一种脾脏靶向的纳米药物

1.本发明涉及分子药物及其制备技术领域，尤其涉及靶向药物相关技术。


背景技术：

2.肿瘤疫苗的目的是诱导有效的抗原特异性抗肿瘤免疫反应，延缓肿瘤的进展，在体内诱导强效的抗肿瘤免疫应答仍然是肿瘤疫苗研究领域迫切需要解决的问题。
3.尽管肿瘤免疫治疗疫苗的研究已经进行了多年，但肿瘤疫苗的效果却不尽如人意，可能是因为体外制备的树突状细胞抗原呈递能力较弱，未能在体内诱导强烈的抗原特异性t细胞免疫应答。
4.信使rna(mrna)疫苗是一种新兴的、最有潜力的肿瘤疫苗，近年来在基础研究和临床试验中得到了广泛的关注]。作为抗原分子，mrna可在表达肿瘤抗原的同时激活免疫系统。与传统疫苗相比，mrna疫苗具有安全、高效、成本低和可快速生产的优势。
5.然而，裸mrna易被降解。此外，由于mrna的阴离子特性，细胞对mrna的摄取极为困难，最终导致mrna体内递效率低下。mrna疫苗的开发依赖于有效的递送系统，既能保护mrna不被降解，又可改善其体内递送，从而诱导强效的抗肿瘤免疫应答。
6.脂质纳米粒(lnps)已成为sirna和mrna等核酸类药物分子体内应用的有效递送系统。脂质纳米粒装载sirna制备的基因药物onpattro和装载mrna制备的新型冠状病毒mrna疫苗已被fda批准上市。脂质纳米粒脂质成分的调整可以改变mrna的体内表达行为。
7.脂质纳米粒一般由可电离的脂质，辅助脂质，胆固醇，和聚乙二醇修饰的脂质等组成。脂质纳米粒最初主要用于sirna的递送。与腺相关病毒和慢病毒等病毒载体相比，脂质纳米粒等非病毒载体具有更优的安全性。以脂质纳米粒为载体的sirna药物在2018年被fda批准上市，其给药方式为静脉滴注，提示脂质纳米粒作为核酸类药物递送载体的安全性和有效性。目前，脂质纳米粒已成为最常用的mrna疫苗递送载体，在新型冠状病毒疫苗的开发中，以脂质纳米粒为载体的mrna疫苗已获批上市，用于新型冠状病毒的防治。尽管起步较晚，用于肿瘤免疫治疗的mrna脂质纳米粒疫苗发展迅速，且已有多谢研究进入临床试验阶段。脂质纳米粒可保护mrna免受体内外rna酶降解，改善mrna在体内的递送及dcs等抗原提呈细胞中的表达。装载mrna的脂质纳米粒静脉注射后主要在肝脏表达，mrna在脾脏等免疫器官的表达不足限制了mrna肿瘤疫苗的免疫活性，提示脂质体作为mrna疫苗递送载体仍需要进一步改造。
8.脾脏是机体最大的外周免疫器官，具有造血、贮血和过滤作用，也是接受抗原刺激产生免疫应答的场所。脾内定居着大量淋巴细胞和其他免疫细胞，抗原进入脾脏之后，可被抗原提呈细胞摄取并提呈给t细胞，诱导t细胞活化和增殖，产生致敏t淋巴细胞。淋巴结作为外周免疫器官，同样具有过滤和清除异物的作用，能处理外来异物性抗原产生免疫应答并被应用于肿瘤免疫治疗领域。然而，淋巴结清除癌细胞的能力较低，且其是针对来自淋巴液中的抗原产生免疫应答的场所。与淋巴结不同，脾脏是针对血液中的抗原产生免疫应答的场所，且90％左右的循环血液要经过脾，脾脏的这种生物学特性使得利用靶向递送技术
将经静脉注射的肿瘤抗原递至脾脏，通过诱导快速的抗肿瘤免疫应答，发挥高效地抗肿瘤作用成为可能。
9.近年来，研究者开始尝试将抗原至脾脏发挥免疫抗肿瘤作用。有研究者通过简单调整阳离子脂质体与mrna比例将抗原mrna递送至脾脏发挥疫苗抗肿瘤活性的研究报道，但后续无相关的报道，可能是阳离子脂质体的毒性及临床实验中疫苗的免疫抗肿瘤效果不佳。也有研究者将dna递送至脾脏内b细胞发挥预防性的免疫抗肿瘤活性。此外，有研究者通过调整纳米递送载体的粒径，将蛋白/多肽抗原递送至脾脏发挥免疫抗肿瘤作用，尽管有一定的抗肿瘤效果，这种策略递送抗原至脾脏的效率不高，且细胞毒性t淋巴细胞的应答强度并不清楚。
