分离元宝枫籽油中神经酸的方法与流程

1.本发明涉及分离神经酸的方法，特别地涉及分离元宝枫籽油中神经酸的方法。


背景技术：

2.神经酸是一种属于ω-9脂肪酸家族中的超长链脂肪酸。它在生物体中起多种作用。神经组织和人脑中尤其富含神经酸，一方面，神经酸是神经细胞里不可缺少的一部分，另一方面，作为脑白质的组成部分，神经酸有助于确保生物体中神经组织细胞的正常工作。此外，神经酸对心血管和人类自身免疫性疾病也有一定的作用。神经酸是人体难以自行合成的，需要从日常饮食中补充。
3.化学合成神经酸是一个可供选择的途径，但是不论用芥酸甲酯还是用油酸和辛二酸酯作为原料进行化学合成，神经酸的收率都不高，还会产生较多副产物，最终的效果都不尽理想。
4.随着植物油脂研究的不断深入，科学家们发现多种植物中都可以分离出神经酸，神经酸的来源逐渐转变为富含油脂及神经酸的植物或其种子。科学家在对我国植物进行研究时还发现了我国特有的富含神经酸的木本植物蒜头果树和元宝枫的种仁油，蒜头果是我国珍稀植物，数量小，分布地少，限制了大规模对蒜头果的开发利用。同时蒜头果中的蒜头果蛋白有毒性，提取神经酸时要注意除去含毒物质，增加了分离神经酸的工艺复杂度和难度。
5.元宝枫籽油是由元宝枫的翅果中提取得到。元宝枫分布广泛，大量的人工栽植使元宝枫数量繁多，所以目前元宝枫还是神经酸的主要来源。元宝枫籽油中含有丰富多样的各种成分，包括脂肪酸、蛋白质、维生素和矿物质等，它不仅可以作为一种安全优质的食用和保健用油，也有着不可忽视的药用价值。元宝枫籽油中不饱和脂肪酸占全部脂肪酸的比例约为92％，神经酸含量也在5.5％左右，元宝枫籽油作为神经酸的一个重要来源，从中分离提取神经酸的研究有着不可估量的价值。
6.目前神经酸的分离提纯方法有金属盐沉淀法、低温结晶法、尿素包合法、柱层析法、分子蒸馏法。低温结晶法又称溶剂分级分离法，根据低温下不同的脂肪酸或脂肪酸酯在有机溶剂中溶解度及凝固点不同进行分离纯化。一般来说，脂肪酸在有机溶剂中的溶解度随碳链的增长而减小，随双键数的增加而增加，且溶解度随温度降低表现更为显著。所以将混合脂肪酸溶解在低温状态下的有机溶剂，过滤除去未溶解的大量饱和脂肪酸和部分单不饱和脂肪酸，达到富集和纯化亚麻酸的目的。低温溶液结晶法工艺简单，操作方便，有效成分不易发生聚变、氧化及异构化等变性反应，因此，采用降温法分离混合脂肪酸较为常见，但是，元宝枫籽油脂肪酸组成复杂，一次结晶神经酸纯度提高非常有限。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明的主要目的是提供分离元宝枫籽油中神经酸的方法。
8.本发明所提供的分离元宝枫籽油中神经酸的方法，包括如下步骤：
9.(1)通过皂化反应对元宝枫籽油进行初步纯化，得到皂化反应物；
10.(2)向所述步骤(1)得到的皂化反应物中加入酸进行酸化，得到酸化脂肪酸钠；分离油相，水洗至中性，干燥后得到混合脂肪酸；
11.(3)向所述步骤(2)得到的混合脂肪酸中加入溶剂，转移到结晶器中进行结晶，收集结晶后的固体，即脂肪酸产品；
12.(4)将所述步骤(3)得到的脂肪酸产品溶解后，加入到装有硅胶的层析柱上，使用流动相进行洗脱，收集洗脱液，减压蒸馏，脱除溶剂，即得分离后的神经酸。
13.优选地，所述步骤(1)的皂化反应是：将质量比为1：4～1：6的元宝枫籽油与naoh乙醇水溶液混合，在温度60℃～62℃下皂化反应2h～3h；所述乙醇水为体积百分比为95％乙醇溶液；所述naoh乙醇水溶液中naoh的质量百分比浓度为3％～3.5％。
