官能团，材料分散性得到了很大的提高。如在wo 01/70831中，w.jeffery等报道了pva修饰的磁性纳米颗粒的合成及其生物材料分离方面的潜在性能。他们以体积分数2～7％的戊二醛为交联剂，质量分数为2.5～5％、分子量大于50000g/mol的聚乙烯醇为聚合物层，10-200nm的fe3o4为磁核，采用反向微乳液法合成了聚乙烯醇包覆的磁性纳米颗粒，但该方法制得的磁性纳米粒子尺寸大小为0.5～5μm，分布范围宽，尺寸大小不均一。再如在wo 2014/015966中，jungen oster等人探究了搅拌速度、聚合物浓度和交联剂浓度等因素对pva修饰的磁性纳米颗粒尺寸的影响，并将其用于实时定量荧光pcr检测。结果表明，高搅拌速度、低浓度聚合物和交联剂可以使微粒尺寸减小，磁性核心占比增加，甚至可以达到90％以上，但带来的是微粒悬浮分散性能变差。以上方法制得的磁性纳米粒子虽然可以实现对游离dna的分离富集，但都存在修饰过程繁琐，材料尺寸不一，尺寸分布范围较宽，磁性核心占比较少等问题，导致批次之间分离性能差异较大，分离时间有所延长。


技术实现要素：

5.发明目的：本发明目的旨在提供一种磁珠尺寸均一、且不同批次间磁珠尺寸差异小、磁性核心占比大、磁响应速度快的四氧化三铁磁珠的制备方法。
6.技术方案：本发明所述的基于聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠的制备方法，在有
机溶剂中，以1,6-己二基二异氰酸酯作为交联剂将fe3o4@sio2与聚乙烯醇进行桥联得到聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠。
7.上述制备方法具体包括如下步骤：
8.(1)将fe3o4@sio2超声分散于无水dmso中，搅拌下再往其中加入1,6-己二基二异氰酸酯，得到异氰酸基修饰的fe3o4@sio2；
9.(2)将步骤(1)得到的异氰酸基修饰的fe3o4@sio2分散于聚乙烯醇的dmso溶液中，反应后得到聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠。
10.其中，步骤(1)中，fe3o4@sio2中fe3o4的尺寸为15～400nm，二氧化硅壳层厚度为5～10nm。
11.其中，步骤(1)中，对于每g fe3o4@sio2，1,6-己二基二异氰酸酯的加入量为不大于1ml。
12.其中，步骤(2)中，聚乙烯醇的dmso溶液中，聚乙烯醇的质量分数为1～1.5％，聚乙烯醇的醇解度为92～94mol％。
13.其中，步骤(2)中，异氰酸基修饰的fe3o4@sio2与聚乙烯醇dmso溶液的质量体积比为10：1。
14.其中，步骤(1)中，fe3o4@sio2采用如下方法制备而成：
15.(1.1)按质量比1:1.5～3将fecl3·
6h2o和naac加入到有机溶剂中，充分溶解后，将混合物料置于高温下反应，得到fe3o4纳米粒子；所述fe3o4纳米粒子的粒径范围为15-400nm；通过控制原料fecl3·
6h2o和naac的加入比例，控制铁离子的水解速度快慢，最后通过加热得到超顺磁性fe3o4颗粒；
16.(1.2)将步骤(1.1)得到的fe3o4纳米粒子超声分散于盐酸溶液中，超声处理后用水洗涤至中性；将fe3o4纳米粒子与盐酸反应，使铁氧键暴露出来利于与二氧化硅的结合；
17.(1.3)将步骤(1.2)处理过的fe3o4超声分散于乙醇和水的混合溶剂中，加入氨水调节溶液为碱性，然后加入正硅酸四乙酯，反应后得到fe3o4@sio2；fe3o4@sio2为以四氧化三铁为核，在四氧化三铁表面包裹有二氧化硅层；通过控制fe3o4与正硅酸四乙酯的加入比，控制fe3o4外sio2层的包裹厚度，当sio2层的包裹厚度厚会影响终产物磁珠的磁性强度。
18.本发明方法的合成路线为：
[0019][0020]