10.尽管已有一些将抗原递送至脾脏发挥免疫抗肿瘤作用的文献报道，脾脏在肿瘤疫苗开发中诱导快速免疫抗肿瘤应答的作用并未得到广泛的关注。目前，研究者更多地是以皮下注射的方式将抗原递送到淋巴结的抗原提呈细胞，但皮下注射介导的抗原递送过程仍然非常缓慢。考虑到肿瘤的快速生长，而皮下注射递送抗原至淋巴结的缓慢过程及诱导抗肿瘤免疫的延后性，淋巴结靶向的策略可能限制了肿瘤疫苗的治疗效果。对脂质纳米粒进行合理的设计可将mrna递送至脾脏表达。然而，通过脂质纳米粒脂质成分的调整将抗原mrna递送脾脏尚未见报道，脂质纳米粒将抗原mrna递送至脾脏后，能否诱导强效的抗原特异性细胞毒性t细胞应答，进而发挥有效的免疫抗肿瘤作用并不清楚。


技术实现要素：

11.本发明要解决的技术问题是提供一种脾脏靶向的纳米药物，独辟蹊径的对脂质纳米粒进行设计与调整，改善mrna纳米疫苗在脾脏的表达，增强其体内诱导细胞毒性t淋巴细胞应答的水平，发挥mrna纳米疫苗高效的免疫抗肿瘤作用。
12.为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
13.一种脾脏靶向的纳米药物，包括疏水性的递送脂质体和包裹在递送脂质体内部的活性成分，所述递送脂质体具有高度的脾脏靶向性；所述活性成分包括但不限于：具有疾病预防功能的成分、具有疾病治疗功能成分、抗原、免疫调节剂、营养素、其他活性成分，单一成分或任意组合。
14.作为本发明的一种优选技术方案，所述活性成分具有肿瘤抗原活性，为编码肿瘤抗原的核酸类分子。
15.作为本发明的一种优选技术方案，所述肿瘤包括：淋巴瘤。
16.作为本发明的一种优选技术方案，所述核酸类分子为mrna。
17.作为本发明的一种优选技术方案，所述核酸类分子为编码卵清蛋白ova的mrna。
18.作为本发明的一种优选技术方案，所述mrna的制备过程包括：首先选择模版质粒载体，插入编码序列构建重组质粒，经加工得到线性化模板质粒，再用mrna的体外转录试剂盒合成新的重组质粒，经过加帽和加尾以增加稳定性，最后经纯化得到可供使用的抗原mrna。
19.作为本发明的一种优选技术方案，所述mrna的制备步骤为：选择含有mhc i分子胞内信号肽的模版质粒载体pst1-mitd，插入编码鸡卵清蛋白的序列构建质粒pst1-ova-mitd，然后用内切酶线性化质粒模板，纯化后得到可供制备mrna的线性化模板质粒，再用
mrna的体外转录试剂盒合成ova-mrna，新制备的ova-mrna进行加帽和加尾，增加mrna的稳定性和表达效率，经纯化得到可供使用的抗原mrna。
20.作为本发明的一种优选技术方案，所述递送脂质体包含基础载体和对所述基础载体进行修饰的功能性脂肪酸，所述功能性脂肪酸为硬脂酸和/或其类似物及衍生物。
21.作为本发明的一种优选技术方案，所述递送脂质体中功能性脂肪酸的摩尔含量为10％-80％，优选为60％-80％。
22.作为本发明的一种优选技术方案，所述递送脂质体中功能性脂肪酸的摩尔含量为66.7％。
23.一种脾脏靶向的纳米药物的制备方法，分别量取相应配方量的dlin-mc3-dma、dspc、cho-hp、dmg-peg2000和硬脂酸储备液，混匀后补加无水乙醇备用，将配方量的mrna溶解在的碳酸盐缓冲液中，溶解脂质的乙醇溶液和溶解mrna的碳酸盐缓冲液按照1:3的体积比例迅速混匀，室温孵育30min左右，之后利用超滤的方法除去乙醇，即得。
24.采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
25.本发明独辟蹊径对脂质纳米粒进行了全新设计与调整，改善了mrna纳米疫苗在脾脏的表达，增强了其体内诱导细胞毒性t淋巴细胞应答的水平，发挥了mrna纳米疫苗高效的免疫抗肿瘤作用。
26.关于递送载体，本发明采用硬脂酸修饰纳米脂质粒，制备得到一种脾脏靶向性纳米递送载体，提高了纳米递送载体的脾脏靶向性。本发明纳米递送载体的功能材料脂肪酸来源于天然产物，制备成本低廉，有利于工业化生产和应用。本发明提供的纳米递送载体显示出良好的廓形，接近球形，同时具有良好的贮存稳定性，技术优势和实用价值十分突出。