14.优选地，所述步骤(2)中所述皂化反应物中加入酸进行酸化是：将所述步骤(1)得到的皂化反应物在压力为-0.1mpa、温度为45℃条件下减压蒸馏除去乙醇，再加入3～4倍皂化反应物体积的质量百分比浓度为8％～12％h2so4水溶液酸化脂肪酸钠。
15.优选地，所述步骤(3)中所述溶剂的用量为所述混合脂肪酸与所述溶剂的质量比为1.5：1～2：1，所述溶剂为丙酮或乙醇。
16.优选地，所述转移到结晶器中进行结晶，是在结晶器中进行三次结晶；所述三次结晶包括：
17.(a)向所述步骤(2)得到的混合脂肪酸中加入丙酮，转移到结晶器中进行结晶，抽滤，收集滤液，完成一级结晶；
18.(b)将所述滤液再转入结晶器中进行二级结晶，抽滤，收集固体a；
19.(c)将收集的所述固体a转移到结晶器中进行三级结晶，结晶结束后抽滤，所得固体用丙酮洗涤，抽滤，收集固体b，除去残留的丙酮，即得脂肪酸产品。
20.更优选地，所述步骤(a)中，向所述步骤(2)得到的混合脂肪酸中加入1.5～2倍质量的乙醇或丙酮，转移到结晶器中，20min～30min内降至-10℃～-15℃并维持结晶时间2.5h～3h，用提前预冷-10℃的砂芯漏斗抽滤，收集滤液，完成一级结晶。
21.更优选地，所述步骤(b)中，将所述滤液再转入结晶器中进行二级结晶，40min～60min内降至-20℃结晶3h～4h，用提前预冷-20℃的砂芯漏斗抽滤，所得固体用适量丙酮冲洗，抽滤，收集固体a。
22.更优选地，所述步骤(c)中，将收集的所述固体a转移到结晶器中进行三级结晶，30min～40min内降至结晶温度控制在-10℃结晶2.5h～3.5h，结晶结束后用提前预冷-10℃的砂芯漏斗抽滤，所得固体用丙酮洗涤，抽滤，收集固体b，除去残留的丙酮，即得脂肪酸产品。
23.优选地，所述步骤(4)中，将所述步骤(3)得到的脂肪酸产品溶解到乙酸乙酯中，将其与层析柱内的硅胶的质量比为1：20～1：30，滴加入到装有硅胶的层析柱上，使用梯度流动相进行洗脱，流速为1.5ml/min～2ml/min；流动相为乙酸乙酯与石油醚的混合液，其中乙酸乙酯的体积百分比浓度为0％～4％。
24.优选地，所述步骤(4)中层析柱的高度为10cm～30cm；填料粒度为100-200目～300-400目。
25.本发明分离元宝枫籽油中神经酸的方法，利用以下关键因素实现高纯度神经酸的
分离：
26.(1)利用脂肪酸在溶剂丙酮中的溶解度差异，即饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸在丙酮溶剂中溶解度递增。
27.(2)利用脂肪酸碳链长度的差异，碳链越长，溶解度越低。
28.(3)低温条件下，温度越低不同脂肪酸在丙酮中的溶解度差异越明显，利用这一特性可对混合脂肪酸进行分级分离。
29.(4)碳链越长，脂肪酸极性越小；碳碳双键数目越多，脂肪酸极性越大。
30.丙酮是低温溶剂结晶操作中使用的溶剂，脂肪酸在丙酮中形成的晶体颗粒大，易分离。也可以选择乙醇作为溶剂，但是脂肪酸在乙醇中形成的晶体颗粒小，不易分离。
31.搅拌速率主要用于母液传热均匀，尽可能快的达到夹套介质的温度。
32.一、二、三级结晶的温度通过控制变量实验确定：
33.温度：依据不同脂肪酸在同一温度下的溶解度差异；
