METTL3抑制剂在制备治疗肝癌药物中的应用

mettl3抑制剂在制备治疗肝癌药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及mettl3抑制剂在制备治疗肝癌药物中的应用。


背景技术：

2.原发性肝癌(primary liver cancer,plc)是世界上第六大最常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第三大常见原因。肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,hcc)是原发性肝癌的主要类型之一。至少一半的hcc病例在确诊时已经失去了手术或肝移植等治愈治疗手段的机会。进一步探索hcc的分子机制，研发潜在的靶点相关药物，对于改善肝癌的治疗方式有深远的意义。肝细胞肝癌的发病情况复杂，常常合并其它疾病，如肝硬化、病毒性肝炎等，因此其具体的发病机制尚未研究清楚，仍然是研究人员面临的挑战。
3.rna甲基化修饰是近年来新发现的一种重要的参与肿瘤发生发展的修饰方式。其中m6a甲基化是占比最高的一种修饰方式。目前已发现m6a影响肝癌的多种生物学行为。mettl3是m6a修饰的具体执行者之一，其主要作用是对靶目标的mrna序列的特定位点增加甲基化修饰。根据已有的文献报道，多数研究认为mettl3在hcc表达升高，发挥其m6a甲基转移酶功能后导致生存期的减少。mettl3被认为是促进肝癌发生发展的重要蛋白之一。目前已有多个研究发现，抑制mettl3能够部分缓解部分肿瘤的进展。但是现有技术中并未出现研究抑制mettl3进而治疗干细胞肝癌或者原发性肝癌的相关药物。