27.进一步的，对于本发明所构建的基于脂质纳米粒的脾脏靶向性mrna纳米疫苗，我们有望进一步对其理化性质进行系统表征，通过动物和细胞试验研究其体内外脾脏靶向性与免疫活性，明确该新型mrna纳米疫苗用于肿瘤免疫治疗的可能和安全性，并阐明其分子机制，为后续开发自主脾脏靶向性mrna肿瘤疫苗奠定基础。
附图说明
28.图1为脾脏靶向性药物体内作用示意图。
29.图2为本发明纳米递送载体与其他对照纳米递送载体的体内脾脏靶向性结果示意图。
30.图3为硬脂酸修饰后降低递送系统肝脏分布的数据图，从中能够直接看到修饰前后的肝脏分布和表达。
31.图4为本发明纳米递送载体与其他对照纳米递送载体的肝细胞摄取结果示意图。
32.图5为本发明纳米递送载体的贮存稳定性检测结果。
33.图6为本发明纳米递送载体的微观形态和粒径及电位的检测结果示意图。
34.图7为靶向药物靶向脾脏内树突状细胞的情况示意图；图中，a为流式细胞术的画门策略，b和c分别为对照组和靶向药物靶向脾脏内各细胞的代表性图片，d为统计结果，n＝3。
35.图8为靶向药物增强抗原特异性细胞免疫应答的水平示意图；图中，a为流式细胞术的画门策略，b为对照组和靶向药物靶向脾脏内各细胞的代表性图片，n＝3。
36.图9为靶向药物发挥强效的免疫预防肿瘤作用a为动物实验方案的示意图；
37.图中，b，c和d分别为荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线，体重变化曲线和生存期，e，e和g分别为pbs，对照纳米药物(slnps-luc)和靶向纳米药物(slnps-ova)免疫后，各组荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线，h，i和j分别为pbs，对照纳米药物(slnps-luc)和靶向纳米药物(slnps-ova)免疫后，各组荷瘤小鼠的在18天时肿瘤的图片，n＝6。
38.图10为治疗性的应用示意图。
39.图11为安全性评价示意图。
40.图12为降低剂量后治疗性的应用示意图。
具体实施方式
41.以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。
42.在以下实施例的描述中，为了说明而不是为了限定，提出了诸如特定系统结构、技术之类的具体细节，以便透彻理解本技术实施例。然而，本领域的技术人员应当清楚，在没有这些具体细节的其它实施例中也可以实现本技术。
43.应当理解，当在本技术说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素和/或其集合的存在或添加。
44.还应当理解，在本技术说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/或”是指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合，并且包括这些组合。
45.另外，在本技术说明书和所附权利要求书的描述中，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
46.在本技术说明书中描述的参考“一个实施例”或“一些实施例”等意味着在本技术的一个或多个实施例中包括结合该实施例描述的特定特征、结构或特点。由此，在本说明书中的不同之处出现的语句“在一个实施例中”、“在一些实施例中”、“在其他一些实施例中”、“在另外一些实施例中”等不是必然都参考相同的实施例，而是意味着“一个或多个但不是所有的实施例”，除非是以其他方式另外特别强调。术语“包括”、“包含”、“具有”及它们的变形都意味着“包括但不限于”，除非是以其他方式另外特别强调。
47.实施例1、脾脏靶向性药物(如：mrna纳米疫苗)体内作用途径概述
