一种解磷菌耦合异化铁还原菌体系及其在固定重金属中的应用

1.本发明涉及重金属污染修复技术领域，具体涉及的是一种解磷菌耦合异化铁还原菌体系及其在固定重金属中的应用。


背景技术：

2.镉(cadmium，cd)是一种生物蓄积性强、毒性持久的重金属。随着社会经济的快速发展，工业废弃物及污水的大量排放，其中所含的重金属镉会进入水体使其在沉积物中富集，导致沉积物中镉含量远高于水相。同时当外界环境条件发生变化时，沉积物中富集的镉会重新释放到水体中，进而引起二次污染。鄱阳湖入湖口沉积物中cd浓度为0.2～2.3mg/kg，湘江入洞庭湖口cd浓度达4.24～7.45mg/kg，已超过农用地土壤污染风险管制值(3mg/kg，6.5《ph≤7.5)，黄浦江干流表层沉积物中首要重金属污染物是cd，其浓度超过背景值2倍，大连湾60％监测站的沉积物中cd超标，太湖沉积物中镉浓度达2mg/kg。由此可见，沉积物镉污染已成为环境领域重点关注的问题，严重威胁人类健康。
3.目前对沉积物中镉污染的修复方法有化学固定、电动修复、生物修复等。其中，生物修复技术具有成本低和污染小等优点。异化铁还原菌在沉积物、地下水及深层土壤中分布广泛，从沉积物中分离的部分专性厌氧和大部分兼性厌氧微生物都具有铁还原能力，可以以胞外固态铁氧化物作为末端电子受体，通过胞外电子传递还原铁氧化物。异化铁还原菌可以通过微生物细胞的吸附作用固定镉，同时镉也可以通过次生铁氧化物的吸附作用及与磷酸盐矿物的共沉淀作用被固定。fe(ii)浓度、电子供体、电子受体等因素均可以影响异化铁还原次生成矿过程，磷酸盐也是影响异化铁还原诱导次生成矿的重要因素之一，它不但可以影响次生矿物的种类，还可以促进或抑制铁还原的反应速率，进而促进重金属镉的固定。解磷微生物可以促进土壤中难溶性磷得到释放，间接促进次生矿物的形成，避免了含磷物料的添加。因此，本发明试图寻找一种既可以供异化铁还原菌和解磷菌共存的生长体系，又可以利用体系诱导次生矿固定重金属的方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种解磷菌耦合异化铁还原菌体系及其在固定重金属中的应用。本发明的解磷菌耦合异化铁还原菌体系工艺简单，二次污染小，且对生态系统的影响较小，可有效降低底泥重金属的迁移以及对生态环境的潜在风险，并且可以为微生物联合修复底泥重金属污染提供理论支撑。
5.一种解磷菌耦合异化铁还原菌体系，包括解磷菌和异化铁还原菌；
6.所述解磷菌与异化铁还原菌的菌悬液的体积比为1:0.2～1:3。
7.具体的，所述解磷菌与异化铁还原菌的菌悬液的体积比可为1:1。
8.所述解磷菌的菌悬液可按常规方法制得，具体的，所述解磷菌的菌悬液的制备方法，包括如下步骤：用接种环从保存菌种的斜面上取一环解磷菌接种于牛肉膏蛋白胨培养
基中，于28℃震荡培养10～12h，得到od
600
值为0.8～1之间的菌悬液，备用。
9.所述牛肉膏蛋白胨培养基组成如下：牛肉膏3.0g/l，蛋白胨10.0g/l，nacl 5.0g/l，ph＝7.4～7.6；溶剂为水；
10.所述异化铁还原菌为具有镉抗性的金属还原地杆菌；
11.所述异化铁还原菌的菌悬液的制备方法，包括如下步骤：从保存菌种的厌氧小瓶中取菌悬液接种于柠檬酸铁培养基中，于28℃恒温培养0.5～6d，得到fe
2
值为5～35mm的菌悬液，备用。
12.所述柠檬酸铁培养基组成如下：nahco
3 2.5g/l，nh4cl 0.25g/l，kcl 0.1g/l，nah2po4·
h2o 0.6g/l，na2seo
4 3.78mg/l，柠檬酸铁13.7g/l，乙酸钠1.36g/l，维生素混合液10ml/l，矿物混合液10ml/l，ph＝6.5；制备方法包括：将原料混合，然后在混合气体中曝气1h，121℃灭菌30min；
13.所述矿物混合液的组成如下：氨三乙酸三钠1.5g/l，mgso4·
7h2o 3g/l，mnso4·
h2o 0.5g/l，nacl 1g/l，feso4·
7h2o 0.1g/l，cacl2·
2h2o 0.1g/l，cocl2·
6h2o 0.1g/l，zncl
2 0.13g/l，cuso4·
5h2o 0.01g/l，alk(so4)2·
12h2o 0.01g/l，h3bo
3 0.01g/l，na2moo4·
2h2o 0.025g/l，nicl2·
6h2o 0.024g/l，na2wo4·
2h2o 0.025g/l；
14.所述维生素混合液的组成如下：盐酸吡哆醇10mg/l，维生素b
