一种基于酶促反应调控的壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸水凝胶及其制备方法和应用

一种基于酶促反应调控的壳聚糖/
γ-聚谷氨酸/单宁酸水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及一种基于酶促反应调控的壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸水凝胶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.生物大分子水凝胶具有高生物相容性，在伤口敷料或给药系统领域具有广阔的应用前景。然而，因结构固定，传统水凝胶载药范围受限，表现为装载药物类型单一和装载量无法控制。
3.单宁酸(tannic acid，ta)是一种天然的、植物衍生的多酚，含有丰富的邻苯三酚和邻苯二酚基团，可以与生物聚合物如胶原蛋白、壳聚糖、明胶和蛋白进行非共价作用。由于其结构中含有大量的羟基，与其他高分子材料形成氢键，广泛应用于生物材料的设计，包括表面功能化、蛋白质修饰和生物材料交联等。此外，ta还具有抗菌，抗氧化和抗炎性能，并已应用于伤口治疗。
4.目前，限制水凝胶应用的难题主要是其机械性能差和结构难以调节，已有研究主要聚焦水凝胶改性接枝等，未见基于酶促反应调控壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸水凝胶的制备方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种基于酶促反应调控的壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸水凝胶及其制备方法和应用，本发明以壳聚糖、γ-聚谷氨酸和单宁酸为水凝胶的主要成分，基于流延法制得水凝胶复合膜，通过单宁酶酶解水凝胶复合膜进行调控，酶解后的复合膜不仅具有优良的机械性能、吸保水性能、抗氧化性、水蒸气透过率，而且能够通过酶促反应调控载药类型，具有作为药物载体或伤口辅料进行应用的潜力。
6.本发明采取的技术方案如下：
7.基于酶促反应调控的壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸水凝胶的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
8.(1)将γ-聚谷氨酸和单宁酸在碱溶液中加热搅拌至完全溶解，随后加入壳聚糖搅拌使其均匀分散；
9.(2)向步骤(1)中缓慢滴加冰醋酸溶液至壳聚糖完全溶解，继续搅拌反应20～50min；冰醋酸的存在可促进壳聚糖在溶液中溶解；
10.(3)将步骤(2)得到的反应液在40～60℃静置烘干形成水凝胶膜；
11.(4)将烘干后的水凝胶膜在碱溶液中浸泡，然后以蒸馏水反复清洗后烘干；用碱溶液浸泡可中和水凝胶膜中的冰醋酸溶液，起到增塑的作用，能够提高膜的机械性能，经蒸馏水反复清洗可除去膜表面残留的碱溶液；
12.(5)将步骤(4)中的水凝胶膜裁剪后于蒸馏水中浸泡至达到溶胀平衡；在完全溶胀
情况下能够降低膜材料的传质阻力，加快步骤(6)中酶向膜材料内部的扩散，提高酶解效率。
13.(6)将步骤(5)中的水凝胶膜在预热后的单宁酶溶液中浸泡5～40min，然后再在乙醇中浸泡5-10min以终止酶反应。；
14.(7)取出步骤(6)中的水凝胶膜，用去离子水反复冲洗后烘干。
15.步骤(1)中，所述γ-聚谷氨酸和单宁酸质量比为0.5-5:1，优选为0.5-1.5:1，更优选为1:1；所述γ-聚谷氨酸和单宁酸总质量与壳聚糖质量的比值为1:3～6，优选1:3；所述聚谷氨酸、壳聚糖、单宁酸在碱溶液中的总浓度为10～30mg/ml。
16.步骤(1)中，所述碱溶液为ph为8-10的naoh溶液；所述γ-聚谷氨酸在碱溶液中的浓度为1-5mg/ml；所述加热搅拌的温度为40～60℃。
17.步骤(2)中，所述冰醋酸溶液的ph为2～4；冰醋酸的滴加速度为每1min滴加一滴；冰醋酸与步骤(1)中的碱溶液的体积之比为3-5:1。
18.步骤(4)中，所述碱溶液为0.05～0.5mol/l naoh溶液；浸泡时间为1.5～3.5h；以蒸馏水反复清洗至水凝胶膜的ph为7.0。
19.步骤(6)中，所述酶溶液为30-50u/ml单宁酶溶液，其预热温度为40～60℃。
20.步骤(6)中，所述水凝胶膜与酶溶液的质量体积比为1mg:2～10ml。
21.步骤(6)中，所述乙醇的体积分数为90～95％，水凝胶膜与乙醇的质量体积比为10-15mg:1ml
22.步骤(3)、(4)(7)中，所述烘干的温度为40～60℃。