48.参见图1，为脾脏靶向性mrna纳米疫苗体内发挥肿瘤免疫治疗效果的作用示意图。硬脂酸修饰的脂质纳米粒mrna新型纳米疫苗递送系统静脉注射后能将其装载的抗原mrna靶向递送至脾脏内抗原递呈细胞树突状细胞特异性表达，该mrna新型纳米疫苗递送系统改善mrna表达的同时刺激抗原提呈细胞活化，促进抗原提呈细胞将抗原分子提呈给t细胞，t细胞增殖、分化，产生抗原特异性的效应t细胞，由效应t细胞杀伤肿瘤细胞，最终发挥强效的免疫抗肿瘤作用。
49.实施例2、mrna的设计与制备
50.首先选择含有mhc i分子胞内信号太的模版质粒载体pst1-mitd，插入编码鸡卵清蛋白ova，构建获得质粒pst1-ova-mitd。mrna的制备：质粒构建成功后，使用相应的内切酶线性化质粒模板，纯化后得到可供制备mrna的线性化模板质粒，之后使用mrna的体外转录
试剂盒，合成ova-mrna，新制备的ova-mrna进行加帽和加尾，增加mrna的稳定性和表达效率，之后经过纯化后即得可供使用的抗原mrna。
51.实施例3、纳米递送载体的制备
52.本实施例制备靶向脾脏纳米递送载体的具体方法如下：分别量取相应处方量的dlin-mc3-dma、dspc、cho-hp、dmg-peg2000或者硬脂酸(stearic acid，sa)储备液，混匀后补加相应体积的无水乙醇备用，将处方量的mrna溶解在一定体积的碳酸盐缓冲液中，溶解脂质的乙醇溶液和溶解mrna的碳酸盐缓冲液按照1:3的体积比例迅速混匀，室温孵育30min左右，之后利用超滤的方法除去乙醇即得。(普通纳米递送载体的制备方法与上述靶向脾脏纳米递送载体的制备方法类似。)
53.首先设计不同含量硬脂酸修饰的纳米递送载体。该纳米递送载体中各组成的用量如下表1所示。
54.表1不同含量硬脂酸修饰的纳米递送载体的处方组成
[0055][0056]
在上述研究的基础上，进一步设计不同含量硬脂酸修饰的纳米递送载体。优化的纳米递送载体中各组成的用量如下表2所示。
[0057]
表2优化的硬脂酸修饰的纳米递送载体的处方组成
[0058][0059]
实施例4、纳米递送载体的脾脏靶向性
[0060]
采用6-7周龄的正常雌性c57bl6/c小鼠的进行体内分布研究，每组3只小鼠。静脉注射至小鼠体内，luc-mrna的用量为4μg/只。注射后小鼠自由饮食饮水。静脉注射6h后，腹
腔注射luciferin substrate 200μl。7min之后对小鼠执行安乐死，分离肝、脾和肺等脏器，考察不同含量硬脂酸修饰纳米递送载体静脉注射后在肝脏、脾脏和肺等部位的表达。
[0061]
试验结果参见图2。图2显示了不同含量硬脂酸修饰脂质纳米粒mrna新型递送系统的体内mrna递送行为。图中，a为配方为a的ivt luc-mrna体内主要脏器表达的代表性图片，b、c和d分别为肝脏、脾脏和肺脏表达信号的定量统计结果，e为肝脏、脾脏和肺脏表达信号在总表达信号的比例。f为配方为b的ivt luc-mrna体内主要脏器表达的代表性图片，g、h和i分别为肝脏、脾脏和肺脏表达信号的定量统计结果，j为肝脏、脾脏和肺脏表达信号在总表达信号的比例。
[0062]
由图a-e可知，配方为a的不同含量硬脂酸修饰脂质纳米粒mrna新型递送系统的体内靶向性研究试验结果显示：未经肪酸修饰的脂质纳米粒主要将mrna递送至肝脏表达，此外，脾脏也有一定的mrna表达；脂肪酸的加入能够改变脂质纳米粒的体内mrna递送行为，具体表现为脂肪酸的加入可以降低mrna在肝脏的表达，一定程度上增加mrna在肝脏的相对富集；尽管脂肪酸的加入未能完全降低脂质纳米粒的mrna肝脏递送行为，但上述数据提示我们脂肪酸的加入可以降低mrna在肝脏的表达，硬脂酸修饰的脂质纳米粒可能具有将mrna递送至脾脏表达的潜力，值得进一步地研究。
[0063]
由图f-i可知，配方为b的的硬脂酸修饰的脂质纳米粒的mrna新型递送系统体内靶向性研究试验结果显示：经过脂质纳米粒mrna递送系统中硬脂酸加入量的系统优化，硬脂酸修饰的脂质纳米粒能够显著降低脂质纳米粒的mrna肝脏递送行为，将mrna特异性递送至脾脏表达；上述数据提示我们基于肝脏脂肪酸代谢策略构建脾脏靶向性脂质纳米粒mrna新型递送系统的想法是可行的。
