ILT7结合分子及其使用方法与流程

ilt7结合分子及其使用方法
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背景技术：

3.浆细胞样树突细胞(pdc)是外周血和继发性淋巴器官中一种特殊的树突细胞(dc)群，其仅占外周血单核细胞(pbmc)的约0.1至0.5％。然而，这些细胞是免疫系统极其重要的调节物，因为它们是i型干扰素(ifn)的主要来源。i型ifn促进nk细胞、b细胞、t细胞和髓样树突细胞的功能。ifn在初始免疫应当中十分重要，并且具有抗病毒和抗肿瘤活性。然而，pdc和i型ifn也还被认为在自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮、慢性风湿病和牛皮癣)的发展中起作用。因此，了解如何调节ifn释放中涉及的分子途径能够用于控制免疫应答并且治疗和预防疾病。
4.pdc响应由表达在pdc表面上的toll样受体(tlr)tlr7和tlr9所感知的核酸而释放ifn。tlr诱导的应答通过含有免疫受体酪氨酸激活基序(itam)的受体调节。免疫球蛋白样转录本-7(ilt7)是一个这样的受体，其也被称为lira4、lilra4或cd85g。
5.ilt7是免疫球蛋白样转录本(ilt)或白细胞免疫球蛋白样受体(lir)基因家族的一员。ilt7选择性地表达于人浆细胞样树突细胞(pdc)的表面，并且不在髓样树突细胞或其它外周血白细胞表达。cao等,j.exp.medicine 6:1399-1405(2006)。ilt7含有4个免疫球蛋白样胞外结构域以及跨膜结构域。胞外部分对于与ilt7配体，骨髓基质细胞抗原2(bst2)，的相互作用十分重要，而ilt7跨膜结构域含有允许其与fcεriγ复合的带正电的残基。已经提出了这样的假设，bst2-ilt7相互作用负调节pdc的天然免疫功能，潜在地作为负反馈机制。此外，ilt7的体外抗体交联已经被证明负调节pdc的tnf-α和ifn-α的产生。因此，需要能够用于中和ilt7并调节pdc活性和ifn释放的抗体和其它ilt7结合分子，例如，用于治疗和预防疾病，如自身免疫性疾病。
发明领域
6.本发明涉及ilt7结合分子，例如抗-ilt7抗体和抗原结合片段或其变体或衍生物，抗体和片段的使用方法，和治疗或预防与ilt7-表达细胞相关的自身免疫性疾病和病症的方法。


技术实现要素：

7.本文提供了ilt7结合分子，例如，抗-ilt7抗体和其抗原结合片段。
8.在一实例中，分离的ilt7结合蛋白是这样的ilt7结合蛋白，其可以与含有seq id no:202的重链可变区(vh)和seq id no:207的轻链可变区(vl)的抗体结合相同的ilt7表位。
9.在一实例中，分离的ilt7结合蛋白是这样的ilt7结合蛋白，其可以竞争性地抑制含有seq id no:202的vh和seq id no:207的vl的抗体与ilt7的结合。
10.在一实例中，分离的ilt7结合蛋白是这样的ilt7结合蛋白，其包括互补决定区(cdr)hcdr1、hdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，其分别含有序列seq id no:203、204、205、208、209和210。
11.在一实例中，ilt7结合蛋白包括与seq id no:202至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vh和/或与seq id no:207至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的vl。
12.在一实例中，ilt7结合蛋白包括含有seq id no:202的vh以及含有seq id no:207的vl。
13.在一实例中，分离的ilt7结合蛋白是包括含有seq id no:202的vh的ilt7结合蛋白。
14.在一实例中，分离的ilt7结合蛋白是包括含有seq id no:207的vh的ilt7结合蛋白。
15.在一实例中，分离的ilt7结合蛋白是这样的ilt7结合蛋白，其可以与包括vh和vl的抗体结合相同的ilt7表位，所述vh和vl分别选自：seq id no:12和seq id no:17，seq id no:22和seq id no:27；seq id no:32和seq id no:37；seq id no:42和seq id no:47；seq id no:52和seq id no:57；seq id no:62和seq id no:67；seq id no:72和seq id no:77；seq id no:82和seq id no:87；seq id no:92和seq id no:97；seq id no:102和seq id no:107；seq id no:112和seq id no:117；seq id no:122和seq id no:127；seq id no:132和seq id no:137；seq id no:142和seq id no:147；seq id no:152和seq id no:157；seq id no:162和seq id no:167；seq id no:172和seq id no:177；seq id no:182和seq id no:187；seq id no:192和seq id no:197；seq id no:212和seq id no:217；seq id no:222和seq id no:227；seq id no:232和seq id no:237；和seq id no:242和seq id no:247。
16.在一实例中，分离的ilt7结合蛋白是这样的ilt7结合蛋白，其竞争性地抑制包括vh和vl的抗体与ilt7的结合，所述vh和vl分别选自：seq id no:12和seq id no:17，seq id no:22和seq id no:27；seq id no:32和seq id no:37；seq id no:42和seq id no:47；seq id no:52和seq id no:57；seq id no:62和seq id no:67；seq id no:72和seq id no:77；seq id no:82和seq id no:87；seq id no:92和seq id no:97；seq id no:102和seq id no:107；seq id no:112和seq id no:117；seq id no:122和seq id no:127；seq id no:132和seq id no:137；seq id no:142和seq id no:147；seq id no:152和seq id no:157；seq id no:162和seq id no:167；seq id no:172和seq id no:177；seq id no:182和seq id no:187；seq id no:192和seq id no:197；seq id no:212和seq id no:217；seq id no:222和seq id no:227；seq id no:232和seq id no:237；和seq id no:242和seq id no:247。.