本发明制得的聚乙烯醇修饰的fe3o4磁珠应用于核酸富集分离的原理为：在一定浓度nacl和peg溶液的协同作用下，游离的dna分子被沉淀下来，借助na

的盐桥作用，实现fe3o4磁珠对dna的结合，达到分离富集检测的目的。
[0021]
本发明制得的聚乙烯醇修饰的fe3o4在细菌质粒dna提取方面的应用，具体为：
[0022]
s1、裂解：菌体裂解液的制备：取过夜培养液于离心管中，4℃下10000r/min条件离心5min，弃上清液；向离心管中加入200μl溶菌酶溶液重悬菌体，37℃水浴30min，间或混匀直至细胞壁破碎，然后加入400μl细菌裂解液i和20μl蛋白酶k，震荡混匀5-6次，至溶液完全澄清；取出离心管，然后加入300μl细菌裂解液ii，充分混匀，12000rpm下离心5～10min，留上清液，得到细菌裂解液；
[0023]
s2、结合：取15μl fe3o4磁珠浓度为10mg/ml的悬浮液，悬浮液是将磁珠分散在水里，与结合缓冲液按合适体积比混匀，然后加入s1所得的细菌裂解液中，吹打混匀，室温静置1min；磁分离20s后，弃上清液，向离心管中加入质量分数为70％乙醇溶液洗涤2～3次，晾干至管内无液体残留；所用结合缓冲液为质量分数20％peg 8000和浓度2mol/l naci的混合溶液，结合缓冲液和悬浮液的体积比为50：1；
[0024]
s3、洗脱：加入te缓冲溶液洗脱吸附在fe3o4磁珠表面的dna，65℃水浴5～10min，间或混匀，磁分离，小心取上清液至新的离心管，获得细菌组dna。
[0025]
有益效果：(1)本发明方法制得的聚乙烯醇修饰的fe3o4磁珠尺寸均一，不同批次间尺寸差异小且重现性良好；(2)本发明方法制得的fe3o4磁珠磁性核心占比高，四氧化三铁外的二氧化硅和聚乙烯醇共同形成的壳层厚度为10nm以下，而fe3o4核尺寸大，为400nm左右，磁性核心占比高，磁性强，磁珠的饱和磁强度为77.21emu/g，磁响应时间为20s，具有磁响应速度快、分离时间短的优点，在磁分离过程中，能够实现30s以内的快速分离；(3)本发明方法制得的fe3o4磁珠表面富含羟基基团，材料在样品中分散稳定性良好，在一定浓度peg和nacl溶液协助下，与游离的dna分子实现结合，从而实现其能够应用于微量核酸的分离富集；(4)本发明制得的聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠dna提取灵敏度高，能够在较低的浓度下，实现dna实时荧光pcr扩增，ct值为18。
附图说明
[0026]
图1为实施例1制得的fe3o4磁珠提取细菌质粒dna的流程以及原理图；
[0027]
图2为实施例1制得的fe3o4磁珠的磁滞回线图；
[0028]
图3为不同fe3o4磁珠用量对细菌质粒dna提取效率的影响；
[0029]
图4为不同浓度nacl对fe3o4磁珠细菌质粒dna提取效率的影响；
[0030]
图5为不同浓度peg 8000对fe3o4磁珠细菌质粒dna提取效率的影响；
[0031]
图6为洗脱温度对fe3o4磁珠细菌质粒dna提取效率的影响；
[0032]
图7为在优化条件下，fe3o4磁珠与fe3o4@sio2提取细菌质粒dna的磁响应速度对比图；
[0033]
图8为在优化条件下，fe3o4磁珠与fe3o4@sio2提取细菌质粒dna的实时pcr扩增结果图。
[0034]
图9为在优化条件下，fe3o4磁珠与fe3o4@sio2提取细菌质粒dna的荧光pcr扩增结果图。
具体实施方式
[0035]
以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
[0036]
实施例1
[0037]
本发明基于聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠的制备方法，包括如下步骤：
[0038]