[0064]
未经硬脂酸修饰的脂质纳米粒主要将mrna递送至肝脏表达，此外，脾脏也有一定的mrna表达；硬脂酸的加入能够改变脂质纳米粒的体内mrna递送行为，具体表现为脂肪酸的加入可以降低mrna在肝脏的表达，一定程度上增加mrna在肝脏的相对富集。优选方案制备的递送系统体内靶向性研究试验结果显示：硬脂酸的比例为66.7％时，其修饰的脂质纳米粒能够显著降低脂质纳米粒的mrna肝脏递送行为，将mrna特异性递送至脾脏表达，而硬脂酸的比例进一步增加至75％时，虽然递送系统也能将mrna靶向性递送至脾脏表达，但是mrna编码蛋白的表达量显著降低。
[0065]
实施例5、纳米递送载体的肝细胞摄取特性
[0066]
首先，采用利用cy5标记的胆固醇替换部分胆固醇的方法制备cy5标记的靶向脾脏的纳米递送载体(slnps)和cy5标记的普通纳米递送载体(lnps)，按照cy5标记胆固醇20μg/mouse的剂量进行静脉注射，2h后对小鼠执行安乐死，分离小鼠的肝脏，使用研磨的方式制备单细胞悬液。进行后续的相关检测。
[0067]
每支流式管中加入100μl的单细胞悬液(每只流式管细胞数量约为2
×
106)，每支流式管中加入1μl anti-mouse cd16/32，混匀后4℃条件下孵育10min，之后相应流式管中分别加入1μl apc-r700-anti-mouse-cd45，fitc-anti-mouse-cd3，bv510-anti-mouse b220，pe-anti-mouse-cd11b和percp-cy5.5-anti-mouse-cd11c在4℃条件下避光染色45min，达到孵育时间后使用无菌pbs洗涤细胞3遍，细胞重悬于0.3ml的无菌pbs中进行流式检测分析，检测脾脏中各细胞亚群摄取cy5标记的靶向脾脏的纳米递送载体(slnps)和cy5标记的普通纳米递送载体(lnps)的情况。
[0068]
具体检测结果见图3-4。可见，肝脏实质细胞(cd45-)摄取硬脂酸修饰的递送系统较普通递送系统显著降低，具体地，摄取硬脂酸修饰的脂质纳米粒mrna新型递送系统显著减少的细胞主要为非免疫细胞(肝脏实质细胞，cd45-)。考虑到肝脏中主要是cd45-的非免疫细胞，cd45 免疫细胞的比例不足10％，故硬脂酸修饰的脂质米粒递送系统较普通的脂质纳米粒mrna新型递送系统显著降低脏实质细胞介导的。详细分述如下。
[0069]
图3显示了装载ivt luc-mrna的cy5标记的硬脂酸修饰的脂质纳米粒mrna新型递送系统的体内ivt luc-mrna体内表达和分布结果。图中，a为ivt luc-mrna在体内各脏器的表达情况，b为ivt luc-mrna在体内各脏器表达的统计结果，c为cy5标记的硬脂酸修饰的脂质纳米粒mrna新型递送系统在体内各脏器的分布情况，d为cy5标记的硬脂酸修饰的脂质纳米粒mrna新型递送系统在体内各脏器分布情况的统计结果。
[0070]
根据图3的结果：cy5标记的硬脂酸修饰的脂质纳米粒mrna新型递送系统静脉注射至小鼠体内后，能够将ivt luc-mrna特异性递送至脾脏表达；而分布结果显示cy5标记的硬脂酸修饰的脂质纳米粒mrna新型递送系统却主要在肝脏分布，值得注意的是，硬脂酸修饰的脂质纳米粒mrna新型递送系统在肝脏的分布较普通脂质纳米粒mrna递送系统显著降低，提示我们基于肝脏脂肪酸代谢特征设计脾脏树突状细胞靶向性的硬脂酸修饰的脂质纳米粒mrna新型递送系统是可行的。
[0071]
图4显示了肝脏免疫细胞和非免疫细胞亚摄取cy5标记的硬脂酸修饰的脂质纳米粒mrna新型递送系统和普通脂质纳米粒mrna递送系统的流式细胞仪检测结果。图中，a为流式细胞术检测肝脏中不同细胞亚群的策略，b和c分别为肝脏中非免疫细胞(cd45-)亚群摄取cy5标记的硬脂酸修饰的脂质纳米粒mrna新型递送系统和普通脂质纳米粒mrna递送系统的代表性流式点状图和统计结果。d和e分别为肝脏中免疫细胞(cd45 )亚群摄取cy5标记的硬脂酸修饰的脂质纳米粒mrna新型递送系统和普通脂质纳米粒mrna递送系统的代表性流式点状图和统计结果。