17.在一实例中，分离的ilt7结合蛋白是包括cdr:hcdr1、hdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3的ilt7结合蛋白，所述cdr分别选自：seq id no:13、14、15、18、19和20；seq id no:23、24、25、28、29和30；seq id no:33；34；35；38；39和40；seq id no:103、104、105、108、109
和110；seq id no:213、214、215、218、219和220；seq id no:223、224、225、228、229和230；seq id no:233、234、235、238、239和240；和seq id no:243、244、245、248、249和250。
18.在一实例中，ilt7结合蛋白包括vh和vl，其分别与下述序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同：seq id no:12和seq id no:17；seq id no:22和seq id no:27；seq id no:32和seq id no:37；seq id no:42和seq id no:47；seq id no:52和seq id no:57；seq id no:62和seq id no:67；seq id no:72和seq id no:77；seq id no:82和seq id no:87；seq id no:92和seq id no:97；seq id no:102和seq id no:107；seq id no:112和seq id no:117；seq id no:122和seq id no:127；seq id no:132和seq id no:137；seq id no:142和seq id no:147；seq id no:152和seq id no:157；seq id no:162和seq id no:167；seq id no:172和seq id no:177；seq id no:182和seq id no:187；seq id no:192和seq id no:197；seq id no:212和seq id no:217；seq id no:222和seq id no:227；seq id no:232和seq id no:237；或seq id no:242和seq id no:247。
19.在一实例中，vh和vl分别含有seq id no:12和seq id no:17；seq id no:22和seq id no:27；seq id no:32和seq id no:37；seq id no:42和seq id no:47；seq id no:52和seq id no:57；seq id no:62和seq id no:67；seq id no:72和seq id no:77；seq id no:82和seq id no:87；seq id no:92和seq id no:97；seq id no:102和seq id no:107；seq id no:112和seq id no:117；seq id no:122和seq id no:127；seq id no:132和seq id no:137；seq id no:142和seq id no:147；seq id no:152和seq id no:157；seq id no:162和seq id no:167；seq id no:172和seq id no:177；seq id no:182和seq id no:187；seq id no:192和seq id no:197；seq id no:212和seq id no:217；seq id no:222和seq id no:227；seq id no:232和seq id no:237；或seq id no:242和seq id no:247。
20.在一实例中，分离的ilt7结合蛋白包括vh，其含有seq id no:12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192、212、222、232或242。
21.在一实例中，分离的ilt7结合蛋白包括vl其含有seq id no:17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147、157、167、177、187、197、217、227、237或247。
22.在一实例中，ilt7结合蛋白包括抗体或其抗原结合片段。在一实例中，抗体或其抗原结合片段是非岩藻糖基化的。
23.在一实例中，ilt7结合蛋白结合ilt7的ig1区。在一实例中，ilt7结合蛋白结合ilt7的ig2区。
24.在一实例中，ilt7结合蛋白结合人和食蟹猴(cynomolgus)的ilt7。
25.在一实例中，ilt7结合蛋白抑制干扰素(ifn)α由外周血单核细胞(pbmc)的释放。在一实例中，ilt7结合蛋白具有针对pmbc中浆细胞样树突细胞(pdc)的adcc活性。
26.在一实例中，ilt7结合蛋白包括鼠、人、嵌合的、人源化或表面重塑(resurface)的抗体或其抗原结合片段。
27.在一实例中，ilt7结合蛋白包括抗体，fab，fab'，f(ab')2,fd，单链fv或scfv，二硫键连接的fv，v-nar结构域，ignar，胞内抗体，iggδch2，小抗体，f(ab')3，四抗体，三抗体、双特异性抗体，单个结构域抗体，dvd-ig，fcab，mab2，(scfv)2或scfv-fc。
28.在一实例中，ilt7结合蛋白包括单克隆抗体或其抗原结合片段。
29.在一实例中，ilt7结合蛋白包括选自下述的重链免疫球蛋白恒定区：(a)iga恒定
区；(b)igd恒定区；(c)ige恒定区；(d)igg1恒定区；(e)igg2恒定区；(f)igg3恒定区；(g)igg4恒定区；和(h)igm恒定区。
30.在一实例中，ilt7结合蛋白包括选自下述的轻链免疫球蛋白恒定区：(a)igκ恒定区；和(b)igλ恒定区。
31.在一实例中，ilt7结合蛋白包括人igg1恒定区和人λ恒定区。
32.在一实例中，本文所提供的是产生ilt7结合分子的宿主细胞。
33.在一实例中，本文所提供的是包括编码vh的核酸的分离的多核苷酸，其中vh包括与seq id no:202、12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192、212、222、232或242所示vh至少85％、90％、95％相同或与其相同的氨基酸序列。在一实例中，多核苷酸包括与seq id no:201、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、211、221、231或241至少85％、90％、95％相同或与其相同的序列。
34.在一实例中，本文提供的是包括编码vl的核酸的分离的多核苷酸，其中vl包括与207、17、27、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147、157、167、177、187、197、217、227、237或247所示vl至少85％、90％、95％相同或与其相同的氨基酸序列。在一实例中，多核苷酸包括与seq id no:206、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、216、226、236或246至少85％、90％、95％相同或与其相同的序列。
35.在一实例中，核酸可操作地连接控制序列。在一实例中，包括核酸编码的vh或vl的抗体或其抗原结合片段可以特异性地结合ilt7。
36.在一实例中，多核苷酸编码本文所提供的ilt7结合分子。
37.在一实例中，本文所提供的是包括多核苷酸的载体。
38.在一实例中，本文所提供的是由多核苷酸编码多肽。
39.在一实例中，本文所提供的是用本文所提供的多核苷酸(例如，包括编码vh的核酸的多核苷酸和包括编码vl的核酸的多核苷酸)转化的宿主细胞。
