一种防治黄瓜炭疽病的乳酸菌制剂及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物技术领域，具体而言，涉及一种微生物菌剂，尤其涉及一种能够防治黄瓜炭疽病的复合乳酸菌制剂及其应用。


背景技术：

2.黄瓜的营养丰富，具有清香、爽口的特点。尤其适作生吃、凉拌、熟食、泡菜、盐渍、糖渍、酱渍、制干和制罐等，各种食法都别具风味，为果菜兼用的蔬菜，深受广大群众喜爱。同时黄瓜还具有减肥、美容等功效，全国各地普遍栽培，可以周年生产，全年供应，在整个蔬菜生产中占有非常重要的地位。
3.2020年，全球的黄瓜总生产面积是225万公顷，我国达到127万公顷，占全球的56.4％。然而，炭疽病是我国南北菜区普通发生的重要病害，以黄瓜发生较多，从苗期到收获期植株均可受害，尤以生长后期受害最严重。由于该病原菌侵染力强，且繁殖率高，故条件一旦适宜，就会造成病害的大面积流行，常造成植株中下部大量叶片干枯，果实产生病斑，降低品质或完全失去商品价值，使得黄瓜产量降低，严重时甚至绝收。
4.目前，保护地和露地黄瓜一年四季栽培，由于这种反季节性的栽培，导致菌源不断积累，使病原菌的侵染循环得以延续而不会被中断。这种病菌可以在土壤中形成拟菌核长期存活，也可以种传、在架材上腐生，只要温度适宜，它就可以重复侵染。黄瓜炭疽病作为黄瓜上的重要病害，目前主要以化学防治为主。然而过多使用农药，不但使病菌产生抗药性，而且高毒农药毒性大、残留高，在一定程度上影响生态平衡，同时损害人们的身体健康。因此，寻找高效无公害的防治方法越来越受到人们的关注。
5.乳酸菌是食品微生物大量利用的菌类，它们广泛分布于自然界中。大量研究表明，乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，控制内毒素，抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生，制造营养物质，刺激组织发育，从而对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和突然的应急反应等产生作用。众所周知，乳酸菌在食品中发挥实际作用的消息已经司空见惯。随着科学技术的不断发展，乳酸菌的应用越来越多。一些乳酸菌被用于干肉制品中，由于其自身的安全性而被推广使用，发挥了巨大的作用。
6.另外，有些乳酸菌可以产生抗菌物质，大多数的抗菌谱均比较窄。通过已被鉴定的乳酸菌产生的细菌素，把这些乳酸菌分为两类，一类是仅对相关的菌有抑制作用的窄抗菌谱的乳酸菌，第二类是具有广谱抗菌活性的乳酸菌，它们对致病菌，如肉毒梭菌、利斯特菌等有抑制作用。通过检索，目前尚没有采用乳酸菌及其代谢产物抑制炭疽病原菌或防治黄瓜炭疽病的文献报道。


技术实现要素：

7.鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种能够防治黄瓜炭疽病的复合乳酸菌制剂及其应用。
8.为了实现上述技术目的，本发明人结合多年对各类乳酸菌的研究经验，通过大量试验筛选并优化，最终获得了以植物乳杆菌p-8(lactobacillusplantarum p-8)和乳双歧杆菌v9(bifidobacterium lactis v9)组成的复合拮抗菌。将该复合菌液喷施于患有炭疽病的黄瓜病弱苗后，结果显示苗期死亡率大幅度降低。基于该研究成果，本发明提供了如下技术方案：一种防治黄瓜炭疽病的乳酸菌制剂，该乳酸菌制剂中的活性菌由植物乳杆菌p-8(lactobacillusplantarum p-8)和乳双歧杆菌v9(bifidobacterium lactis v9)组成。