(1)将200mgfe3o4@sio2超声分散于40ml无水dmso中，搅拌(搅拌速度100r/min)后往其中加入200μl1,6-己二基二异氰酸酯，得到异氰酸基修饰的fe3o4@sio2；
[0039]
(2)将步骤(1)中200mg异氰酸基修饰的fe3o4@sio2分散于20ml质量浓度为1％的聚乙烯醇dmso溶液中，反应后得到聚乙烯醇修饰的四氧化三铁磁珠。超声混匀后测定固含量，即每毫升溶液中，聚乙烯醇包覆的四氧化三铁磁珠的质量为4.2mg/ml。
[0040]
从图2可以看出，制得的聚乙烯醇修饰的fe3o4磁珠呈现超顺磁性，无任何磁滞现象，饱和磁强度为77.21emu/g。
[0041]
实施例2
[0042]
聚乙烯醇修饰fe3o4磁珠加入量的不同对细菌质粒dna提取效率的影响：
[0043]
(1)裂解：菌体裂解液的制备：取过夜培养液于离心管中，4℃下10000r/min条件离心5min，弃上清。向离心管中加入200μl溶菌酶溶液重悬菌体，37℃水浴30min，间或混匀直至细胞壁破碎。然后加入200μl细菌裂解液i和20μl蛋白酶k，震荡混匀5-6次，至溶液完全澄清。取出离心管，然后加入细菌裂解液ii，充分混匀，12000rpm离心5～10min，留上清，得到细菌裂解液。
[0044]
(2)结合：设置磁珠用量梯度，分别取5μl、10μl、15μl、20μl、25μl和30μl浓度为10mg/ml的聚乙烯醇修饰的fe3o4磁珠与结合缓冲液按体积比1：50混匀，其中结合缓冲液中nacl浓度为2mol/l，peg 8000质量分数为20％。然后分别加入(1)所得的细菌裂解液中，吹打混匀，室温静置1min；磁分离，弃上清，向离心管中加入70％乙醇洗涤2～3次，晾干至管内无液体残留。
[0045]
(3)洗脱：加入ph＝8的te缓冲溶液洗脱吸附在材料表面的dna，65℃水浴5～10min，间或混匀，磁分离，小心取上清至新的离心管，获得细菌组dna。
[0046]
(4)检测：借助nanodrop 2000微量紫外分光光度计测定dna浓度；具体如下，首先将得到的细菌组dna摇动混匀，取1μl滴加到检测台上，读出dna浓度。然后依据公式q＝c
×
v/m，计算得到提取dna的效率。其中，q为提取dna的效率(mg/g)，m为加入的聚乙烯醇修饰的磁珠质量(μg)，c为得到的dna浓度，v为得到的细菌dna的体积。
[0047]
从图3的结果可以看出，随着聚乙烯醇修饰fe3o4磁珠加入量的增加，提取dna量效率先是不断增加，然后逐渐降低，推测原因可能为菌液中dna总量有限，磁珠吸附已经达到饱和。(加入量增加提取量降低的原因是随着磁珠加入量增加，分母增大，分子不变，提取效率降低)，临界点加入聚乙烯醇修饰fe3o4磁珠的体积为15μl。可以得出，当聚乙烯醇修饰fe3o4磁珠的加入量为15μl，吸附效率最高。
[0048]
实施例3
[0049]
结合缓冲液中nacl浓度的不同对细菌质粒dna提取效率的影响：
[0050]
(1)裂解：菌体裂解液的制备：取过夜培养液于离心管中，4℃下10000r/min条件离心5min，弃上清。向离心管中加入200μl溶菌酶溶液重悬菌体，37℃水浴30min，间或混匀直至细胞壁破碎。然后加入200μl细菌裂解液i和20μl蛋白酶k，震荡混匀5-6次，至溶液完全澄清。取出离心管，然后加入细菌裂解液ii，充分混匀，12000rpm离心5～10min，留上清，得到细菌裂解液。
[0051]
(2)结合：取15μl、10mg/ml聚乙烯醇修饰的fe3o4磁珠与一系列结合缓冲液按体积
比1：50混匀，其中，结合缓冲液中nacl浓度分别为0.5mol/l、1.0mol/l、1.5mol/l、2.0mol/l、2.5mol/l、3.0mol/l和3.5mol/l。然后分别加入(1)所得的细菌裂解液中，吹打混匀，室温静置1min。磁分离，弃上清，向离心管中加入70％乙醇洗涤2～3次，晾干至管内无液体残留。