40.在一实例中，本文所提供的是包含本文所提供的多核苷酸(例如，包括编码vh的核酸的多核苷酸和包括编码vl的核酸的多核苷酸)，本文所提供的载体，或本文所提供的多肽的宿主细胞。在一实例中，宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。在一实例中，宿主细胞是ns0鼠骨髓瘤细胞、人细胞或中国仓鼠卵巢(cho)细胞。在一实例中，宿主细胞缺少α-1,6-岩藻糖基转移酶。
41.在一实例中，本文所提供的是产生抗-ilt7结合分子的方法，其包括培养本文所提供的宿主细胞并且收获所述结合分子。在一实例中，本文所提供的是通过该方法生成的抗-ilt7结合分子。
42.在一实例中，本文所提供的是用于检测样品中ilt7表达的方法，其包括(a)将样品与本文所提供的ilt7结合分子接触，和(b)检测样品中结合分子的结合。
43.在一实例中，本文所提供的是用于检测浆细胞样树突细胞的方法，其包括(a)将含有细胞的样品与本文所提供的ilt7结合分子接触，和(b)检测样品中结合分子的结合。
44.在一实例中，本文所提供的是药物组合物，其包括(a)本文所提供的ilt7结合分子，本文所提供的多核苷酸，本文所提供的载体，本文所提供的多肽，或本文所提供的宿主细胞，和(b)运载体。
45.在一实例中，本文所提供的是用于减少由浆细胞样树突细胞释放ifn-α的方法，其包括将浆细胞样树突细胞与本文所提供的ilt7结合分子，本文所提供的多核苷酸，本文所提供的载体，本文所提供的多肽，本文所提供的宿主细胞或本文所提供的药物组合物接触。
46.在一实例中，本文所提供的是用于治疗患有自身免疫性疾病的人对象的方法，其包括向对象给予有效量的本文所提供的ilt7结合分子，本文所提供的多核苷酸，本文所提供的载体，本文所提供的多肽，本文所提供的宿主细胞或本文所提供的药物组合物。
47.在一实例中，本文所提供的是用于在人对象中预防自身免疫性疾病的方法，其包括向对象给予有效量的本文所提供的ilt7结合分子，本文所提供的多核苷酸，本文所提供的载体，本文所提供的多肽，本文所提供的宿主细胞或本文所提供的药物组合物。在一实例中，自身免疫性疾病是系统性红斑狼疮。在一实例中，自身免疫性疾病是慢性风湿病。
48.附图简述
49.图1a和1b：显示sbi28(#28)、10d10和7c7抗体的可变重链(1a)和可变轻链(1b)序列比对。阴影指示cdr序列。方框表示引入10d10的突变以生成7c7。
50.图2：显示由流式细胞术确定的ilt7抗体和阴性对照抗体(r437)对表达人ilt7的ct-550细胞的结合。sbi33表示美国专利公开申请号2009/0280128中所提供的抗-ilt7抗体ilt7#33。
51.图3：显示由流式细胞术确定的ilt7抗体和阴性对照抗体(r437)对表达食蟹猴ilt7的ct-125细胞的结合。
52.图4：显示ilt7抗体和阴性对照抗体(r437)针对人ilt7-表达细胞的adcc效力。
53.图5：显示ilt7抗体和阴性对照抗体(r437)针对食蟹猴ilt7-表达细胞的adcc效力。
54.图6a和6b：显示ilt7抗体和阴性对照抗体(r437)对外周血单核细胞(pbmc)中浆细胞样树突细胞(pdc)的结合。
55.图7：显示由流式细胞术确定的非岩藻糖基化ilt7抗体和其亲本抗体对表达人ilt7(左图)和食蟹猴ilt7(右图)的ct-550细胞的结合。
56.图8：显示非岩藻糖基化ilt7抗体和其亲本抗体针对人(左图)和食蟹猴(右图)ilt7-表达细胞的adcc效力。
57.图9a和9b：显示7个ilt70080变体的可变重链区(9a)和可变轻链区(9b)序列比对。最接近的种系序列(ighv1-69*01和iglv3-21*01)也在比对中示出。
58.图10a和10b：显示9个ilt70083变体的可变重链区(10a)和可变轻链区(10b)序列比对。最接近的种系序列(ighv3-23*01和iglv1-51*01)也在比对中示出。
59.图11：显示ilt70080变体对表达人ilt7的细胞(ct-550；上图)和表达食蟹猴ilt7的细胞(ct-125；下图)的结合。
60.图12：显示ilt70083变体对表达人ilt7(上图)或食蟹猴ilt7(下图)的细胞的结合。
61.图13：显示ilt70080变体抗体针对人ilt7-表达细胞的adcc效力。
62.图14：显示ilt70083变体抗体针对人ilt7-表达细胞的adcc效力。
63.图15：显示非岩藻糖基化ilt70080.6和ilt70083抗体对人(左图)和食蟹猴(右图)ilt7-表达细胞的结合。
64.图16：显示非岩藻糖基化ilt70080.6和ilt70083抗体对人(左图)和食蟹猴(右图)ilt7-表达细胞的adcc活性。
65.图17：显示暴露于非岩藻糖基化ilt70080.6和ilt70083抗体的人pbmc的细胞毒性(左图)和ifn-α分泌(右图)。
66.图18：显示非岩藻糖基化ilt70137对表达人ilt7(左图)或食蟹猴ilt7(右图)的细胞的结合。圆圈表示非岩藻糖基化ilt70137，而三角形表示对照。
67.图19：显示非岩藻糖基化ilt70137对表达人ilt7(左图)或食蟹猴ilt7(右图)的细胞的adcc活性。三角形表示非岩藻糖基化ilt70137，而圆圈表示对照。
68.图20：显示非岩藻糖基化ilt70137的adcc活性，其通过测量对ifn-α生产的抑制作为抗体体外诱导外周血单核细胞(pbmc)的adcc能力的间接评估。
69.图21：显示了非岩藻糖基化ilt70137对人原代浆细胞样树突细胞(pdc)的结合。
70.图22：显示了用非岩藻糖基化7c7或非岩藻糖基化ilt70137处理的食蟹猴中pdc消耗。图下方的箭头指示抗体给予的时间点。
71.图23：显示了用非岩藻糖基化7c7或非岩藻糖基化ilt70137处理后的ifnα生产。图下方的箭头指示抗体给予的时间点。
72.发明详述
73.i.定义
74.需要注意，术语“一个”或“一种”实体指一种或多种该实体；例如，一种抗“抗-ilt7抗体”应理解为代表一种或多种抗-ilt7抗体。如此，本文所述术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。
75.本文所用的术语“多肽”意在包括单数形式“多肽”和复数形式“多肽”，指由酰胺键(也称肽键)线性连接的单体(氨基酸)所组成的分子。术语"多肽"指的是两个或更多个氨基酸的任何一条链或多条链，并且不表示特定长度的产物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或其它任何用于指两个或多个氨基酸的一条或多条链的术语均包含于“多肽”的定义内，术语“多肽”可与任意这些术语替代或互换使用。术语“多肽”还指多肽表达后修饰的产物，所述修饰包括但不限于糖基化、乙酰基化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团衍生化、蛋白酶切割或非天然产生氨基酸修饰。多肽可能由天然生物来源衍生或由重组技术产生，但不必定由指定核酸序列翻译而来。其可以任何方式产生，包括通过化学合成。
76.本发明多肽的大小可以是约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个或者2,000个或更多个氨基酸。多肽可具有确定的三维结构，但它们不必定具有这种结构。具有确定三维结构的多肽称为折叠多肽，不具有确定三维结构、但可采用大量不同构象的多肽称为非折叠多肽。本文所用的术语糖蛋白指偶联于至少一个糖部分的蛋白质，所述糖部分通过某一氨基酸残基如丝氨酸残基或天冬酰胺残基的含氧或含氮侧链连接于蛋白质。
[0077]“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物指不处于其天然环境中的多肽。没有规定的具体纯化水平。例如，可从其自然或天然环境中移出分离的多肽。就本发明目的而言，在宿主细胞中表达的重组产生多肽和蛋白质被认为是分离的，通过任何合适技术分离、分级、
或者部分或基本上纯化的天然或重组多肽也如此。
[0078]