12 0.1mg/l，生物素2mg/l，叶酸2mg/l，泛酸5mg/l，硫胺素5mg/l，核黄素5mg/l，烟酸5mg/l，对氨基苯甲酸5mg/l，硫辛酸5mg/l；
15.所述混合气体具体为氮气和二氧化碳体积比为8:2的混合气体。
16.上述的解磷菌耦合异化铁还原菌体系中，所述解磷菌耦合异化铁还原菌体系由解磷菌、异化铁还原菌和共存培养基组成。
17.上述的解磷菌耦合异化铁还原菌体系中，所述解磷菌选自非脱羧勒克菌、恶臭假单胞菌和苏云金芽孢杆菌中至少一种；
18.所述异化铁还原菌为金属还原地杆菌；
19.具体的，所述非脱羧勒克菌可为非脱羧勒克菌株(leclercia adecarboxylata)mrp-1，保藏编号为cgmcc no.14561；
20.所述恶臭假单胞菌可为恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)mrp-2，保藏编号为cgmcc no.15337；
21.所述苏云金芽孢杆菌可为苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringensis)mrp-3，保藏编号为cgmcc no.15338；
22.所述金属还原地杆菌可为金属还原地杆菌(geobacter metallireducens)gs-15，保藏编号为atcc 53774。
23.上述的解磷菌耦合异化铁还原菌体系中，所述解磷菌与异化铁还原菌的菌悬液的总体积占所述共存培养基体积的百分含量为2％～15％；具体可为5％或10％。
24.上述的解磷菌耦合异化铁还原菌体系中，所述解磷菌的菌悬液的od
600
值为0.8～1；具体可为0.8；
25.所述异化铁还原菌的菌悬液中可溶性fe
2
浓度为5～35mm；具体可为25mm。
26.上述的解磷菌耦合异化铁还原菌体系中，所述共存培养基包括碳源、磷源、铁源、无机盐、矿物混合液和维生素混合液；溶剂为水；
27.具体的，所述碳源为可被解磷菌利用的糖类化合物；具体可为葡萄糖；
28.所述磷源为难溶性磷酸盐；具体可为ca3(po4)2；
29.所述铁源为三价铁氧化物；具体可为水铁矿；
30.所述共存培养基中，所述碳源的浓度为1～15g/l，具体可为10g/l；所述磷源的浓度为3～10g/l，具体可为10g/l；所述铁源的浓度为5～50mmol/l，具体可为10mmol/l；所述矿物混合液的浓度为10ml/l；所述维生素混合液的浓度为10ml/l；
31.所述无机盐具体可为nahco3、nh4cl、kcl、nah2po4·
h2o和na2seo4。
32.所述无机盐在共存培养基中浓度如下：nahco
3 2.5g/l，nh4cl 0.25g/l，kcl 0.1g/l，nah2po4·
h2o 0.6g/l，na2seo
4 3.78mg/l。
33.所述矿物混合液由氨三乙酸三钠、mgso4·
7h2o、mnso4·
h2o、nacl、feso4·
7h2o、cacl2·
2h2o、cocl2·
6h2o、zncl2、cuso4·
5h2o、alk(so4)2·
12h2o、h3bo3、na2moo4·
2h2o、nicl2·
6h2o和na2wo4·
2h2o组成；
34.所述矿物混合液的组成如下：氨三乙酸三钠1.5g/l，mgso4·
7h2o 3g/l，mnso4·
h2o 0.5g/l，nacl 1g/l，feso4·
7h2o 0.1g/l，cacl2·
2h2o 0.1g/l，cocl2·
6h2o 0.1g/l，zncl
2 0.13g/l，cuso4·
5h2o 0.01g/l，alk(so4)2·
12h2o 0.01g/l，h3bo
3 0.01g/l，na2moo4·
2h2o 0.025g/l，nicl2·
6h2o 0.024g/l，na2wo4·
2h2o 0.025g/l；
35.所述维生素混合液由盐酸吡哆醇、维生素、生物素、叶酸、泛酸、硫胺素、核黄素、烟酸、对氨基苯甲酸和硫辛酸组成；
36.所述维生素混合液的组成如下：盐酸吡哆醇10mg/l，维生素b
12 0.1mg/l，生物素2mg/l，叶酸2mg/l，泛酸5mg/l，硫胺素5mg/l，核黄素5mg/l，烟酸5mg/l，对氨基苯甲酸5mg/l，硫辛酸5mg/l；
37.所述共存培养基的ph＝5～9；具体可为8～9或9。
38.所述水铁矿由包括如下步骤的方法制备得到：将1mol/l naoh连续滴加到80g/lfe(no3)3·
9h2o溶液中，搅拌30min，将ph调节至7，将悬浊液在5000rpm，4℃下冷冻离心15min，倒掉上清液，加超纯水摇匀洗涤后再离心，如此反复数次洗去其中no