[0072]
根据图4的结果：肝脏细胞摄取硬脂酸修饰的脂质纳米粒mrna新型递送系统较普通的脂质纳米粒mrna新型递送系统显著降低，具体地，摄取硬脂酸修饰的脂质纳米粒mrna新型递送系统显著减少的细胞主要为非免疫细胞，考虑到肝脏中主要是cd45-的非免疫细胞，cd45阳性免疫细胞的比例不足10％，故硬脂酸修饰的脂质纳米粒mrna新型递送系统较普通的脂质纳米粒mrna新型递送系统显著降低是肝脏实质细胞介导的。图4的实验结果直接证明了本文基于肝脏脂肪酸代谢设计脾脏树突状细胞靶向性的硬脂酸修饰脂质纳米粒mrna新型递送系统是可行的。
[0073]
实施例6、纳米递送载体的贮存稳定性
[0074]
新制备的靶向脾脏的纳米递送载体平均分为若干份，4℃条件下保存，分别于第0、7、15、30天取样，采用6-7周龄的正常雌性c57bl6/c小鼠，利用小动物活体成像仪对靶向脾脏的纳米递送载体的表达活性进行研究。
[0075]
每个时间点都分为pbs组和靶向脾脏的纳米递送载体组，每组2只小鼠。静脉注射至小鼠体内6h后，腹腔注射luciferin substrate 200μl。分离小鼠肝脏、脾脏和肺等主要脏器，通过考察不同贮存时间点靶向脾脏的纳米递送载体的表达活性研究其贮存稳定性。
[0076]
结果如图5所示。图5显示了mrna新型递送系统4℃贮存的体内表达活性。根据图5，4℃条件下放置30天时，脾脏靶向性的硬脂酸修饰的脂质纳米粒mrna新型递送系统的脾脏
ova)、装载ivt luc-mrna和ivt ova-mrna的靶向药物组(slnps-luc和slnps-ova)，每组3只，免疫方式为静脉注射，按照每只小鼠20μg mrna(200μl)的量进行注射。疫苗免疫接种当天记为day 0。之后每隔一5天进行一次免疫，共3次。
[0089]
(2)抗原特异性细胞免疫应答检测。第3次免疫1周后进行收集脾脏进行抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞检测。达到预设的时间点后，断颈处死小鼠，取小鼠脾脏，研磨脾脏，过70μm孔径的无菌尼龙滤网，收集脾脏单细胞悬液。细胞悬液离心后弃上清液，加入预冷的红细胞裂解液裂解红细胞，之后加入20ml rpmi 1640基础培养液，离心后弃上清，加入3ml含1％bsa的pbs重悬细胞，计数(约3
×
107cells)，调整细胞密度为2
×
107cells/ml。每支流式管中加入100μl细胞悬液(每只流式管细胞数量约为2
×
106)，每支流式管中加入1μl anti-mouse cd16/32，混匀后4℃条件下孵育10min，之后相应流式管中分别加入1μl apc-r700-anti-mouse-cd45，percp-cy5.5-anti-mouse-cd8和apc-h-2kb siinfekl tetramer在4℃条件下避光染色45min，达到孵育时间后使用无菌pbs洗涤细胞3遍，细胞重悬于0.3ml的无菌pbs中进行流式检测分析。
[0090]
脾脏中抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞测定结果见图8，图中，a为流式细胞术的画门策略，b为对照组和靶向药物靶向脾脏内各细胞的代表性图片，n＝3。从图中可见，pbs组小鼠脾脏中抗原特异性t细胞在cd8

t细胞的比例为1.32
±
0.62％。lnps-luc、lnps-ova、slnps-luc和slnps-ova抗原特异性t细胞在cd8

t细胞的比例分别为1.12
±
0.25％，7.76
±
1.99％，1.12
±
0.44％和13.54
±