技术实现要素：

4.为克服以上技术缺陷，本发明采用了以下技术方案：
5.一种mettl3抑制剂在制备治疗肝癌药物中的应用；
6.进一步的，所述mettl3抑制剂为stm2457，其结构如式ⅰ所示，
[0007][0008]
进一步的，所述肝癌为原发性肝癌；更进一步的，所述肝癌为肝细胞肝癌。
[0009]
有益效果
[0010]
本发明通过分子水平实验以及动物水平实验，不仅证明了mettl3是治疗干细胞肝癌的有效靶点，而且分别在体外和体内实验中，均充分证明了mettl3抑制剂stm2457具有治疗肝癌的作用，可以用在制备治疗肝癌的药物中，具体可以用于治疗肝细胞肝癌，具有良好的技术效果。
附图说明
[0011]
为了更清楚地说明本发明的具体方案，下面将对具体实施方式或所需要使用的附图作简单地介绍。
[0012]
图1肝癌细胞中mettl3表达较癌旁组织上调图，其中，图1a表示通过公共数据库(gepia的肝癌数据库)分析mettl3在患者癌与癌旁之间的表达差异，在癌组织中表达较癌旁组织上调；图1b表示根据tcga肝癌数据中包含肝癌患者的生存期进行分析mettl3对肝癌患者生存期的影响；图1c表示在正常肝细胞系l02以及肝癌细胞系hepg2、hcclm3、huh7、plc、hep3b、bel-7402以及snu-449中检测mettl3的mrna相对表达含量；图1d表示mettl3在肝癌细胞系(hcclm3、huh7)中高表达，抑制后mettl3的核酸表达水平明显下降；图1e、图1f分别表示在肝细胞肝癌hcclm3和huh7两个细胞系中使用cck-8分别检测不同时间点对照组与稳定敲低mettl3组的细胞活力变化。
[0013]
图2：图2a、图2b分别表示cck-8检测不同浓度的stm2457对肝癌细胞系肝细胞肝癌hcclm3及huh7的生长抑制作用；图2c-图2f均表示裸鼠皮下成瘤实验，图2c为各组典型裸鼠图，图2d为荧光定量，图2e为裸鼠皮下瘤体积对比，图2f为各组裸鼠皮下瘤取出后进行免疫组化染色mettl3及ki-67。
[0014]
图3表示mettl3抑制剂stm2457有效抑制肝癌患者来源的类器官的生长，图3a为患者来源的类器官进行mettl3及dapi的免疫荧光染色图；图3b为患者来源的类器官进行ki-67及dapi的免疫荧光染色。
具体实施方式
[0015]
下面将对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本技术使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
[0016]
stm2457是一种mettl3抑制剂，其分子式为c
25h28
n6o2，分子量为444.53，cas登记号为2499663-01-1，其结构如式ⅰ所示，
[0017][0018]
已有研究报道stm2457具有抗白血病活性，但是现有技术中并未见到stm2457对肝癌具有抑制或治疗的作用。
[0019]
下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。以下实施例中，stm2457获得自美国glpbio公司，溶解于dmso，纯度≥98％。其余药品、试剂和仪器均为市售。
[0020]
实施例：stm2457抑制肝癌实验
[0021]“ns”表示没有显著性差异(not significant),*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001,****p《0.0001。
[0022]
1.细胞培养及处理
[0023]
原发性肝癌细胞株hcclm3和huh7由复旦大学附属中山医院肝癌研究所馈赠。将所获得的细胞株在dulbecco改良的eagle培养基(高糖dmem，由gibco，grand island，ny，usa生产)中培养。培养基的成分包括10％浓度的胎牛血清(fbs)和抗生素(含青霉素100u/ml以及链霉素0.1mg/ml)。细胞培养条件为5％co2和37℃，每三天更换一次培养基。stm2457购自美国glpbio technology公司。
[0024]
2.公共数据库分析
[0025]
使用gepia数据库分析了mettl3在tcga数据库中肝癌数据集(lihc)中的表达情况，以及在同样的队列中的生存期差异。实验结果如图1a、图1b所示，分别说明了在肝癌中mettl3高表达，且与生存期短相关，图1b中，mettl3 low表示mettl3低表达，mettl3 high表示mettl3高表达。
[0026]
3.实时荧光定量pcr(qpcr)实验
[0027]
使用rna纯化试剂盒(ezbioscience，usa)根据制造商的说明书，提取总rna。接着使用4
×
reverse transcription mastermix(快速逆转录试剂盒预混型，ezbioscience)进行逆转录。sybr green pcr试剂盒(来自yeasen，中国)用于qpcr实验。我们应用2-δδct
的计算方法，将每个基因的表达水平标准化为内参抗体actin的表达水平，作为内部对照。gmps和actin的序列(来自sunya，china)如下：
[0028][0029]
为了观察肝癌细胞系(hepg2、hcclm3、huh7、plc、hep3b、bel-7402和snu-449)的mettl3核酸表达水平，我们以肝细胞系(l02)作为对照组，进行qpcr实验。实验结果反映在图1c中，具体实验结果为，hepg2、hcclm3、huh7、bel-7402和snu-449这五种细胞株的mettl3表达量均高于l02。
[0030]
为了观察mettl3敲低(shmettl3)的效果，我们对hcclm3和huh7两种细胞株进行了干预。实验结果反映在图1d中，具体为mettl3在肝癌细胞系中相对高表达，生物学抑制mettl3后，mettl3的核酸表达水平受到明显抑制。
[0031]
4.cck-8实验
[0032]