23.本发明还提供了根据所述的制备方法制备得到的水凝胶复合膜，其具有良好的机械性能、吸保水性能、抗氧化性能及对带负电的药物的装载能力，并具有一定的抑菌能力。
24.本发明还提供了所述的水凝胶复合膜作为药物载体或伤口敷料的应用。
25.本发明提供的基于酶促反应调控的壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸水凝胶的制备方法中，首先以生物相容性优良、安全无毒可降解的壳聚糖、γ-聚谷氨酸、单宁酸为原料，单宁酸是一种天然的、植物衍生的多酚，含有丰富的邻苯三酚和邻苯二酚基团，可以与生物聚合物如胶原蛋白、壳聚糖、明胶和白蛋白通过非共价相互作用，其加入到膜反应体系之后，不仅不会破坏膜的结构，其成分中的酚羟基还会与γ-聚谷氨酸和壳聚糖的相关基团产生氢键作用，在一定程度上增强膜的性能。
26.本发明原料中的壳聚糖和γ-聚谷氨酸结构中含有大量羧基、羟基等亲水基团，具有较强的锁水能力，通过γ-聚谷氨酸的羧基、壳聚糖的氨基之间的静电及与单宁酸之间的氢键作用制备壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸水凝胶，其对带正电的药物有较好的装载能力；然后再将其经单宁酶酶解，经单宁酶酶解后，壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸水凝胶中的单宁酸会降解为没食子酸，没食子酸可与凝胶网络产生更多的氢键，使水凝胶网络重构，并在水凝胶的内部形成具有更好保水性的空腔，酶解后的复合膜不仅具有更优的机械性能，而且还具有优异的吸保水性能、抗氧化性、水蒸气透过率及对带负电的药物的装载能力，并具有一定的抑菌能力。
27.与现有技术相比，本发明具有如下优点：
28.(1)本发明首次提出以壳聚糖、γ-聚谷氨酸和单宁酸为水凝胶的主要成分，通过静电作用与氢键作用得到的水凝胶较壳聚糖/γ-聚谷氨酸水凝胶具有较好的机械性能以
聚谷氨酸/单宁酸 单宁酶(30min)对甲基橙的测试结果；
41.图9为比较例2中的壳聚糖/γ-聚谷氨酸(a)、比较例1中的壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸(b)和实施例2中的壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸 单宁酶(c)装载苯扎氯铵抑菌测试结果以及阳性对照(d)和阴性对照(e)；
42.图10为比较例2中的壳聚糖/γ-聚谷氨酸(s1)、比较例1中的壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸(s2)和装载苯扎氯铵后的壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸 单宁酶水凝胶(s3)细胞毒性测试结果。
具体实施方式
43.下面结合实施例对本发明进行详细说明。
44.实施例1
45.一种基于酶促反应调控的壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
46.(1)准确称取50mgγ-聚谷氨酸与50mg单宁酸于45℃，500rpm条件下完全溶解在15ml的ph为9的naoh溶液中，随后加入300mg壳聚糖搅拌5min使其均匀分散；
47.(2)缓慢滴加5ml ph 2.2的冰醋酸溶液5ml，滴加速度为每1min一滴，于45℃、500rpm条件下继续搅拌30min；
48.(3)将上述溶液缓慢倒入培养皿中，于40℃下静置烘干形成水凝胶膜；
49.(4)将干燥后的水凝胶放入15ml 0.1mol/l naoh溶液中浸泡2h，用蒸馏水反复清洗至ph为7，45℃烘箱中烘干；
50.(5)将再次烘干后的水凝胶裁剪成相同大小的方块，在50ml水中静置浸泡10min达到溶胀平衡；
51.(6)将配置好的单宁酶液预热到45℃，将上述裁剪好的水凝胶按照水凝胶与酶液质量体积比为1mg:4ml浸没在单宁酶液中，反应10min，随后再将水凝胶按照水凝胶与乙醇溶液的质量体积比为13mg:1ml的比例浸泡在95％的乙醇溶液中10min；
52.(7)取出水凝胶用去离子水洗去残留的乙醇，45℃烘干。
53.实施例2
54.一种基于酶促反应调控的壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸水凝胶的制备方法，其他同实施例1，只是酶反应时间为30min。
55.实施例3
56.一种基于酶解作用调控的壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸水凝胶的制备方法，其他同实施例1，只是酶反应时间为20min。
57.比较例1