9.需要说明的是，本发明所采用的植物乳杆菌p-8(lactobacillusplantarum p-8)，分离自内蒙古传统自然发酵酸牛奶中，具有优异的抗胃肠道消化液耐受能力，能够存活于动物肠道内；该菌株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2012年06月28日，菌种保藏号为cgmcc no.6312。本发明所采用的乳双歧杆菌v9(bifidobacterium lactis v9)于2005年从健康蒙古族儿童肠道中分离得到的耐酸和耐胆盐的益生菌，可抑制有害菌群、保护肠粘膜屏障、代谢产生有机酸，在ph 2.0-8.0的环境中具有很高的存活率。该菌分类名称为动物双歧杆菌乳亚种(bifidobacterium animalis subsp.lactis)，菌株已于2011年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为cgmcc no.5470。
10.进一步优选地，如上所述防治黄瓜炭疽病的乳酸菌制剂，该乳酸菌制剂中植物乳杆菌p-8和乳双歧杆菌v9的活菌数比为1：(3～8)。再进一步优选地，该乳酸菌制剂中植物乳杆菌p-8和乳双歧杆菌v9的活菌数比为1：(5～6)。在本发明的一个最优选的实施例中，该乳酸菌制剂中植物乳杆菌p-8和乳双歧杆菌v9的活菌数比为1：5。
11.另外需要说明的是，本发明人通过平板对峙法对众多种类的乳酸菌进行黄瓜炭疽病菌的拮抗菌筛选时意外发现，植物乳杆菌p-8、乳双歧杆菌v9对黄瓜炭疽病具菌有一定的拮抗作用，但是效果不显著；而将这两种菌的混合发酵液与黄瓜炭疽病菌进行平板对峙时，表现出了极为显著的拮抗作用。进一步的黄瓜炭疽病盆栽接种试验结果显示，植物乳杆菌p-8与乳双歧杆菌v9的复合菌液喷施于患有炭疽病的黄瓜病弱苗后，患病苗的死亡率大幅度降低。因此，本发明提供了上述复合乳酸菌制剂在防治黄瓜炭疽病中的应用。进一步优选地，在防治黄瓜炭疽病中的应用中，将所述乳酸菌制剂配制成菌液后喷施于黄瓜苗叶面，或/和将所述乳酸菌制剂配制成菌液后浇施于黄瓜苗根部。再进一步优选地，喷施时所述菌液的活菌浓度为2
×
106～8
×
106cfu/ml；浇施时所述菌液的活菌浓度为2
×
108～8
×
108cfu/ml。
12.与现有技术相比，本发明涉及的乳酸菌制剂由植物乳杆菌p-8(lactobacillus plantarum p-8)和乳双歧杆菌v9(bifidobacterium lactis v9)组成，这两种菌作为复合菌液喷施于患有炭疽病的黄瓜病弱苗后，患病苗的死亡率大幅度降低，因此可代替化学农药用来防治黄瓜炭疽病，从而更好的发挥出生防微生物的防病潜能，为最终种植并培育出对人体安全的优质绿色黄瓜食品打下基础，更好地满足消费者不断提高的消费水平。
附图说明
13.图1为黄瓜炭疽病盆栽接种试验结果；
具体实施方式
14.以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。另外，下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
15.实施例1：乳酸菌制剂的制备：
16.mrs液体培养基的制备：
17.所需材料：
[0018][0019]
液体mrs培养基的配制：1升蒸馏水中溶解下列组分：蛋白胨10克，牛肉膏10克，酵母提取物5克，磷酸氢二钾2克，柠檬酸氢二铵2克，乙酸钠5克，葡萄糖20克，吐温801毫升，硫酸镁0.58克，硫酸锰0.25克，琼脂粉1815克。调ph值6.2-6.6,高压灭菌(101kpa,121℃)15min。
[0020]
脱脂乳培养基配制：将脱脂乳粉按照11％比例复原为脱脂乳，自然ph，再经115℃灭菌20min制得。
[0021]
菌种的活化及发酵乳制备：
[0022]
1.材料：
[0023]
1)500ml mrs液体培养基；
[0024]
2)10个250ml的三角瓶，橡胶塞，牛皮纸，绳子；
[0025]
3)10个培养皿；
[0026]
4)1个接种环，酒精灯，打火机，酒精；
[0027]
(1)将所述植物乳杆菌p-8和乳双歧杆菌v9各3％～7％的接种量分别划线接种于mrs液体培养基中，在35
±
1℃条件下培养24～35小时，经离心洗涤后，在菌体沉淀上加入10％-12％灭菌脱脂牛乳液，并调整其菌数为1.9～2.3
×