为了检测mettl3-shrna对mettl3生物学抑制效果或stm2457对mettl3的药理学抑制效果，我们使用了cell counting kit(40203es60，翊圣，中国上海)进行细胞活力实验。为验证mettl3敲低效果对肝癌细胞系生长的效果，处理前先建立稳定敲低mettl3的细胞系，将处于对数生长期的细胞以6
×
103细胞/孔接种于96孔悬浮培养板中，培养24小时后按
照时间点进行分组，在特定的时间点将细胞重悬后以6
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103细胞/孔接种入对应的孔中，以相同的实验条件培养。在实验终点进行细胞活力检测。实验结果反映在图1e、1f中，具体实验结果为mettl3生物学抑制可有效抑制肝癌细胞的细胞活性。该实验证明，生物学抑制mettl3对于肿瘤生长或者活力是有影响的。
[0033]
我们再次从药理学角度证明mettl3的抑制对于肿瘤生长和细胞活力有影响。为了检测stm2457对肝癌细胞系的效果，将处于对数生长期的细胞以6
×
103细胞/孔接种于96孔悬浮培养板中，以不同浓度的溶液加入到对应的孔中，在24小时、48小时和72小时分别进行细胞活力检测。实验结果反映在图2a和2b中，具体实验结果为mettl3抑制剂stm2457可有效抑制肝癌细胞的细胞活性。
[0034]
5.裸鼠皮下瘤实验
[0035]
balb/c裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司。将裸鼠分为四组。
[0036]
第一组验证稳定敲低mettl3的对照组质粒的hcclm3细胞系在裸鼠皮下的生长情况。将5
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105细胞注射到balb/c裸鼠皮下，每三天观察测量；第二组验证稳定敲低mettl3的hcclm3细胞系在裸鼠皮下的生长情况。将5
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105细胞注射到balb/c裸鼠皮下，每三天观察测量；第三组为皮下植入带有荧光素酶标签的hcclm3肝癌细胞系，将5
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105细胞注射到balb/c裸鼠皮下，每三天使用pbs进行腹腔注射；第四组为皮下植入带有荧光素酶标签的hcclm3肝癌细胞系，将5
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105细胞注射到balb/c裸鼠皮下，每三天使用50mg/kg的stm2457进行腹腔注射。25天作为实验终点，荧光素酶成像观察肿瘤荧光强度，并处死小鼠。实验结果反映在图2c、2d和2e中，具体实验结果为相比较于第一组，第二组的荧光强度明显降低，说明mettl3生物学抑制(shmettl3)裸鼠皮下瘤的生长；第四组的荧光强度明显低于第三组，说明抑制剂stm2457能有效减少裸鼠皮下成瘤实验中肝癌移植瘤的体积。
[0037]
6.h&e染色和免疫组化实验
[0038]
将裸鼠皮下移植瘤样品在实验终点取下后存放于4％多聚甲醛20ml(sigma-aldrich，dk-2860，丹麦)中固定过夜，并在切割6μm切片之前嵌入石蜡中。抗原修复在100℃的柠檬酸盐缓冲液中进行25分钟。将0.1％吐温20和2.5％bsa(sigma-aldrich)混合到样品中。一抗如下：mettl3多克隆抗体(mettl3 polyclonal antibody，15073-1-ap,proteintech,英国)，稀释为1:100；ki67多克隆抗体(ki67 polyclonal antibody,27309-1-ap,proteintech,英国)，稀释为1:2000。应用适当的辣根过氧化物酶偶联二抗进行孵育(ab205718,abcam,英国)。实验结果反映在图2f中，具体实验结果为敲低mettl3可以有效抑制肝癌增殖标志物ki67。虽然stm2457不能直接抑制mettl3的表达，但是他可以用过抑制mettl3的活性进而抑制肝癌增值标志物ki67的表达。
[0039]
7.肝癌类器官(hepatocellular carcinoma patient-derived organoid,hcc pdo)及后处理
[0040]
肝癌类器官是根据前人的研究建立的，本研究采用了3个肝癌类器官。我们使用细胞实验浓度的mettl3抑制剂stm2457(终浓度：10μmol/l)加入pdo培养中位数4-5天。在福尔马林固定前每2-3天拍摄一次类器官照片。pdo用1％琼脂糖(111860，biowest)预包埋，用4％磷酸盐缓冲福尔马林固定，包埋在石蜡中，以4μm的标准进行切片，用标准程序进行苏木精-伊红和免疫荧光分析。使用的抗体如下：
[0041]
dapi#4083(cst，美国)，用量为1μg/ml；mettl3多克隆抗体(15073-1-ap,
proteintech,英国)，稀释至1:100；ki67多克隆抗体(27309-1-ap,proteintech,英国)，稀释至1:100。最后使用共聚焦显微镜(olympus)获得图像。实验结果反映在图3中，图3表示mettl3抑制剂stm2457有效抑制肝癌患者来源的类器官的生长，图3a为患者来源的类器官进行mettl3及dapi的免疫荧光染色图；图3b为患者来源的类器官进行ki-67及dapi的免疫荧光染色。结果显示，虽然mettl3的表达含量并没有被stm2457减少(图3a)，但是ki67的含量却明显被stm2457强烈抑制(图3b)。说明了敲低mettl3可以有效抑制肝癌增殖标志物ki67。虽然stm2457不能直接抑制mettl3的表达，但是过抑制mettl3的活性进而抑制肝癌增值标志物ki67的表达。总结而言，stm2457可以通过抑制mettl3有效抑制肝癌类器官的生长。
[0042]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。