34.时间：结晶时间越长，晶体析出越完全，但是到达一定结晶时间之后，晶体析出的速率会大幅下降到基本为0。
35.柱层析法分离是利用硅胶对不同极性脂肪酸的吸附力不同，并且依据相似相溶原理洗脱剂对不同脂肪酸具有不同的解吸附力，最终将混合脂肪酸分离，进一步提高神经酸的含量。柱层析法分离对效果影响的因素有以下几点：
36.(1)层析柱高度，高度越高，产品中神经酸含量越高，但过高会影响产品中神经酸的收率，本发明的层析柱高度为10cm～30cm。
37.(2)填料粒度，粒度越小，产品中神经酸含量越高，但粒度过高会使分离过程困难，神经酸在层析柱中发生内扩散，导致产品中神经酸含量降低。本发明中填料粒度为100-200目～300-400目。
38.(3)流动相极性。流动相极性过大会使神经酸未被分离而被洗脱出来；极性过小则无法将神经酸洗脱出来。本发明的流动相为乙酸乙酯与石油醚的混合液，其中乙酸乙酯的体积百分比浓度为0％～4％。
39.本发明基于低温溶液分级溶液结晶和柱层析相结合的方法分离元宝枫籽油中神经酸。本发明的分离方法对神经酸等不饱和脂肪酸破坏小，成本低，分离的神经酸满足医药、保健品等行业的需求。
附图说明
40.为了说明而非限制的目的，现在将根据本发明的优选实施例、特别是参考附图来描述本发明，其中：
41.图1为结晶器示意图；1-结晶母液入口；2-冷却液入口；3-冷却液出口；4-夹层。
具体实施方式
42.本发明分离元宝枫籽油中神经酸主要包括以下步骤：
43.将元宝枫籽油与氢氧化钠的乙醇水溶液混合进行皂化反应，通过减压蒸馏除去乙醇后，经酸化、分液、水洗、干燥后得到神经酸含量5.0％左右的混合脂肪酸，再将混合脂肪酸加入一定稀释倍数的丙酮或乙醇中，进行三级分级结晶，将三级结晶纯化后的得到神经
酸含量为28％左右的脂肪酸进行硅胶柱层析，收集富含神经酸的层析液，通过减压蒸馏脱除溶剂，即得到较高含量60％左右的神经酸。
44.实施例1、分离元宝枫籽油中神经酸
45.(1)将质量比为1：4的元宝枫籽油与naoh乙醇水溶液(乙醇水为体积百分比为95％乙醇溶液)混合，naoh的质量百分比浓度为3％，在温度60℃下皂化反应2h，得到皂化反应物。
46.(2)将步骤(1)得到的皂化反应物在压力为-0.1mpa、温度为45℃条件下减压蒸馏除去乙醇，再加入3倍皂化反应物体积的质量百分比浓度为10％h2so4水溶液酸化脂肪酸钠，分离油相，水洗至中性，干燥后得到混合脂肪酸。干燥的方法为：先使用分液漏斗分离出油相，再使用无水硫酸钠除净油相内残留的水分。得到的混合脂肪酸中神经酸的质量百分比含量为6.56％。
47.(3)称量一定量混合脂肪酸，加入2倍质量的丙酮，转移到结晶器中，控制搅拌速率100rpm，30min内降至-10℃并维持结晶时间3h，用提前预冷(-10℃)的孔径为5um的砂芯漏斗抽滤，收集滤液，完成一级结晶。一级结晶的目的是分离硬脂酸、软脂酸等饱和脂肪酸。将滤液再转入结晶器中进行二级结晶，控制搅拌速率150rpm，60min内降至-20℃结晶3h，用提前预冷-20℃的砂芯漏斗抽滤，所得固体用适量丙酮冲洗，抽滤，收集固体a。该固体a中的神经酸含量17％左右。将收集到的固体a转移到烧瓶中，40℃真空度为-0.8mpa旋蒸除丙酮。将旋蒸后得到的脂肪酸按照一定质量比(脂肪酸：丙酮)配比1:10，混合均匀，转移到结晶器中进行三级结晶，30min内降至结晶温度控制在-10℃结晶3h，控制搅拌速率200rpm，结晶结束后用提前预冷-10℃的砂芯漏斗抽滤，所得固体用丙酮洗涤2次，抽滤，收集固体b。将固体b转移到烧瓶中，旋蒸除去残留的丙酮，温度为40℃，真空度为-0.8mpa，得到神经酸含量为26％的脂肪酸产品。