10
10
cfu/ml，混匀后倾注培养；
[0028]
(2)将步骤(1)得到的菌株培养物分别接种于mrs培养液，在35
±
1℃条件下培养30～36小时，再分别接种10％～12％的灭菌脱脂牛乳液，在36
±
1℃条件下培养10～18小时，调整活菌数为2.8～3.4
×
10
10
cfu/ml，ph值为6.5～7.0。
[0029]
实施例2：平板对峙法测定乳酸菌对黄瓜炭疽病菌的抑菌实验
[0030]
选择直径为0.6cm的冲头，将pda平板上活化好的黄瓜炭疽病病菌打取成菌片。取出合格的黄瓜炭疽病菌片，转移到另一个pda平板的中心。用同样的方法将pda平板上活化好的各种乳酸菌打取成菌片，并分别对称接种在距炭疽病菌3cm处，空白对照(ck)只接黄瓜炭疽病菌，26℃的环境中进行培养。等空白对照组的病原菌长满平板时，测量各实验组中黄瓜炭疽病菌的平均菌落直径和各乳酸菌的平均抑菌带宽，以乳酸菌的平均抑菌率大小和平均抑菌带宽来衡量拮抗作用强弱。抑菌带宽为乳酸菌落和病原菌落边缘之间的距离。抑菌率＝[(ck病原菌落直径-实验组病原菌落直径)/ck病原菌落直径]
×
100％。
[0031]
本试验共采用6种乳酸菌，即副干酪乳杆菌probio-37(cgmcc no.18638)、乳双歧杆菌v9、格氏乳杆菌g098([1]蔺方瑞.屎肠球菌bz2所产抑菌物质的特性研究[d].内蒙古农业大学,2017.)、乳酸片球菌imau94388([1]王振东.乳酸片球菌imau94388的高密度培养研究[d].内蒙古农业大学,2020.)、植物乳杆菌p-8、鼠李糖乳杆菌r7970([1]刘继业.直投式乳酸菌发酵剂制备技术的研究及其应用[d].山东农业大学,2017.)，每组选用10个培养基平板对峙，最终获得黄瓜炭疽病菌落的平均直径，并计算出平均抗菌率。
[0032]
表1：不同菌株对黄瓜炭疽病菌的拮抗作用
[0033][0034][0035]
表1为不同菌株对黄瓜炭疽病菌的拮抗试验数据，从抑菌率可以看出，乳双歧杆菌v9和植物乳杆菌p-8对黄瓜炭疽病有明显的拮抗作用，抑制作用最强，效果最明显。从初始抑菌率的比较可以看出，抗菌率约为40％以上。从抑菌带宽可以看出，副干酪乳杆菌probio-37和格氏乳杆菌g098也有一定的拮抗作用，但作用不明显，分别为0.10cm、0.30cm，乳双歧杆菌v9和植物乳杆菌p-8具有明显的拮抗作用(抑菌带宽≥0.5cm)，分别为1.00cm、0.70cm。
[0036]
实施例3：拮抗乳酸菌的疾病预防试验
[0037]
(1)将黄瓜菜荚茎尖切成1厘米长的段，放入含5％升汞蒸馏水试管中浸泡30秒灭
菌。然后在超净工作台将黄瓜炭疽病菌丝体块用接种针接到灭菌菜荚上，封口放到培养架上，24℃恒温培养7小时后，倒入20-25ml无菌水，搅拌均匀。
[0038]
(2)用无菌水稀释乳酸菌(实施例1制备)制得悬浮液，放入震荡器摇匀打散，将细菌悬浮液中的菌落数控制在3
×
106/ml备用。在黄瓜幼苗长出新叶时，分别以制得的植物乳杆菌p-8、乳双歧杆菌v9乳酸菌悬浮液和无菌水进行干预处理。
[0039]
(3)本实施例设置空白对照组(无菌水)、植物乳杆菌p-8组、乳双歧杆菌v9组、复合菌a组(植物乳杆菌p-8：乳双歧杆菌v9＝1:1)、复合菌b组(植物乳杆菌p-8：乳双歧杆菌v9＝1:3)、复合菌c组(植物乳杆菌p-8：乳双歧杆菌v9＝1:5)、复合菌d组(植物乳杆菌p-8：乳双歧杆菌v9＝1:9)，每组选择50株试验苗，用塑料膜搭制成半径50公分的圆弧形拱棚，保证小棚内的温度在20-25℃之间，土壤相对湿度为85％～90％，空气相对湿度为70％～90％，晌午温度过高可掀起棚膜通风降温降湿。每天上午9时喷施处理1次，用电动小喷壶喷施，喷头调制喷雾状态，从距苗斜上45度角从上到下喷施，确保叶正反面都喷施上，每苗喷施5ml(复合菌a组喷施植物乳杆菌p-8和乳双歧杆菌v9各2.5ml，复合菌b组喷施植物乳杆菌p-8和乳双歧杆菌v9分别为1.25ml、3.75ml，复合菌c组喷施植物乳杆菌p-8和乳双歧杆菌v9分别为0.8ml、4.2ml，复合菌d组喷施植物乳杆菌p-8和乳双歧杆菌v9分别为0.5ml、4.5ml，)，喷施处理3天，每天1次，于第三日下午17时统计发病级别及病情指数。病情指数的计算公式＝∑各级发病数