[0052]
(3)洗脱：加入ph＝8的te缓冲溶液洗脱吸附在材料表面的dna，65℃水浴5～10min，间或混匀，磁分离，小心取上清至新的离心管，获得细菌组dna。
[0053]
(4)检测：借助nanodrop 2000微量紫外分光光度计测定dna浓度。具体如下，首先将得到的细菌组dna摇动混匀，取1μl滴加到检测台上，读出dna浓度。然后依据公式q＝c
×
v/m，计算得到提取dna的效率。其中，q为提取dna的效率(mg/g)，m为加入的聚乙烯醇修饰的磁珠质量(μg)，c为得到的dna浓度，v为得到的细菌dna的体积。
[0054]
从图4可以看出，随着nacl浓度的增加，提取dna的效率是不断增加，然后逐渐降低。可以得出，当nacl浓度为2.5mol/l时，吸附效率最高。原因是当nacl浓度不断升高，溶液中离子强度增大，聚乙烯醇修饰的fe3o4磁珠出现聚沉现象，影响其吸附效率。
[0055]
实施例4
[0056]
结合缓冲液中peg 8000浓度的不同对细菌质粒dna提取效率的影响：
[0057]
(1)裂解：菌体裂解液的制备：取过夜培养液于离心管中，4℃下10000r/min条件离心5min，弃上清。向离心管中加入200μl溶菌酶溶液重悬菌体，37℃水浴30min，间或混匀直至细胞壁破碎。然后加入200μl细菌裂解液i和20μl蛋白酶k，震荡混匀5-6次，至溶液完全澄清。取出离心管，然后加入细菌裂解液ii，充分混匀，12000rpm离心5～10min，留上清，得到细菌裂解液。
[0058]
(2)结合：取15μl、10mg/ml聚乙烯醇修饰的高磁性fe3o4与一系列结合缓冲液按体积比1：50混匀，其中，结合缓冲液中peg 8000质量分数分别为5％、10％、15％、20％、25％和30％，然后分别加入(1)所得的细菌裂解液中，吹打混匀，室温静置1min。磁分离，弃上清，向离心管中加入70％乙醇洗涤2～3次，晾干至管内无液体残留。
[0059]
(3)洗脱：加入ph＝8的te缓冲溶液洗脱吸附在材料表面的dna，65℃水浴5～10min，间或混匀，磁分离，小心取上清至新的离心管，获得细菌组dna。
[0060]
(4)检测：借助nanodrop 2000微量紫外分光光度计测定dna浓度。具体如下，首先将得到的细菌组dna摇动混匀，取1μl滴加到检测台上，读出dna浓度。然后依据公式q＝c
×
v/m，计算得到提取dna的效率。其中，q为提取dna的效率(mg/g)，m为加入的聚乙烯醇修饰的磁珠质量(μg)，c为得到的dna浓度，v为得到的细菌dna的体积。
[0061]
从图5可以看出，随着peg 8000质量分数的增加，提取dna的效率先是不断增加，然后略微降低，但分离时间显著增加。原因是peg 8000质量分数过高时，混合液黏性增强，磁性粒子扩散受阻，混合和磁分离时间延长，给实际操作带来了一定困难。由此可以得出，当peg 8000质量分数为15％，分离时间短且吸附效率最高。
[0062]
实施例5
[0063]
洗脱温度的不同对细菌质粒dna提取效率的影响：
[0064]
(1)裂解：菌体裂解液的制备：取过夜培养液于离心管中，4℃下10000r/min条件离心5min，弃上清。向离心管中加入200μl溶菌酶溶液重悬菌体，37℃水浴30min，间或混匀直至细胞壁破碎。然后加入200μl细菌裂解液i和20μl蛋白酶k，震荡混匀5-6次，至溶液完全澄清。取出离心管，然后加入细菌裂解液ii，充分混匀，12000rpm离心5～10min，留上清，得到
细菌裂解液。
[0065]
(2)结合：取15μl、10mg/ml聚乙烯醇修饰的fe3o4磁珠与一系列结合缓冲液按体积比1：50混匀，其中，结合缓冲液中nacl的浓度为2.5mol/l，peg 8000质量分数分别为15％，然后分别加入(1)所得的细菌裂解液中，吹打混匀，室温静置1min。磁分离，弃上清，向离心管中加入70％乙醇洗涤2～3次，晾干至管内无液体残留。