48.以上结晶器为定制普通结晶器，夹套通过控制结晶母液的低温介质，通过介质在夹套循环，控制结晶母液的温度。如图1所示，该结晶器包括结晶母液入口1、冷却液入口2、冷却液出口3、夹层4。结晶母液通过结晶器母液入口1进入结晶器内部，冷却液从结晶底端的冷却液入口2进入，从结晶器上方的冷却液出口3流出循环，结晶母液温度通过夹层4循环不同温度的冷却液，维持结晶母液恒温。
49.(4)将30g硅胶加入90g石油醚，搅拌排除气泡，静置2h，称取步骤(3)中得到的神经酸含量为26％的脂肪酸产品，溶解到乙酸乙酯中，将其与层析柱内的硅胶的质量比为1：20，滴加入到装有硅胶的层析柱上，层析柱高度30cm，填料粒度300-400目，使用梯度流动相进行洗脱，流速为2ml/min；流动相为乙酸乙酯与石油醚的混合液，其中乙酸乙酯的体积百分比浓度依次为0％、1％、2％、3％和4％，分别收集洗脱液，每个梯度分别收集一份，将乙酸乙酯梯度为1％的收集液在真空度为-0.05mpa～-0.1mpa，温度为40℃减压蒸馏20min，脱除石油醚和乙酸乙酯，即得含量60％的神经酸。
50.神经酸含量测定方法如下：
51.采用气相色谱-质谱联用技术(gc-ms)测定产品中神经酸的含量。首先，将游离脂肪酸甲基化，得到脂肪酸甲酯。将25mg混合脂肪酸转移至试管中，与1ml甲醇-硫酸溶液(v:v,95:5)混合，充入氮气，密封。将试管在置于90℃的水浴锅中恒温水浴60min，然后加入1.5ml正戊烷以终止甲酯化反应，并萃取反应得到的脂肪酸甲酯。脂肪酸甲酯用无水硫酸钠
干燥并在2500rpm条件下离心10min，收集上层油相用于gc-ms测试。
52.采用agilent公司cp7489气相色谱-质谱联用仪对脂肪酸甲酯的成分进行分析，色谱柱采用hp-88聚硅氧烷，载气使用超纯氮气，流速为3.0ml/min，分流比为30:1。注射器温度设定为260℃，探测器温度设定为280℃，初始柱温度设定为140℃，保持5分钟，然后以4℃/min的升温速度升高至215℃并在215℃维持30min。通过比较样品与标准品的保留时间和峰面积，确定样品中的神经酸的含量。
53.实施例2、分离元宝枫籽油中神经酸
54.(1)将质量比为1：5的元宝枫籽油与naoh乙醇水溶液(乙醇水为体积百分比为95％乙醇溶液)混合，naoh的质量百分比浓度为3.5％，在温度62℃下皂化反应2.5h，得到皂化反应物。
55.(2)将步骤(1)得到的皂化反应物在压力为-0.1mpa、温度为45℃条件下减压蒸馏除去乙醇，再加入3.5倍皂化反应物体积的质量百分比浓度为12％h2so4水溶液酸化脂肪酸钠，分离油相，水洗至中性，干燥后得到混合脂肪酸。干燥的方法为：先使用分液漏斗分离出油相，再使用无水硫酸钠除净油相内残留的水分。得到的混合脂肪酸中神经酸的质量百分比含量为6.56％。