3-；将制得的水铁矿冷冻干燥，使用玛瑙研钵研磨过100目尼龙筛。
39.上述共存培养基的制备方法，包括如下步骤：将所述组分溶于水中，调ph后进行曝气，灭菌即得。
40.所述曝气为混合气体曝气；具体的，所述混合气体为氮气和二氧化碳体积比为8:2的混合气体；
41.所述灭菌为121℃灭菌30min。
42.上述的解磷菌耦合异化铁还原菌体系在镉污染底泥修复中的应用也属于本发明的保护范围。
43.具体的，所述修复为钝化。
44.进一步的，本发明还提供了一种镉污染底泥的修复方法，包括如下步骤：将上述解磷菌耦合异化铁还原菌体系与镉污染的底泥在厌氧条件下混合，静置培养。
45.上述的修复方法中，混合后体系的镉初始浓度为0～0.5mm，但不为0；
46.所述静置培养的时间为30～150天；具体可为120天；
47.所述静置培养的温度为25～37℃；具体可为30℃。
48.本发明利用解磷菌耦合异化铁还原菌共同进行重金属的稳定化处理。解磷菌将难溶性磷转化为可溶性磷，同时将葡萄糖转化为乙酸，成为异化铁还原菌的电子供体。另外，异化铁还原菌可以将三价铁还原为二价铁，在磷酸盐的影响下，会改变次生矿物的种类，生成含磷的铁氧化物，从而促进镉的固定，形成更为稳定的含镉的次生矿物，解决了微生物修复利用范围小且重金属修复稳定性差的问题。
49.本发明与现有技术相比的优点在于：
50.(1)本发明所提供的解磷菌耦合异化铁还原菌体系制备方式简单、生产成本低、所得体系应用范围广、重金属固定效率高。
51.(2)本发明所使用的微生物适生范围广，可以有效地定殖于河道底泥中，解磷菌可以利用环境中难溶性磷，减少含磷材料的投加，异化铁还原菌又可以利用解磷菌代谢产生的乙酸进行铁还原反应，减少了有机碳源的投加，避免了二次污染，从而钝化重金属。
52.(3)两种微生物共生体系的构建，克服了单一微生物应用范围受限的问题，可以实现厌氧环境重金属污染的修复，具有良好的应用前景。
53.(4)微生物诱导的次生矿物可以更好的固定重金属，提高重金属的稳定性，减小了环境变化对重金属的影响。
附图说明
54.图1为解磷菌耦合异化铁还原菌体系中ph、磷、铁和乙酸含量的变化情况。
55.图2为次生矿物的xrd图谱。
56.图3为不同ph的解磷菌耦合异化铁还原菌体系对镉的固定效果。
57.图4为解磷菌耦合异化铁还原菌体系对不同初始镉浓度的固定效果。
具体实施方式
58.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
59.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
60.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
61.下述实施例中培养基的溶剂均为去离子水。
62.下述实施例中的非脱羧勒克菌株(leclercia adecarboxylata)mrp-1，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)的保藏编号为cgmcc no.14561，记载在中国专利申请cn107841472a中；
63.恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)mrp-2，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)的保藏编号为cgmcc no.15337，记载在中国专利申请cn108467844a中；
64.苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringensis)mrp-3，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)的保藏编号为cgmcc no.15338，记载在中国专利申请cn108587972a中；
65.下述实施例所用异化铁还原菌(dirb)为金属还原地杆菌(geobacter metallireducens)gs-15，为普通市售，来源为美国菌种保藏中心，保藏编号为atcc 53774。
0.5g/l，nacl 1g/l，feso4·
7h2o 0.1g/l，cacl2·
2h2o 0.1g/l，cocl2·
6h2o 0.1g/l，zncl
2 0.13g/l，cuso4·
5h2o 0.01g/l，alk(so4)2·
12h2o 0.01g/l，h3bo
3 0.01g/l，na2moo4·
2h2o 0.025g/l，nicl2·