[0066]
(3)洗脱：分别加入ph＝8的te缓冲溶液洗脱吸附在材料表面的dna，分别在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃条件下水浴5～10min，间或混匀，磁分离，小心取上清至新的离心管，获得细菌组dna。
[0067]
(4)检测：借助nanodrop 2000微量紫外分光光度计测定dna浓度。具体如下，首先将得到的细菌组dna摇动混匀，取1μl滴加到检测台上，读出dna浓度。然后依据公式q＝c
×
v/m，计算得到提取dna的效率。其中，q为提取dna的效率(mg/g)，m为加入的聚乙烯醇修饰的磁珠质量(μg)，c为得到的dna浓度，v为得到的细菌dna的体积。
[0068]
从图6可以看出，随着洗脱温度的增加，提取得到的dna量先是不断增加，然后略微降低。原因是温度升高减弱了dna和材料间的相互作用，提取的细菌dna更容易脱附下来，脱附效率显著提高。但温度过高给实际操作带来了一定麻烦，相应操作繁琐(如冷却到室温时间长，影响后续相关pcr实验的开展)、升温时间长(水浴升温时间长)。由此可以得出，当洗脱温度为70℃，脱附效率最高。
[0069]
实施例6
[0070]
为了凸显本发明制备的聚乙烯醇修饰的fe3o4提取质粒dna的磁响应速度快，将聚乙烯醇修饰的fe3o4磁珠与fe3o4@sio2提取细菌质粒dna的磁响应速度进行了对比：
[0071]
1)裂解：菌体裂解液的制备：取过夜培养液于离心管中，4℃下10000r/min条件离心5min，弃上清。向离心管中加入200μl溶菌酶溶液重悬菌体，37℃水浴30min，间或混匀直至细胞壁破碎。然后加入200μl细菌裂解液i和20μl蛋白酶k，震荡混匀5-6次，至溶液完全澄清。取出离心管，然后加入细菌裂解液ii，充分混匀，12000rpm离心5～10min，留上清，得到细菌裂解液。
[0072]
(2)结合：分别取15μl、10mg/ml聚乙烯醇修饰的fe3o4磁珠、fe3o4@sio2与结合缓冲液按体积比1：50混匀，其中，结合缓冲液中nacl的浓度为2.5mol/l，peg 8000质量分数分别为15％，然后分别加入(1)所得的细菌裂解液中，吹打混匀，室温静置1min。磁分离，弃上清，评估磁分离速度快慢。
[0073]
磁响应速度结果如图7所示，可以清楚的看到，相较于fe3o4@sio2(图8左)，在外部磁场作用下，聚乙烯醇修饰的fe3o4磁珠可以在20s内快速响应，而fe3o4@sio2响应时间稍稍延长。因此，可以得出结论，本发明制得的聚乙烯醇修饰的fe3o4具有快的磁响应速度，将其应用于微量核酸的分离，大大节省时间。
[0074]
实施例7
[0075]
为了凸显本发明制备的聚乙烯醇修饰的fe3o4提取质粒dna的效率高，将聚乙烯醇修饰的fe3o4磁珠与fe3o4@sio2提取细菌质粒dna的效果进行了对比：
[0076]
(1)裂解：菌体裂解液的制备：取过夜培养液于离心管中，4℃下10000r/min条件离心5min，弃上清。向离心管中加入200μl溶菌酶溶液重悬菌体，37℃水浴30min，间或混匀直至细胞壁破碎。然后加入200μl细菌裂解液i和20μl蛋白酶k，震荡混匀5-6次，至溶液完全澄
清。取出离心管，然后加入细菌裂解液ii，充分混匀，12000rpm离心5～10min，留上清，得到细菌裂解液。
[0077]
(2)结合：分别取15μl、10mg/ml聚乙烯醇修饰的fe3o4磁珠、fe3o4@sio2与结合缓冲液按体积比1：50混匀，其中，结合缓冲液中nacl的浓度为2.5mol/l，peg 8000质量分数分别为15％，然后分别加入(1)所得的细菌裂解液中，吹打混匀，室温静置1min。磁分离，弃上清，向离心管中加入70％乙醇洗涤2～3次，晾干至管内无液体残留。