本发明多肽也包括上述多肽的片段、衍生物、类似物或变体，及其任何组合。述及本发明的抗-ilt7抗体或抗体多肽时，术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括保持对应本发明抗体或抗体多肽至少一部分抗原结合特性的任何多肽。除本文他处讨论的具体抗体片段外，本发明多肽的片段还包括蛋白酶水解片段以及缺失片段。本发明的抗-ilt7抗体和抗体多肽包括上述片段，以及具有因氨基酸取代、缺失或插入而改变氨基酸序列的多肽。变体可以是天然产生或非天然产生的。可使用本领域已知的诱变技术生成非天然产生变体。变体多肽可包含保守或非保守性氨基酸取代、缺失或添加。多肽变体在本文中也可称作“多肽类似物”。本文所用抗-ilt7抗体或抗体多肽的“衍生物”指具有官能性侧链基团反应化学所衍生的一个或多个残基的对象多肽。“衍生物”还包括那些含有一个或多个20种标准氨基酸的天然产生氨基酸衍生物的肽。例如，4-羟基脯氨酸可取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可取代组氨酸；高丝氨酸可取代丝氨酸；且鸟氨酸可取代赖氨酸。本发明的抗-ilt7抗体和抗体多肽的衍生物可包括经改变以具有本发明参照抗体或抗体多肽上不存在的额外特征的多肽。
[0079]
术语“多核苷酸”意在包括单个核酸和多个核酸，指分离的核酸分子或构建物，例如信使rna(mrna)或质粒dna(pdna)。多核苷酸可包含常规磷酸二酯键或非常规键(如酰胺键，如肽核酸(pna)中发现的酰胺键)。术语“核酸”指多核苷酸中存在的任何一种或多种核酸区段，例如，dna或rna片段。“分离的”核酸或多核苷酸指从其天然环境中移出的核酸分子，dna或rna。例如，就本发明目的而言，包含在载体中的编码抗-ilt7结合分子如抗体或其抗原结合片段的重组多核苷酸被认为是分离的。经分离多核苷酸的其它例子包括保持于异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中的纯化(部分或基本上纯化的)多核苷酸。经分离的rna分子包括本发明中多核苷酸的体内或体外rna转录物。本发明中分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的此类分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可包括调节元件例如启动子、核糖体结合位点，或转录终止子。
[0080]
本文所用的术语“编码区”是由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸部分。虽然“终止密码子”(tag、tga或taa)不翻译成氨基酸，但它可被认为是编码区的一部分，而任何侧接序列如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等均不是编码区的一部分。本发明的两个或多个编码区可存在在单一多核苷酸构建物中，例如在单一载体上，或者在分开的多核苷酸构建物中，例如在单独(不同)载体上。此外，任何载体均能包含单一编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如，单一载体可分开编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码与抗-ilt7抗体或其片段、变体或衍生物的编码核酸融合或不融合的异源编码区。异源性的编码区包括不限于编码专有的元件或基序(例如分泌信号肽或异源性的功能结构域)。
[0081]
在某些实施方式中，所述多核苷酸或核酸是dna。对dna而言，包含编码多肽的核酸的多核苷酸正常情况下可包括启动子和/或其它转录或翻译控制元件，这些元件与一个或多个编码区操作性地连接。可操作连接指当基因产物如多肽的编码区与一个或多个调控序列以此方式连接时，将该基因产物的表达置于该调控序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导使编码所需基因产物的mrna转录，且如果两个dna片段间连接的属性不干扰表达调控序列指导基因产物表达或不干扰转录dna模板的能力，则两个dna片段(如多肽编码区
及其相连的启动子)“操作性连接”。因此，如果启动子能够影响核酸的转录，则启动子区域与多肽编码核酸操作性连接。启动子可以是仅在预定细胞中指导dna实质转录的细胞特异性启动子。启动子以外的其它转录控制元件如增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号，能与多核苷酸可操作连接以指导细胞特异性转录。本文公开了合适的启动子和其它转录控制区。
[0082]
多种转录控制区对于本领域技术人员而言是已知的。它们包括但不限于在脊椎动物细胞中发挥作用的转录控制区，例如但不限于，来自巨细胞病毒(立即早期启动子，与内含子-a联用)、猿病毒40(早期启动子)和逆转录病毒(如劳氏肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其它转录控制区包括源自脊椎动物基因的那些，例如肌动蛋白、热激蛋白、牛生长激素和兔β-球蛋白，以及能够控制真核细胞中的基因表达的其它序列。其它合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子诱导型启动子(例如，通过干扰素或白介素诱导的启动子)。
[0083]
类似地，本领域普通技术人员了解各种翻译控制元件。它们包括但不限于：核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子以及衍生自小核糖核酸病毒的元件(特别是内部核糖体进入位点或ires，也称为cite序列)。
[0084]
在其它实施方式中，本发明多核苷酸是rna，例如，采用信使rna(mrna)形式。
[0085]
本发明的多核苷酸和核酸编码区可与编码分泌或信号肽的其它编码区联合，所述分泌或信号肽指导本发明多核苷酸编码的多肽分泌。根据信号假说，哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦生长的蛋白质链向粗面内质网外的输出过程启动，所述序列从成熟蛋白质上切除。本领域普通技术人员了解，脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有融合于所述多肽n末端的信号肽，它们从完整或“全长”多肽上切割产生分泌或“成熟”形式的多肽。在某些实施方式中，使用天然信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或者使用仍然能够指导与其操作性相连多肽分泌的该序列的功能衍生物。或者，可采用异源性的哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可用小鼠β-葡萄糖醛酸酶或人组织纤溶酶原激活剂(tpa)的前导序列取代。
[0086]
广义来说，本发明的"结合分子"或"抗原结合分子"指特异性结合抗原决定簇的分子。在一实施方式中，结合分子特异性结合ilt7，例如全长ilt7或成熟ilt7。在另一个实施方式中，本发明的结合分子是抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方式中，本发明的结合分子包括参照抗体分子的至少一个重链或轻链cdr。在另一个实施方式中，本发明的结合分子包括来自一种或多种参照抗体分子的至少2个cdr。在另一个实施方式中，本发明的结合分子包括来自一种或多种参照抗体分子的至少3个cdr。在另一个实施方式中，本发明的结合分子包括来自一种或多种参照抗体分子的至少4个cdr。在另一个实施方式中，本发明的结合分子包括来自一种或多种参照抗体分子的至少5个cdr。在另一个实施方式中，本发明的结合分子包括来自一种或多种参照抗体分子的至少6个cdr。在某些实施方式中，参照抗体分子是7c7、ilt70080、ilt70080.1-ilt70080.7、ilt70083、ilt70083.1-ilt70083.9、ilt70089、ilt70100、ilt70137、ilt70142、ilt70144或ilt70052。