6h2o 0.024g/l，na2wo4·
2h2o 0.025g/l；
79.水铁矿的制备如下：将1mol/l naoh连续滴加到80g/l fe(no3)3·
9h2o溶液中，置于磁力搅拌器上持续搅拌30min，将ph调节至7，将悬浊液在5000rpm，4℃下冷冻离心15min，倒掉上清液，加超纯水摇匀洗涤后再离心，如此反复数次洗去其中no
3-。将制得的水铁矿冷冻干燥，使用玛瑙研钵研磨过100目尼龙筛，备用；
80.(2)分别于第0、2、4、12、25、35天取样，采用钼锑钪比色法测定可溶性磷含量，邻菲啰啉法测可溶性二价铁含量，使用液相色谱测乙酸含量，以单独的异化铁还原菌和单独的解磷菌体系作为对照试验，每组3个平行，其中两种菌的投加量均为2.5ml最后破坏性取样，离心后取沉淀冷干，进行xrd表征，分析次生矿物成分。
81.测定培养液中可溶性磷含量：取2ml样品过0.22μm滤膜，然后取0.1ml至50ml具塞比色管中，加入二硝基酚2～3滴，并用100g/l碳酸钠和50ml/l硫酸溶液调节至黄色，加入5ml钼锑抗显色剂，上下颠倒摇匀，加水定容至50ml，静置30min，使用紫外可见分光光度计在700nm波长处测定吸光度，对照可溶性磷标准曲线计算出上清液中的可溶性磷含量。
82.测定培养液中可溶性铁含量：取2ml样品过0.22μm滤膜，然后取0.2ml至50ml具塞比色管中直接加入5ml缓冲溶液与2ml邻菲啰啉溶液，显色5～10min，在510nm处以水为参比测量吸光度，并作空白校正。
83.图1显示了解磷菌耦合异化铁还原菌体系中ph、磷、铁和乙酸含量的转化性能。由图1可知，解磷菌耦合异化铁还原菌体系产生的磷和二价铁含量相对于单独的解磷菌体系中的磷含量和异化铁还原菌体系的二价铁含量较低，说明解磷菌耦合异化铁还原菌体系中是有磷酸根和二价铁的生成，且部分发生反应，形成了难溶的次生矿物。由此可以得出，该体系可以诱导生成稳定的含磷的铁氧化物。图2显示了次生矿物的xrd图谱，可知次生矿物的主要成分为羟基磷灰石(hap)和fe3(po4)2(oh)3，fe3(po4)2(oh)3是蓝铁石的氧化产物。
84.实施例2、不同ph的解磷菌耦合异化铁还原菌体系对镉的固定效果
85.(1)将1.25ml的解磷菌(psb，非脱羧勒克菌株(leclercia adecarboxylata)mrp-1)的菌悬液和1.25ml的异化铁还原菌(dirb)的菌悬液接种于50ml解磷菌和异化铁还原菌共存培养基中，于30℃恒温培养120天。
86.解磷菌和异化铁还原菌共存培养基的配方与实施例1相同，此外还加入了cdcl20.2mm，共存培养基的初始ph为5、7或9。
87.(2)于第120天破坏性取样，样品离心后取上清液测游离态镉含量，向沉淀中加入10ml 0.5m盐酸，常温提取10h，离心取上清液测吸附态镉含量，进一步向沉淀中加10ml 6m盐酸提取1h，待沉淀物完全溶解，测结合态镉含量。所有镉浓度都是通过原子吸收分光光度法测定。
88.图3显示了不同ph的解磷菌耦合异化铁还原菌体系对镉的固定效果。由图3可知，结合态镉含量随着ph值的升高而增加，当初始ph值为9时，解磷菌耦合异化铁还原菌体系对镉的固定效果好，结合态镉含量可以占总镉含量的58％。由此可以得出，碱性环境条件下有利于解磷菌耦合异化铁还原菌体系对镉的固定。
89.实施例3、解磷菌耦合异化铁还原菌体系对不同初始镉浓度的固定效果
90.(1)将1.25ml的解磷菌(psb，非脱羧勒克菌株(leclercia adecarboxylata)mrp-1)的菌悬液和1.25ml的异化铁还原菌(dirb)的菌悬液接种于50ml解磷菌和异化铁还原菌共存培养基中，于30℃恒温培养120天。
91.解磷菌和异化铁还原菌共存培养基的配方与实施例1相同，此外还加入了不同浓度的cdcl2，分别为0.1mm、0.2mm和0.3mm。
92.(2)于第120天破坏性取样，样品离心后取上清液测游离态镉含量，向沉淀中加入10ml 0.5m盐酸，常温提取10h，离心取上清液测吸附态镉含量，进一步向沉淀中加10ml 6m盐酸提取1h，待沉淀物完全溶解，测结合态镉含量。所有镉浓度都是通过原子吸收分光光度法测定。
93.图4显示了解磷菌耦合异化铁还原菌体系对不同初始镉浓度的固定效果。由图4可知，结合态镉含量随着初始镉浓度的升高而减少，当初始镉浓度为0.3mm时，解磷菌耦合异化铁还原菌体系对镉的固定占总镉含量的56％，在初始镉浓度为0.1mm时，结合态镉含量占62％。由此可以得出，在确保微生物活性条件下，镉浓度越高越不利于该体系对镉的固定。