[0078]
(3)洗脱：分别加入ph＝8的te缓冲溶液洗脱吸附在材料表面的dna，分别在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃条件下水浴5～10min，间或混匀，磁分离，小心取上清至新的离心管，获得细菌组dna。
[0079]
(4)pcr扩增：选用的合适的mix体系进行扩增，具体条件如下：首先依次在pcr扩增管中加入5μl 2
×
mix buffer，2μl ddh2o，上游引物和下游引物各1μl，模板为提取的细菌dna2μl，总体积为10μl。然后将其放入pcr扩增仪进行扩增，循环扩增条件如下：95℃预变性2min，94℃变形30s，61℃退火30s，72℃预延伸30s，72℃延伸10min，循环次数为35次。
[0080]
pcr扩增结果如图8所示，聚乙烯醇修饰的fe3o4磁珠和fe3o4@sio2提取的乙肝病毒质粒dna均得到了良好的扩增。相较于fe3o4@sio2，聚乙烯醇修饰的fe3o4磁珠对应的条带更亮，说明聚乙烯醇修饰的fe3o4磁珠提取出的初始dna模板量比fe3o4@sio2多，由此可以得出结论，本发明制得的聚乙烯醇修饰的fe3o4磁珠具有良好的dna提取效果，可以将其应用于微量核酸的检测。
[0081]
实施例8
[0082]
为了凸显本发明制备的聚乙烯醇修饰的fe3o4提取质粒dna的灵敏度更高，将聚乙烯醇修饰的fe3o4磁珠与fe3o4@sio2提取细菌质粒dna的荧光pcr扩增结果进行了对比：
[0083]
(1)裂解：菌体裂解液的制备：取过夜培养液于离心管中，4℃下10000r/min条件离心5min，弃上清。向离心管中加入200μl溶菌酶溶液重悬菌体，37℃水浴30min，间或混匀直至细胞壁破碎。然后加入200μl细菌裂解液i和20μl蛋白酶k，震荡混匀5-6次，至溶液完全澄清。取出离心管，然后加入细菌裂解液ii，充分混匀，12000rpm离心5～10min，留上清，得到细菌裂解液。
[0084]
(2)结合：分别取15μl、10mg/ml聚乙烯醇修饰的fe3o4磁珠、fe3o4@sio2与结合缓冲液按体积比1：50混匀，其中，结合缓冲液中nacl的浓度为2.5mol/l，peg 8000质量分数分别为15％，然后分别加入(1)所得的细菌裂解液中，吹打混匀，室温静置1min。磁分离，弃上清，向离心管中加入70％乙醇洗涤2～3次，晾干至管内无液体残留。
[0085]
(3)洗脱：分别加入ph＝8的te缓冲溶液洗脱吸附在材料表面的dna，分别在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃条件下水浴5～10min，间或混匀，磁分离，小心取上清至新的离心管，获得细菌组dna。
[0086]
(4)荧光pcr扩增：选用的合适的mix体系进行扩增，具体条件如下：首先依次在pcr扩增板中加入10μl 2
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mix buffer，6μl ddh2o，上游引物和下游引物各0.5μl，探针0.5μl，模板为提取的细菌dna2.5μl，总体积为20μl。然后将其放入pcr扩增仪进行扩增，循环扩增条件如下：95℃预变性2min，94℃变形15s，61℃退火30s，72℃预延伸30s，72℃延伸10min，循环次数为40次。
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荧光pcr扩增结果如图9所示，可以明显看到，聚乙烯醇修饰的fe3o4磁珠和fe3o4@
sio2提取的乙肝病毒质粒dna均得到了良好的扩增，当荧光pcr扩增信号到达设定阈值时，相应的ct值分别为18和22，即达到相同的荧光强度时，聚乙烯醇修饰的fe3o4循环圈数更少，灵敏度更高。