[0087]
本发明针对某些抗-ilt7抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。术语“抗体”表示免疫球蛋白分子，其识别并通过免疫球蛋白分子可变区内至少一个抗原识别位点特异性结合靶标如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述的组合。本文所用术语“抗
体”涵盖完整的多克隆抗体，完整的单克隆抗体，嵌合抗体，人源化抗体，人抗体，包括抗体的融合蛋白，以及任何其它经修饰的免疫球蛋白分子，只要抗体具有所需的生物活性。抗体可以是五类主要免疫球蛋白中的任何一类：iga、igd、ige、igg和igm，或其亚类(同种型)(例如，iggl、igg2、igg3、igg4、igal和iga2)，基于对其重链恒定结构域(分别称为α、δ、ε、γ和μ)的鉴定。不同类别的免疫球蛋白具有不同的且熟知的亚基结构和三维构型。抗体可以是裸抗体，或与其它分子(例如毒素、放射性同位素等)偶联。
[0088]
术语“抗体片段”或“其抗体片段”指完整抗体的一部分。“抗体结合片段”或“其抗体结合片段”指结合抗原的完整抗体的部分。抗原结合片段可以包含完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的示例包括但不限于fab、fab'、f(ab')2和fv片段，线性抗体，scfv，单链抗体。
[0089]
本文所用的“人”或“全人”抗体包括具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，包括分离自人免疫球蛋白文库或不表达内源性免疫球蛋白的一种或多种人免疫球蛋白转基因动物的抗体，如下文所述，例如，kucherlapati等的美国专利号5,939,598。人患者治疗应用中特别需要完全人抗体。
[0090]
可通过本领域已知的各种方法制备人抗体，这些方法包括上述噬菌体展示法，利用人免疫球蛋白序列衍生的抗体文库，如vaughan等,nat.biotech.14:309-314(1996)，sheets等,proc.nat’l.acad.sci.95:6157-6162(1998)，hoogenboom和winter,j.mol.biol.227:381(1992)，和marks等,j.mol.biol.222:581(1991))所述。可用于制备并使用抗体的噬菌体展示方法的其他示例包括公开于下述的方法：rothe等,j.mol.biol.,376:1182(2008)，brinkman等,j.immunol.methods 182:41-50(1995)；ames等,j.immunol.methods 184:177-186(1995)；kettleborough等,eur.j.immunol.24:952-958(1994)；persic等,gene 187:9-18(1997)；burton等,advances in immunology 57:191-280(1994)；pct申请号pct/gb91/01134；pct公开wo 90/02809；wo 91/10737；wo 92/01047；wo 92/18619；wo 93/11236；wo 95/15982；wo 95/20401；和美国专利号6,172,197；5,885,793，6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915；6,593,081；6,300,064；6,653,068；6,706,484；7,264,963；5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108；上述文献各自通过引用全文纳入本文。
[0091]
此外，如本领域技术人员已知，也可用不能表达功能性内源免疫球蛋白、但可表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠产生人抗体。这种产生人抗体的技术概述参见lonberg和huszar(1995，int.rev.immunol.13:65-93)。
[0092]
抗体工程改造领域中可用的其它技术能分离人抗体或其片段。例如，可如kontermann和sefan.《抗体工程，斯普林格实验室手册》(antibody engineering,springer laboratory manuals)(2001)所述制备人杂交瘤。全人抗体可采用多种技术生成，例如，噬菌体展示或其它病毒展示系统。在噬菌体展示法中，功能性抗体结构域展示在携带其编码多核苷酸序列的噬菌体颗粒表面上。例如，由动物cdna文库(如人或鼠淋巴组织的cdna文库)扩增编码vh和vl区的dna序列。在某些实施方式中，通过pcr将编码vh和vl结构域的dna与scfv接头接合，并克隆到噬菌粒载体(如p cantab 6或pcomb 3 hss)中。将该载体电穿孔到大肠杆菌中，用辅助噬菌体感染该大肠杆菌。用于这些方法的噬菌体一般是丝状噬菌体，
包括fd和m13，通常将vh或vl区重组融合于噬菌体基因iii或基因viii。表达能结合感兴趣抗原(即，ilt7)的抗原结合域的噬菌体可以用抗原选择或鉴定，如利用带标记抗原或者在固体表面或珠粒上结合或捕获的抗原。
[0093]“人”或“全人”抗体也包括至少含重链可变区或至少重链和轻链可变区的抗体，其中所述可变区具有人免疫球蛋白可变区的氨基酸序列。
[0094]“人”或“全人”抗体还包括如上所述包含本文所述抗体分子(如vh区和/或vl区)的变体(包括衍生物)或基本由其组成或由其组成的“人”或“全人”抗体，所述抗体或抗原接合片段或其变体或衍生物免疫学特异性结合于ilt7多肽或其片段或变体。可利用本领域技术人员已知的标准技术在编码人抗-ilt7抗体的核苷酸序列中引入突变，包括但不限于，引起氨基酸取代的定点诱变和pcr介导的诱变。相对于参照vh区、vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3、vl区、vlcdr1、vlcdr2或vlcdr3，该变体(包括衍生物)可以编码少于50个氨基酸取代、少于40个氨基酸取代、少于30个氨基酸取代、少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于15个氨基酸取代、少于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个氨基酸取代、少于3个氨基酸取代或少于2个氨基酸取代。
[0095]
在某些实施方式中，氨基酸取代是保守性氨基酸取代，如下所详述。或者，也可沿所有或一部分编码序列随机引入突变，例如通过饱和诱变引入，可筛选所得突变体的生物学活性以鉴定保持活性(例如，结合如人、灵长动物、鼠的ilt7多肽的能力，，或结合人、灵长动物、鼠ilt7的任意组合的能力)的突变体。“人”或“全人”抗体的这类变体(或其衍生物)也可称为“优化”或“就抗原结合优化”的人或全人抗体，包括对抗原亲和性提高的抗体。
[0096]
脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构是相对较好地了解的。参见例如，harlow等(1988)antibodies:a laboratory manual(《抗体：实验室手册》)(第2版；冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press))。
[0097]
正如下文中更详细讨论，术语“免疫球蛋白”包括可通过生化性质区分的各种类型多肽。本领域技术人员应理解，重链分为伽马、缪、阿尔法、德尔塔或伊普西龙(γ、μ、α、δ、ε)，其中还有一些亚类(如γ1-γ4)。该链的特性决定抗体“类别”分别为igg、igm、iga、igg或ige。免疫球蛋白亚类(同种型)如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1等已被良好表征，且已知赋予功能特化。根据本文公开内容，本领域技术人员不难区分这些类别和同种型的修饰形式，因此，它们涵盖在本发明范围内。尽管下述讨论将通常针对igg类的免疫球蛋白分子，但所有免疫球蛋白类别明显属于本发明范围。在igg中，标准的免疫球蛋白分子包括分子量约为23,000道尔顿的两条相同轻链多肽和分子量为53,000-70,000的两条相同重链多肽。这四条链通常在“y”构型中由二硫键连接起来，其中轻链从y的口部开始托起重链，并延续通过可变区。