56.(3)称量一定量混合脂肪酸，加入1.5倍质量的乙醇，转移到结晶器中，控制搅拌速率120rpm，30min内降至-12℃并维持结晶时间2.5h，用提前预冷(-10℃)的孔径为5um的砂芯漏斗抽滤，收集滤液，完成一级结晶。将滤液再转入结晶器中进行二级结晶，控制搅拌速率120rpm，45min内降至-20℃结晶3.5h，用提前预冷-20℃的砂芯漏斗抽滤，所得固体用适量丙酮冲洗，抽滤，收集固体a。将收集到的固体a转移到烧瓶中，35℃真空度为-0.8mpa旋蒸除丙酮。将旋蒸后得到的脂肪酸按照一定质量比(脂肪酸：丙酮)配比1:15，混合均匀，转移到结晶器中进行三级结晶，40min内降至结晶温度控制在-10℃结晶3.5h，控制搅拌速率150rpm，结晶结束后用提前预冷-10℃的砂芯漏斗抽滤，所得固体用的丙酮洗涤2次，抽滤，收集固体b。将固体b转移到烧瓶中，旋蒸除去残留的丙酮，温度为35℃，真空度为-0.8mpa，得到神经酸含量为28％的脂肪酸产品。
57.结晶器与实施例1中的结晶器相同。
58.(4)将30克硅胶加入100g石油醚，搅拌排除气泡，静置1.5h，称取步骤(3)中得到的神经酸含量为28％的脂肪酸产品，溶解到乙酸乙酯中，将其与层析柱内的硅胶的质量比为1：25，滴加入到装有硅胶的层析柱上，层析柱高度10cm，填料粒度100～200目，使用梯度流动相进行洗脱，流速为1.5ml/min；流动相为乙酸乙酯石油醚与的混合液，其中乙酸乙酯的体积百分比浓度依次为0％、1％、2％、3％和4％，分别收集洗脱液，每个梯度分别收集一份，将乙酸乙酯梯度为1％的收集液在在真空度为-0.05mpa～-0.1mpa，温度为40℃减压蒸馏30min，脱除石油醚和乙酸乙酯，即得含量58％的神经酸。
59.神经酸含量的测定方法与实施例1相同。
60.实施例3、分离元宝枫籽油中神经酸
61.(1)将质量比为1：6的元宝枫籽油与naoh乙醇水溶液(乙醇水为体积百分比为95％乙醇溶液)混合，naoh的质量百分比浓度为3％，在温度60℃下皂化反应3h，得到皂化反应物。
62.(2)将步骤(1)得到的皂化反应物在压力为-0.1mpa、温度为45℃条件下减压蒸馏
除去乙醇，再加入3倍皂化反应物体积的质量百分比浓度为8％h2so4水溶液酸化脂肪酸钠，分离油相，水洗至中性，干燥后得到混合脂肪酸。干燥的方法为：先使用分液漏斗分离出油相，再使用无水硫酸钠除净油相内残留的水分。得到的混合脂肪酸中神经酸的质量百分比含量为6.56％。
63.(3)称量一定量混合脂肪酸，加入2倍质量的丙酮，转移到结晶器中，控制搅拌速率100rpm，20min内降至-10℃并维持结晶时间3h，用提前预冷(-10℃)的孔径为5um的砂芯漏斗抽滤，收集滤液，完成一级结晶。将滤液再转入结晶器中进行二级结晶，控制搅拌速率150rpm，40min内降至-20℃结晶4h，用提前预冷-20℃的砂芯漏斗抽滤，所得固体用适量丙酮冲洗，抽滤，收集固体a。将收集到的固体a转移到烧瓶中，40℃真空度为-0.8mpa旋蒸除丙酮。将旋蒸后得到的脂肪酸按照一定质量比(脂肪酸：丙酮)配比1:8，混合均匀，转移到结晶器中进行三级结晶，30min内降至结晶温度控制在-10℃结晶2.5h，控制搅拌速率200rpm，结晶结束后用提前预冷-10℃的砂芯漏斗抽滤，所得固体用的丙酮洗涤2次，抽滤，收集固体b。将固体b转移到烧瓶中，旋蒸除去残留的丙酮，温度为40℃，真空度为-0.8mpa，得到神经酸含量为30％的脂肪酸产品。
64.结晶器与实施例1中的结晶器相同。