58.一种壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
59.(1)准确称取50mgγ-聚谷氨酸与50mg单宁酸于45℃，500rpm条件下完全溶解在15ml的ph为9的naoh溶液中，随后加入300mg壳聚糖搅拌5min使其均匀分散；
60.(2)缓慢滴加5ml ph 2.2的冰醋酸溶液5ml，滴加速度为每1min一滴，于45℃、500rpm条件下继续搅拌30min；
61.(3)将上述溶液缓慢倒入培养皿中，于40℃下静置烘干形成水凝胶膜；
62.(4)将干燥后的水凝胶放入15ml 0.1mol/l naoh溶液中浸泡2h，用蒸馏水反复清洗至ph为7，45℃烘箱中烘干。
63.比较例2
64.一种壳聚糖/γ-聚谷氨酸的制备方法，包括以下步骤：
65.(1)准确称取100mgγ-聚谷氨酸于45℃，500rpm条件下完全溶解在15ml的ph为9的naoh溶液中，随后加入300mg壳聚糖搅拌5min使其均匀分散；
66.(2)缓慢滴加5ml ph 2.2的冰醋酸溶液5ml，滴加速度为每1min一滴，于45℃、500rpm条件下继续搅拌30min；
67.(3)将上述溶液缓慢倒入培养皿中，于40℃下静置烘干形成水凝胶膜；
68.(4)将干燥后的水凝胶放入15ml 0.1mol/l naoh溶液中浸泡2h，用蒸馏水反复清洗至ph为7，40℃烘箱中烘干。
69.测试例
70.测试上述实施例2、比较例1、比较例2所得到的水凝胶的结构表征断裂强力、断裂伸长率、弹性模量、吸保水性能、抗氧化性、载药能力，并对各实施例及比较例中的水凝胶进行苯扎氯铵的装载及测试其抑菌性能，结果如下所示。
71.1、电镜检测
72.应用电镜观察实施例2、比较例1、比较例2，结果如图1所示，壳聚糖/γ-聚谷氨酸水凝胶表面相对较平整，单宁酸的加入使得水凝胶膜结构变得更加紧密，明显地增强了水凝胶网络的交联密度，这可能是由于单宁酸较强的凝聚力产生明显的突起，进一步推断同浓度下的γ-聚谷氨酸大分子与壳聚糖的交联作用可能弱于单宁酸。使用单宁酶处理壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸水凝胶后，表面与切面都出现了明显的空腔，可能是因为单宁酶降解壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸水凝胶中的单宁酸，进而严重破化了水凝胶的网络结构。
73.2、红外检测
74.ft-ir检测壳聚糖/γ-聚谷氨酸、壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸和酶解30min的壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸，如图2所示。750-650cm-1
处为酚类物质的o-h面外弯曲振动，在1620-1450cm-1
的1555cm-1
处观察到的特定峰归因于苯环振动。单宁酸属于多酚类物，壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸水凝胶在此两处都出现了新峰，这说明单宁酸成功的加入到了凝胶网络体系中。3500-3300cm-1
处会出现吸收峰与氢键的形成有关，与壳聚糖/γ-聚谷氨酸水凝胶相比，加入单宁酸的峰向更低波长移动，这是由于单宁酸、γ-聚谷氨酸与壳聚糖之间形成了更多的分子间氢键。单宁酸中含有酚羟基，这大大增加了水凝胶网络中的羟基数量，使此处的峰变宽。而单宁酶处理后，残留的没食子酸与凝胶网络产生了更多的氢键，峰变得更宽。
75.3、力学性能检测
76.采用质构仪对实施例2、比较例1和比较例2得到的水凝胶膜进行单轴拉伸试验。将水凝胶膜样品裁剪成长50mm、宽5mm、厚1.5mm的条状。测量范围为5000cn，预紧力为10cn，夹具距离为25mm，拉伸速率为5mm/s。测定结果如图3所示。单宁酸的加入使得壳聚糖/γ-聚谷氨酸水凝胶的机械性能到提升，这与单宁酸提升交联密度相关，与电镜观察到的现象一致。单宁酸交联于壳聚糖/γ-聚谷氨酸网络中使水凝胶的均匀性得到提高，从而提升了其机械性能。说明单宁酸能够在水凝胶网络中提供更多的氢键交联点，使凝胶强度增加，而单宁酶
的酶解作用进一步提升了壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸水凝胶的机械性能。
77.比较实施例1、实施例2、实施例3，可见水凝胶失水后分子间距离降低会形成更多的交联点，对水凝胶机械强度略有影响。不同酶处理时间也对水凝胶的性能产生一定影响。酶处理10min后，处于水凝胶材料表面或内部未参与水凝胶网络架构形成的单宁酸被降解为小分子快速溶出，内部自由体积增大，但网络结构此时未被破环，因此，断裂伸长率略有提升。随着酶处理时间的继续延长，当酶处理时间为30min，参与水凝胶网络架构的单宁酸被分解，水凝胶网络开始坍塌，残留的没食子酸通过氢键作用使水凝胶网络重构，从而水凝胶弹性模量逐渐增大。