[0098]
轻链分类为κ或λ(卡帕或兰布达)。各重链类别可与κ或λ轻链结合。通常，轻链和重链互相共价结合，并且当由杂交瘤、b细胞或遗传工程改造的宿主细胞生成免疫球蛋白时，两条重链的“尾”部分通过共价二硫键或非共价连接结合在一起。在重链中，氨基酸从y构型的分叉末端处的n-端到各条链的底部处的c-端。
[0099]
抗体“y”的基部被称为fc(可结晶片段)区并由两个重链组成，两个重链取决于抗体的类型具有两个或三个恒定区。因此，fc区结合fc受体的特异性类别，和其它免疫分子，如补体蛋白。轻链和重链都被划分成具有结构和功能同源性的区域。从功能角度使用术语
[0104][0105][0106]1表1中所有cdr定义的编号均按照kabat等所述的编号规则(见下文)。
[0107]
kabat等还定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员能明确地将所述“kabat编号”系统应用于任何可变区序列，而不依赖序列本身外的任何实验数据。本文所用的“kabat编号”指kabat等(1983)美国卫生与公众服务部，“sequences of proteins of immunological interest(免疫学上感兴趣的蛋白质序列)”中所述的编号系统。
[0108]
本发明的抗体或抗原结合片段、变体、或其衍生物包括但不限于：多克隆、单克隆、鼠、人、人源化、灵长类化或嵌合抗体，单链抗体，表位结合片段如fab、fab'和f(ab')2、fd、fv、单链fv(scfv)、二硫键连接的fv(sdfv)、包含vl或vh结构域的片段、fab表达文库产生的片段和抗独特型(抗-id)抗体(包括例如，本文所述抗-ilt7抗体的抗-id抗体)。scfv分子为本领域已知，描述于例如美国专利号5,892,019。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以是任何类型(如igg、ige、igm、igd、iga和igy)、类(如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2等)或亚类的免疫球蛋白分子。
[0109]
本文所用的术语“重链部分”包括衍生自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链部分的多肽包括以下至少一个：ch1结构域、铰链(例如，上、中、和/或下铰链区)结构域、ch2结构域、ch3结构域或其变体或片段。例如，本发明所用的结合多肽可包括含有ch1结构域的多肽链；含有ch1结构域、至少一部分绞链区和ch2结构域的多肽链；含有ch1结构域和ch3结构域的多肽链；含有ch1结构域、至少一部分绞链区和ch3结构域的多肽链，或者含有ch1结构域、至少一部分绞链区、ch2结构域和ch3结构域的多肽链。在另一实施方式中，本发明的多肽包括含有ch3结构域的多肽链。另外，本发明所用的结合多肽可能缺少ch2结构域的至少一部分(例如，所有或部分ch2结构域)。如上所述，本领域普通技术人员应理解，可修饰这些结构域(例如重链部分)，从而其氨基酸序列不同于天然产生的免疫球蛋白分子。
[0110]
在本文公开的某些抗-ilt7抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物中，多聚体的一条多肽链的重链部分与该多聚体的第二条多肽链相同。或者，本发明的含有重链部分的单体是不同的。
[0111]
用于本文所述诊断和治疗方法的结合分子的重链部分可衍生自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可包含衍生自igg1分子的ch1结构域和衍生自igg3分子的铰链区。在另一个示例中，重链部分可包含部分衍生自igg1分子、部分衍生自igg3分子的绞链区。在另一个示例中，重链部分可包含部分衍生自igg1分子、部分衍生自igg4分子的嵌合铰
链。
[0112]
本文所用的术语“轻链部分”包括衍生自免疫球蛋白轻链，如κ或λ轻链的氨基酸序列。轻链部分可以包含vl或cl结构域中的至少一种。
[0113]
本文所述的抗-ilt7抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可根据它们识别或特异性结合的抗原如本文所述靶标多肽(如全长或成熟的ilt7)的表位或部分进行描述或说明。靶多肽与抗体的抗原结合结构域特异性相互作用的部分是“表位”或“抗原决定簇”。靶多肽可包含单个表位，但通常包含至少两个表位，并可包括任意数量的表位，这取决于抗原的大小、构象和类型。而且，应该注意到，靶标多肽上的“表位”可以是或可包括非多肽元件，例如表位可包括糖侧链。
[0114]
认为抗体的肽或多肽表位的最小尺寸是约4至5个氨基酸。肽或多肽表位可含有至少7个，至少9个，后者至少约15至约30个氨基酸。由于cdr能以三联形式识别抗原性肽或多肽，所以包含表位的氨基酸不必定是毗连的，在某些情况下甚至可不在同一肽链上。本发明的抗-ilt7抗体识别的肽或多肽表位可含有ilt7中至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、或约15-约30个毗连或非毗连的氨基酸。
[0115]“特异性结合”通常指该抗体通过其抗原结合结构域结合于表位，并且该结合需要抗原结合结构域和表位之间某种程度的互补。按照这一定义，当抗体通过其抗原结合结构域与表位结合比与随机无关的表位结合更容易时，称该抗体“特异性结合”该表位。本文中使用术语“特异性”定性分析某一抗体与某一表位结合的相对亲和性。例如，抗体“a”可被认为比抗体“b”对给定表位具有更高特异性，或者抗体“a”据说可以比对相关表位“d”的特异性更高的特异性或亲和性结合表位“c”。
[0116]“优选结合”指与结合相关、相似、同源或类似的表位相比，该抗体更容易特异性结合某表位。因此，与相关表位相比，“优选结合”给定表位的抗体更可能结合该表位，即便这种抗体可能与相关表位发生交叉反应。
[0117]
作为非限制性示例，如果抗体与第一表位结合的解离常数(kd)低于抗体与第二表位的kd，则可认为抗体优选结合第一表位。在另一个非限制性示例中，如果抗体与第一表位结合的亲和性比抗体与第二表位的kd低至少一个数量级，则可认为抗体优选结合第一抗原。在另一个非限制性示例中，如果抗体与第一表位结合的亲和性比抗体与第二表位的kd低至少2个数量级，则可认为抗体优选结合第一表位。
[0118]
在另一个非限制性示例中，如果抗体与第一表位结合的解离速率(k(off))比抗体与第二表位的k(off)低，则可认为抗体优选结合第一表位。在另一个非限制性示例中，如果抗体与第一表位结合的亲和性比抗体与第二表位的k(off)低至少1个数量级，则可认为抗体优选结合第一表位。在另一个非限制性示例中，如果抗体与第一表位结合的亲和性比抗体与第二表位的k(off)低至少2个数量级，则可认为抗体优选结合第一表位。可以说，本文所述的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物结合本文公开的靶多肽(例如，ilt7，例如，人，灵长动物，鼠，或人、灵长动物和鼠ilt7任意的组合)或其片段或变体，其解离速率(k(off))低于或等于5x10-2
秒-1
、10-2
秒-1
、5x10-3
秒-1
或10-3
秒-1
。可以说，本发明的抗体结合本文公开的靶多肽(例如，ilt7，例如，人，灵长动物，鼠，或者人、灵长动物和鼠ilt7)或其片段或变体，其解离速率(k(off))低于或等于5x10-4
秒-1
、10-4
秒-1
、5x10-5
秒-1
、或10-5
秒-1
、5x10-6
秒-1
、10-6
秒-1
、5x10-7
秒-1