3.33％。检测结果显示slnps-ova免疫组小鼠血液中抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞显著高于pbs组、lnps-ova和slnps-luc免疫组小鼠。此外，lnps-ova免疫组小鼠脾脏中抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞与pbs组及lnps-luc组相比具有统计学差异。综合slnps-ova的体内免疫抗肿瘤效果，抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞在体内高效的免疫抗肿瘤作用发挥中可能发挥了关键作用。
[0091]
实施例11、靶向药物免疫抗肿瘤作用效用研究
[0092]
适应性饲养1周的小鼠随机分组，每组6只，分别为pbs组(pbs)、装载ivt luc-mrna的靶向药物对照组(slnps-luc)和装载ivt ova-mrna的靶向药物组(slnps-ova)，按照每只小鼠20μg mrna(200μl)的量进行注射。小鼠接种肿瘤细胞当天记为day 0，在接种肿瘤前的第13天利用静脉注射的方式进行免疫接种，此后每隔5天进行一次免疫接种，共免疫三次。从第7天可看到明显的瘤结开始测量肿瘤，每隔2-3天测量一次，先测量肿瘤的最大径(a)，再测量与最大径线垂直的最长径线(b)，单位为mm，按a*b*b/2的公式计算肿瘤体积，本次动物试验中，对肿瘤体积大于1500mm3的小鼠实行安乐死。小鼠免疫治疗方案及mrna新型递送系统的淋巴瘤免疫预防作用。
[0093]
参见图9，指向了预防性的应用，图中，a为动物实验方案的示意图，b，c和d分别为荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线，体重变化曲线和生存期，e，e和g分别为pbs，对照纳米药物(slnps-luc)和靶向纳米药物(slnps-ova)免疫后，各组荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线，h，i和j分别为pbs，对照纳米药物(slnps-luc)和靶向纳米药物(slnps-ova)免疫后，各组荷瘤小鼠的在18天时肿瘤的图片，n＝6。
[0094]
图10为治疗性的应用，图11为安全性评价，图12为降低剂量后治疗性的应用。
[0095]
从图10-12中可见，利用小鼠淋巴瘤的移植瘤模型，证实了硬脂酸修饰的脂质纳米粒mrna新型纳米疫苗递送系统的预防性免疫抗肿瘤作用，与对照组相比，硬脂酸修饰的脂
质纳米粒mrna新型纳米疫苗递送系统接种后能够显著抑制肿瘤的发生与生长。通过治疗性的免疫抗肿瘤实验，进一步证实了硬脂酸修饰的脂质纳米粒mrna新型纳米疫苗递送系统用于肿瘤免疫治疗的潜力，与普通脂质纳米粒mrna纳米疫苗递送系统相比，硬脂酸修饰的脂质纳米粒mrna新型纳米疫苗递送系统接种后能够显著抑制肿瘤的生长，并实现了约55％的肿瘤治愈率(5/9of slnps-ova vs.0/9of lnps-ova)。通过分析主要脏器的形态分析等对硬脂酸修饰的脂质纳米粒mrna新型纳米疫苗递送系统的安全性进行评价，硬脂酸修饰的脂质纳米粒mrna新型纳米疫苗递送系统免疫后不影响主要脏器的形态，体内应用的安全性较好。通过进一步的药效学实验，证实了低剂量的硬脂酸修饰的脂质纳米粒mrna新型纳米疫苗递送系统仍然具有一定的免疫抗肿瘤作用，上述结果均为为硬脂酸修饰的mrna新型递送系统向临床阶段的转化奠定了基础。
[0096]
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述或记载的部分，可以参见其它实施例的相关描述。
[0097]
以上所述实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围，均应包含在本发明的保护范围之内。