65.(4)将25克硅胶加入100g石油醚，搅拌排除气泡，静置1h，称取步骤(3)中得到的神经酸含量为30％的脂肪酸产品，溶解到乙酸乙酯中，将其与层析柱内的硅胶的质量比为1：30，滴加入到装有硅胶的层析柱上，层析柱高度25cm，填料粒度300-400目，使用梯度流动相进行洗脱，流速为2ml/min；流动相为乙酸乙酯与石油醚的混合液，其中乙酸乙酯的体积百分比浓度依次为0％、1％、2％、3％和4％，分别收集洗脱液，每个梯度分别收集一份，将乙酸乙酯梯度为1％的收集液在在真空度为-0.05mpa～-0.1mpa，温度为40℃减压蒸馏30min，脱除石油醚和乙酸乙酯，即得含量62％的神经酸。
66.神经酸含量的测定方法与实施例1相同。
67.实施例4、分离元宝枫籽油中神经酸
68.(1)将质量比为1：4.5的元宝枫籽油与naoh乙醇水溶液(乙醇水为体积百分比为95％乙醇溶液)混合，naoh的质量百分比浓度为3.5％，在温度62℃下皂化反应2.5h，得到皂化反应物。
69.(2)将步骤(1)得到的皂化反应物在压力为-0.1mpa、温度为45℃条件下减压蒸馏除去乙醇，再加入4倍皂化反应物体积的质量百分比浓度为10％h2so4水溶液酸化脂肪酸钠，分离油相，水洗至中性，干燥后得到混合脂肪酸。干燥的方法为：先使用分液漏斗分离出油相，再使用无水硫酸钠除净油相内残留的水分。得到的混合脂肪酸中神经酸的质量百分比含量为6.56％。
70.(3)称量一定量混合脂肪酸，加入1.5倍质量的丙酮，转移到结晶器中，控制搅拌速率120rpm，30min内降至-15℃并维持结晶时间3h，用提前预冷(-10℃)的孔径为5um的砂芯漏斗抽滤，收集滤液，完成一级结晶。将滤液再转入结晶器中进行二级结晶，控制搅拌速率150rpm，50min内降至-20℃结晶3.5h，用提前预冷-20℃的砂芯漏斗抽滤，所得固体用适量丙酮冲洗，抽滤，收集固体a。将收集到的固体a转移到烧瓶中，45℃真空度为-0.8mpa旋蒸除丙酮。将旋蒸后得到的脂肪酸按照一定质量比(脂肪酸：丙酮)配比1:10，混合均匀，转移到结晶器中进行三级结晶，40min内降至结晶温度控制在-10℃结晶3h，控制搅拌速率180rpm，
结晶结束后用提前预冷-10℃的砂芯漏斗抽滤，所得固体用的丙酮洗涤2次，抽滤，收集固体b。将固体b转移到烧瓶中，旋蒸除去残留的丙酮，温度为40℃，真空度为-0.8mpa，得到神经酸含量为29％的脂肪酸产品。
71.结晶器与实施例1中的结晶器相同。
72.(4)将20克硅胶加入100g石油醚，搅拌排除气泡，静置1h，称取结晶分离的神经酸，神经酸与层析柱内的硅胶的质量比为1：25，层析柱高度20cm，填料粒度300-400目，滴加入到装有硅胶的层析柱上，使用梯度流动相进行洗脱，流速为1.5ml/min；流动相为乙酸乙酯与石油醚的混合液，其中乙酸乙酯的体积百分比浓度依次为0％、1％、2％、3％和4％，分别收集洗脱液，每个梯度分别收集一份，将乙酸乙酯梯度为1％的收集液在在真空度为-0.05mpa～-0.1mpa，温度为40℃减压蒸馏30min，脱除石油醚和乙酸乙酯，即得含量60％的神经酸。
73.神经酸含量的测定方法与实施例1相同。
74.上述具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限制。本领域技术人员应该明白的是，取决于设计要求和其他因素，可以发生各种各样的修改、组合、子组合和替代。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明保护范围之内。