或10-7
秒-1
。
[0119]
可以说，本文所述的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物结合本文公开的靶多肽(例如，ilt7，例如，人，灵长动物，鼠，或人、灵长动物和鼠ilt7的任意组合)或其片段或变体，其结合速率(k(on))大于或等于103m-1
秒-1
、5x103m-1
秒-1
、104m-1
秒-1
或5x104m-1
秒-1
。可以说，本发明的抗体可以结合本文公开的靶多肽(如ilt7，如人，灵长动物，鼠，或人、灵长动物和鼠ilt7的任意组合)或其片段或变体，其结合速率(k(on))大于或等于105m-1
秒-1
、5x105m-1
秒-1
、106m-1
秒-1
或5x106m-1
秒-1
或107m-1
秒-1
。
[0120]
如果抗体优先结合给定表位或重叠表位以至于在某种程度上阻断参照抗体与该表位的结合，则称该抗体能竞争性抑制参照抗体与该表位的结合。可通过本领域已知的任意方法确定竞争性抑制，例如，竞争elisa试验。可以说，抗体将参照抗体与给定表位的结合竞争性抑制至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％。
[0121]
本文所用的术语“亲和性”指单独表位与免疫球蛋白分子的cdr结合的强度量度。参见例如，harlow等(1988)antibodies:a laboratory manual(《抗体：实验室手册》)(冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press)，第2版)，第27-28页。本文所用的术语“亲合力”指免疫球蛋白群体和抗原间复合物的总体稳定性，即免疫球蛋白混合物与抗原的功能性结合强度。参见，例如，harlow，第29-34页。亲合力既与群体中单独免疫球蛋白分子与特定表位的亲和性相关，也与免疫球蛋白分子和抗原的价态相关。例如，二价单克隆抗体和具有高度重复表位结构的抗原例如多聚体之间的相互作用是具有高亲合力的一个例子。
[0122]
本发明的抗-ilt7抗体或其抗原结合片段、变体或其衍生物也可就其交叉反应性方面进行描述或说明。本文所用的术语“交叉反应性”指抗体对某一种抗原具有特异性、与第二种抗原发生反应的能力；它是两种不同抗原性物质之间关联性的量度。因此，如果抗体与诱导其形成的表位以外的其他表位结合，则具有交叉反应性。交叉反应性表位通常含有许多与诱导表位相同的互补结构特征，在某些情况下甚至比原始表位更匹配。
[0123]
例如，某些抗体具有一定程度的交叉反应性，因为它们结合相关但不相同的表位，例如，与参照表位至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％和至少50％相同(按照本领域已知方法和本文所述方法计算)的表位。如果抗体不结合与参照表位少于95％、少于90％、少于85％、少于80％、少于75％、少于70％、少于65％、少于60％、少于55％和少于50％相同性(按照本领域已知方法和本文所述方法计算)的表位，则可以说该抗体的交叉反应性很低或没有交叉反应性。如果某抗体不结合某表位的任何其它类似物、直系同源物或同源物，则可认为该抗体对该表位“高度特异”。
[0124]
抗-ilt7结合分子如本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可根据其与本发明多肽的结合亲和性进行描述或说明，所述多肽例如ilt7，如人，灵长动物，鼠或人、灵长动物和鼠ilt7的任意组合。有用的结合亲和性包括解离常数或kd低于5x10-2
m、10-2
m、5x10-3
m、10-3
m、5x10-4
m、10-4
m、5x10-5
m、10-5
m、5x10-6
m、10-6
m、5x10-7
m、10-7
m、5x10-8
m、10-8
m、5x10-9
m、10-9
m、5x10-10
m、10-10
m、5x10-11
m、10-11
m、5x10-12
m、10-12
m、5x10-13
m、10-13
m、5x10-14
m、10-14
m、5x10-15
m或10-15
m的那些。
[0125]
在一些实施方式中，抗体结合人ilt7的解离常数或kd小于1nm。在一些实施方式
中，抗体结合食蟹猴ilt7的解离常数或kd小于5nm。在一些实施方式中，抗体结合人ilt7的解离常数或kd小于1nm，并且结合食蟹猴ilt7的机理常数或kd小于5nm。
[0126]
如前所述，各种免疫球蛋白类别的恒定区的亚基结构和三维构型是众所周知的。本文所用的术语“vh结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变区，术语“ch1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(最靠氨基末端)恒定区结构域。ch1结构域邻近vh结构域，并且位于免疫球蛋白重链分子绞链区的氨基末端。
[0127]
本文所用术语“ch2结构域”包括用常规编号方案例如大概从抗体的残基244延伸至残基360的重链分子部分(残基244至360，kabat编号系统；和残基231-340，eu编号系统；参见kabat ea等)。ch2结构域的独特之处在于其并不与其它结构域紧密配对。相反，两个n-连接的分支糖链间插在完整天然igg分子的两个ch2结构域之间。已有充分记载显示ch3结构域从igg分子的ch2结构域延伸至c末端，并包含大约108个残基。
[0128]
本文所用的术语“绞链区”包括连接ch1结构域和ch2结构域的重链分子部分。该铰链区包含约25个残基并且是柔性的，因此允许两个n末端抗原结合区域独立地移动。铰链区可以分成3个不同的结构域：上部、中部和下部绞链区(roux等，j.immunol.161:4083(1998))。
[0129]
本文所用的术语“二硫键”包括两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可形成二硫键或桥接第二巯基基团的巯基基团。在大部分天然产生的igg分子中，ch1和cl区域通过二硫键相连，两条重链通过对应于kabat编号系统239和242位(eu编号系统是226或229位)的两个二硫键相连。
[0130]
本文所用的术语”嵌合抗体“指其中免疫反应性区域或位点获自或衍生自第一物种，而恒定区(根据本发明，可能是完整、一部分或修饰的)获自第二物种的任何抗体。在某些实施方式中，靶标结合区或位点将来自非人来源(例如，小鼠或灵长类)并且恒定区是人的。
[0131]
本文所用的术语”工程改造的抗体”指通过从具有已知特异性的抗体至少部分置换一个或多个cdr和必要时通过部分构架区置换和序列变化，来改变重链或轻链或二者中可变区的抗体。虽然cdr可衍生自与产生构架区的抗体属于同一类或甚至亚类的抗体，但设想cdr衍生自不同类别的抗体或不同物种的抗体。将来自具有已知特异性的非人抗体的一个或多个“供体”cdr移植到人重链或轻链构架区内形成的工程改造的抗体在本文中称为“人源化抗体”。可能不必定用来自供体可变区的完整cdr代替所有cdr以将一种可变区的抗原结合能力转移至另一可变区。相反，可能只需要转移维持靶结合位点活性所必需的那些残基。
[0132]
进一步认识到，人源化抗体的重链或轻链或二者中可变区内的构架区可仅包含人来源的残基，在这种情况下人源化抗体的这些构架区称为“完全人构架区”。或者，如果需要维持与ilt7抗原的适当结合或提高结合，可以在人源化抗体的重链或轻链或二者可变区中人框架区的相应位置内工程改造供体可变区中框架区的一个或多个残基。因此，以此方式工程改造的人构架区包含人和供体构架区残基的混合物，在本文中称为“部分人构架区”。
[0133]
例如，抗-ilt7抗体的人源化过程可基本按照winter和同事所述方法进行(jones等，nature 321:522-525(1986)；riechmann等，nature 332:323-327(1988)；verhoeyen等，science 239:1534-1536(1988))，即将啮齿动物或突变型啮齿动物抗-ilt7 cdr或cdr序列