×
相应级严重度/调查总数
×
100％
[0040]
表2：黄瓜幼苗发病级别评判标准
[0041]
发病级别严重度0级无病斑1级接种点有轻微小斑点，直径小于0.5cm2级病斑明显，直径0.5-1.0cm3级病斑直径1cm，占叶面积1/34级病斑面积占叶面积1/3-2/35级病斑面积占叶面积2/3以上
[0042]
表3：各组发病级别数及病情指数比较
[0043][0044][0045]
从表3各组发病级别数及病情指数比较试验数据看出，黄瓜炭疽病防治效果顺序由大到小是：复合菌c组＞复合菌b组＞乳双歧杆菌v9组＞复合菌a组＞植物乳杆菌p-8组＞复合菌d组＞空白对照组，可以得出结论，当植物乳杆菌p-8：乳双歧杆菌v9＝1:5比例时，对黄瓜炭疽病的防治效果最好。
[0046]
实施例4：黄瓜炭疽病盆栽接种试验
[0047]
本实施例设置空白对照组(无菌水)、植物乳杆菌p-8组、乳双歧杆菌v9组、复合菌a组(植物乳杆菌p-8：乳双歧杆菌v9＝1:1)、复合菌b组(植物乳杆菌p-8：乳双歧杆菌v9＝1:3)、复合菌c组(植物乳杆菌p-8：乳双歧杆菌v9＝1:5)、复合菌d组(植物乳杆菌p-8：乳双歧杆菌v9＝1:9)，每组随机选出350株炭疽试验苗。试验苗每盆间隔15公分，各组试验苗中间用高1.2米塑料膜隔开，防止喷施制剂时和农事操作交叉感染，保证棚内的温度在18-28℃之间，土壤相对湿度为70％～90％，空气相对湿度为60％～90％，晌午温度过高可掀起棚膜通风降温降湿。
[0048]
用无菌水稀释乳酸菌(实施例1制备)制得悬浮液，放入震荡器摇匀打散，将细菌悬浮液中的菌落数控制在3
×
106/ml备用。用量筒量取乳酸菌液浇施到盆中，直接根灌100倍稀释液，每苗浇施250ml(复合菌a组根灌植物乳杆菌p-8和乳双歧杆菌v9各125ml，复合菌b组根灌植物乳杆菌p-8和乳双歧杆菌v9分别为62.5ml、187.5ml，复合菌c组根灌植物乳杆菌p-8和乳双歧杆菌v9分别为40ml、210ml，复合菌d组根灌植物乳杆菌p-8和乳双歧杆菌v9分别为25ml、225ml)，每五天浇施一次，并在浇施同日下午16时统计其死苗率，试验周期为15
天，其中共浇施3次，统计3次死苗率。死苗率＝1-∑各级统计试验存活数/试验株数/统计次数
×
100％。
[0049]
表4：试验期间各组存活数及死苗率比较
[0050][0051][0052]
从表4各组数据可以看出，本发明所选用的两个菌株对黄瓜炭疽病均有一定的防治效果，死苗率从小到依次是复合菌c组＜复合菌b组＜复合菌a组＜乳双歧杆菌v9组＜复合菌d组＜植物乳杆菌p-8组＜空白对照组。其中复合菌c组效果最好(图1)，对黄瓜炭疽病的防治效果为90.67％，苗期死亡率为9.33％。乳双歧杆菌v9组对黄瓜炭疽病的防治效果为89.81％，幼苗死亡率为10.19％。复合菌b组对黄瓜炭疽病的防治效果为89.81％，苗期死亡率为10.19％。复合菌a组对黄瓜炭疽病的防治效果为89.71％，苗期死亡率为10.29％。复合菌d组对黄瓜炭疽病的防治效果为79.63％，苗期死亡率为21.33％。植物乳杆菌p-8组防治效果为77.33％，苗期死亡率为22.67％。无菌水组防治效果较差，防治效果为68％，苗期死亡率为32.00％。各处理的苗死亡率均与无菌水组存在显著差异。
[0053]
在现有的报道中，拮抗作用通常被概括为由蛋白质化合物或有机酸形成的有效物质。本发明人经过深入研究，在测定乳酸菌的抑制率时发现了对黄瓜炭疽菌的抑制作用，且抑制谱比较宽，说明乳酸菌对黄瓜炭疽病有一定的抗菌作用。这种抑制作用是通过发酵获得有机酸，从而更好地抑制真菌，抑制病原体和真菌的传播。从黄瓜叶片的动态研究可以看出，乳酸菌的代谢产物对黄瓜叶片有很好的控制作用。本发明的研究为有效控制黄瓜炭疽病提供了基础。