78.4、膜抗氧化性检测
79.将40mg实施例2、比较例1和比较例2得到的水凝胶样品研磨成粉末，加入1ml蒸馏水中。混合8h后，8000rpm离心10min，100μl上清液与100μl0.2mm dpph溶液以乙醇为溶剂混合均匀，置于96孔板上。在黑暗中放置30min后，用多功能微孔板分析仪在517nm处测定混合溶液吸光度值。由下式计算其ddph自由基清除率：
[0080][0081]
式中:a0、a1、a2分别为无样品dpph、有样品dpph、无样品dpph的od
517
nm值。
[0082]
结果如图4所示，壳聚糖/γ-聚谷氨酸水凝胶膜抗氧化性较弱，随着单宁酸的加入，掺入了壳聚糖/γ-聚谷氨酸的水凝胶的抗氧化性进一步得到提升。然而，单宁酶的作用使得单宁酸从壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸结构中溶出，导致壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸水凝胶的抗氧化性略有下降，但影响并不显著。
[0083]
5、吸保水性检测
[0084]
将样品切成大小为1cm
×
1cm的方块，在45℃下干燥至恒重(m0)，然后在蒸馏水中浸泡60min，悬空60s除表面的游离水，此时的重量为m
60
，将重量为m
60
的水凝胶放入装有过滤器的管中，以3500rpm离心3min，称取重量为md。
[0085][0086][0087]
结果如图5所示，当添加单宁酸时，与壳聚糖/γ-聚谷氨酸水凝胶相比，网络结构开始以壳聚糖为主体，聚电解质作用的减弱导致其结构能够容纳更多的水。酶解后的壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸小分子的溶出增加了水凝胶内部空间，因此较壳聚糖/γ-聚谷氨酸、壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸水凝胶吸水性明显增加。
[0088]
6、水蒸气透过率检测
[0089]
将实施例2、比较例1、比较例2水凝胶覆盖在盛有10ml蒸馏水介质玻璃瓶瓶口(ф＝29.5mm)，并用胶带固定，称重后，放置在40℃的烘箱中1天，再次称重。
[0090][0091]
其中，a为瓶的圆口面积，wi为加热前瓶的质量，w
t
为加热后瓶的重量。
[0092]
如图6所示，水蒸气透过率与水凝胶材料中的内部自由体积有关。水凝胶材料内部的自由空间越大，水分子越容易通过，水凝胶的水蒸气透过率就越大。壳聚糖/γ-聚谷氨酸
水凝胶与壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸水凝胶的水蒸气透过率相近，可能因为两者内部容水体积相近。而使用单宁酶使单宁酸水解，初期，网络中自由的单宁酸水解，内部自由体积增大，水蒸气透过率增大。
[0093]
7、亚甲基蓝、甲基橙装载检测
[0094]
使用亚甲基蓝和甲基橙作为正负电荷模型药物，以评估实施例1、实施例2、比较例1和比较例2所制得水凝胶的负载功能。
[0095]
用蒸馏水制备每种药物模型的储备溶液，终浓度为0.1mg/ml。在装载之前将储备溶液稀释为0.025mg/ml，将50mg水凝胶放置于4ml药物模型溶液中，在选定的装载时间点，将模型溶液收集在比色皿中，并通过紫外线分光光度计进行分析。
[0096][0097]
其中xx为装载模型药物；a
max，d
表示水凝胶样品孵育前模型药物溶液的最大吸光度，而a
max，t
表示在选定装载时间点水凝胶孵育后溶液上清液的最大吸光度。
[0098]
结果如图7、8所示，壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸水凝胶对亚甲基蓝装载效果可观，药物模型几乎达到完全装载，这是由于单宁酸中相邻的酚羟基能够以氧负离子的形式与带正电的药物结合，使药物能够稳定存在于水凝胶中。壳聚糖/γ-聚谷氨酸水凝胶对正电药物的装载量与装载时间都低于壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸水凝胶，证明单宁酸对正电药物的装载极为重要。而经过酶处理的壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸水凝胶，随着酶解时间的延长，单宁酸不断的溶出，装载效率与装载率都显著下降。
[0099]
壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸水凝胶在甲基橙溶液中，药物装载率较低，这是由于单宁酸中氧负离子与带负电的药物相互排斥，阻碍了药物的装载。壳聚糖/γ-聚谷氨酸水凝胶对负电药物的装载率高于壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸水凝胶，而经过酶处理10min和30min的壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸水凝胶随着单宁酸的降解，装载效率与装载率都显著上升，两者几乎都达到完全装载。
[0100]
可见，本发明以单宁酶酶解壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸水凝胶，能够有效实现对水凝胶膜结构、性能、及载药类型的调控。
[0101]
8、苯扎氯铵的装载及抑菌性能检测
[0102]
采用流式细胞仪检测实施例1、实施例2、比较例1和比较例2得到的水凝胶膜装载苯扎氯氨后的抑菌效果。首先将壳聚糖/γ-聚谷氨酸水凝胶、壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸水凝胶以及壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸 单宁酶水凝胶分别浸泡在0.008％苯扎氯铵溶液中12h进行苯扎氯铵的装载，随后使用4ml pbs(ph7.4)缓冲液浸提5h，离心取上清备用。将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌过夜培养至对数生长期，4000r/min离心10min收集菌体，pbs缓冲液反复重悬冲洗菌体2遍。使用不同样品的浸提液1ml重悬菌体，将加入1ml pbs重悬未做任何处理的菌体作为阴性对照，将加入1ml pbs并进行100℃沸水浴灭活的菌体作为阳性对照，混匀后置于37℃，150r/min的摇床中孵化45min，然后4000r/min离心10min收集菌体，并分别加入1ml pi染料进行避光染色30min。相同转速再离心10min收集菌体，使用pbs重悬后采用流式细胞仪分析死细胞数量。
[0103]
如图9所示，未装载苯扎氯铵的壳聚糖/γ-聚谷氨酸水凝胶，因为壳聚糖的抑菌作用，在一定程度上能够破坏金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的膜结构。当壳聚糖/γ-聚谷氨酸
与壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸装载苯扎氯铵之后，对两种菌细胞膜的破化程度显著提高，所有的菌体的细胞膜几乎都受到严重破坏。而壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸 单宁酶水凝胶，单宁酸被降解溶出导致苯扎氯铵的装载量下降，抑菌性能也明显下降，但是仍然具有一定的抑菌能力。
[0104]
9、细胞毒性测试
[0105]
对比较例1、比较例2所得水凝胶以及装载苯扎氯铵后的壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸水凝胶采用甲基噻唑四唑(mtt)法(sigma-aldrich)测定hek-293细胞活力。具体方法为将人胚胎肾细胞接种在96孔微孔板中，并将密度为1
×
104cells/ml的细胞培养基(100μl/孔)在水凝胶样品上生长24小时。每孔加入10μl mtt试剂和90μl不完全细胞培养基，使细胞在温度为37℃，co2为5％的培养箱中湿化气氛中生长4h，然后加入110μl福马赞。最后，使用bio-rad酶标仪对酶标板进行分析，测量每孔490nm处的吸光度值。细胞活力以实验组占对照组的百分比表示，所有实验设置三个平行。
[0106]
如图10所示，壳聚糖/γ-聚谷氨酸水凝胶具有良好的生物相容性。单宁酸被美国食品和药物管理局(fda)认定为一般安全(gras)。γ-聚谷氨酸、壳聚糖和单宁酸之间通过非共价交联形成的水凝胶，没有有毒物质的生成，因此壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸水凝胶生物相容性良好，并且装载bzcl的壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸 单宁酶水凝胶对细胞仍然没有毒副作用。
[0107]
上述参照实施例对一种基于酶促反应调控的壳聚糖/γ-聚谷氨酸/单宁酸水凝胶及其制备方法和应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。