取代成人抗体的相应序列。也参见美国专利号5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762；5,859,205；其通过引用纳入本文。所得的人源化抗-ilt7抗体将在人源化抗体的重链和/或轻链可变区的完全人框架区内包含至少一个啮齿动物或突变型啮齿动物cdr。在一些情况下，人源化抗-ilt7抗体的一个或多个可变区的构架区内残基被相应非人(例如，啮齿动物)残基代替(参见例如，美国专利号5,585,089；5,693,761；5,693,762；和6,180,370)，在这种情况下所得的人源化抗-ilt7抗体将在重链和/或轻链的可变区内包含部分人框架区。
[0134]
而且，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能(例如，获得所需亲和性)。通常，人源化抗体将包含几乎所有的至少一个、通常两个可变区，其中全部或基本上全部的cdr对应于非人免疫球蛋白的cdr，全部或基本上全部的构架区是人免疫球蛋白序列的构架区。人源化抗体还任选包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(fc)，一般是人免疫球蛋白的fc。更多的细节参见jones等，nature，331:522-525(1986)；riechmann等，nature，332:323-329(1988)；和presta，curr.op.struct.biol.，2:593-596(1992)；其通过引用全文纳入本文。因此，所述“人源化”抗体可包括其中明显小于完整的人可变区被来自非人物种的相应序列所取代的抗体。在实践中，人源化抗体一般是一些cdr残基，可能是一些框架残基被啮齿动物抗体中相似位点的残基所取代的人抗体。参见，例如，美国专利号5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762；5,859,205。也参见美国专利号6,180,370和国际公开号wo 01/27160，其中公开了人源化抗体和用于产生对预定抗原的亲和性提高的人源化抗体的技术。
[0135]
本文所用术语“连接”、“融合的”和“融合”可以互换使用。这些术语指表示包括化学偶联或重组方式在内的各种方式将两个或更多元件或组件接合在一起。“框内融合”指以维持原始orf正确翻译读框的方式，将两个或多个多核苷酸开放阅读框(orf)连接形成连续的较长orf。因此，重组融合蛋白是包含两个或多个片段的单一蛋白质，所述片段对应原始orf编码的多肽(这些片段在自然条件下通常不这样连接)。尽管因此阅读框在融合片段中是连续的，但区段仍可被物理或空间分隔，如框内接头序列。例如，编码免疫球蛋白可变区cdr的多核苷酸可框内融合，但用编码至少一个免疫球蛋白构架区或额外cdr区的多核苷酸间隔开，前提是“融合的”cdr作为连续多肽的一部分共同翻译。
[0136]
对于多肽而言，“线性序列”或“序列”是多肽中从氨基到羧基末端方向上氨基酸的顺序，在序列中彼此相邻的残基是多肽一级结构中的毗连残基。
[0137]
本文所用的术语“表达”指基因生成生化物质如多肽的过程。该过程包括在细胞内基因功能存在的任何表现，包括但不限于，基因敲减以及瞬时表达和稳定表达。它包括但不限于，基因转录成信使rna(mrna)和这类mrna翻译成多肽。如果所需的最终产物是生化物质(biochemical)，则表达包括产生该生化物质和任何前体。基因的表达产生“基因产物”。本文中所用的基因产物可以是核酸，例如，通过基因转录产生的信使rna，或由转录本翻译的多肽。本文所述的基因产物还包括具有转录后修饰的核酸，例如聚腺苷酸化，或具有翻译后修饰的多肽，如甲基化、糖基化、加入脂质、连接其它蛋白质亚基、经蛋白酶水解切割等。
[0138]
本文所用的术语“治疗”或“处理”都指治疗性处理和预防性或预防措施，其中目的是防止或减缓(缓解)不期望的生理改变或失调，例如自身免疫病症的进展。有益或所需的临床结果包括但不限于可检测或不可检测的缓解症状、减轻疾病程度、疾病状态稳定(即不
恶化)、延迟或减缓疾病进展、改善或减轻疾病状态和缓解(部分或完全)。“治疗”也可以指与不接受治疗的期望存活相比延长生存期。需要治疗的人包括已经患有病症或疾病的人，以及倾向于患有病症或疾病的人或需预防病症或疾病的人。
[0139]“对象”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”指需要诊断、预防或治疗的任何对象，特别是哺乳动物对象。哺乳动物对象包括人、家养动物、家畜和动物园动物、竞技动物或宠物，如犬、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛、熊等。
[0140]
本文所用诸如“将受益于给予抗-ilt7抗体给予的对象”和“需要治疗的动物”的术语包括将受益于抗-ilt7抗体给予(例如用于检测抗-ilt7多肽(如用于诊断方法))和/或将受益于以抗-ilt7抗体的治疗(即减轻或预防疾病)的对象(如哺乳动物对象)。
[0141]
ii.ilt7
[0142]
本文所用的术语“ilt7”和“ilt7多肽”可互换使用。在某些实施方式中，ilt7为全长。在另一实施方式中，ilt7是成熟ilt7(氨基酸24-499)。在其他实施方式中，ilt7可包括全长ilt7或其片段，或ilt7变体多肽，其中ilt7或ilt7变体多肽的片段保留全长ilt7的一些或全部功能性质。
[0143]
全长人ilt7是499个氨基酸的蛋白质(登录号：p59901)，其含有信号肽(氨基酸1-23)，胞外结构域(氨基酸24-446)，跨膜结构域(氨基酸447-467)和胞质结构域(氨基酸468-499)。胞外结构域包括4个免疫球蛋白样c2结构域(氨基酸24-118、123-213、224-313和324-413)。ilt7是免疫球蛋白样转录本(ilt)或白血球免疫球蛋白样受体(lir)基因家族的一员。食蟹猴ilt7的序列以seq id no:292提供：
[0144]
prthmqaenllkpilwaepgpviiwkkpvtiwcqgtleaqeyrldkegnsisrhmlktlesenkakfsipsmmwehagryhcyyqspagwsepsdplelvvtaysrpslsalpspvvtsgvnvtlrcasrlglgrftlieegdhrlswtldshqhnhgkfqalfpvgpltfsnrgtfrcygyenntpyvwsepsdplqllvsgvsrkpslltlqgpvvapgdnltlqcgsdvgyiryalykeggdglpqrpgqqsqaglsqasftlnpvrgshggqyrcygahnvsskwsapsdpldiliagqipdrpslsvqlgptvasgekvtllcqswgpmftfllakegaahpplrlrstyraqqyqaefpmspvtsahagtyrcygsrssdpyllshsseplelvvseatetlnpaqnksdsktaphlqdytvenlirmgiaglvlvflgillfeaqqsqrsptrcsqevnsrednapfrvvepweqi(seq id no:292.)
[0145]
ilt7选择性表达于被称为浆细胞样树突细胞(pdc)的外周血单核细胞(pbmc)的亚组上。pdc是免疫调节分子干扰素(ifn)-α的主要来源，并且ilt7在调节由这些细胞释放ifn-α中起作用。
[0146]
iii.抗-ilt7结合分子
[0147]
在某些实施方式中，本文所提供的ilt-7结合分子是这样的抗体或其抗原结合片段，其含有本文所提供的ilt-7结合抗体的序列和/或性质。ilt7抗体序列的seq id no在表2中提供。
[0148]
表2：ilt7抗体序列seq id no
[0149][0150]
在某些实施方式中，本发明的结合分子例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物(例如，抗体7c7、ilt70080、ilt70080.1-ilt70080.7、ilt70083、ilt70083.1-ilt70083.9、ilt70089、ilt70100、ilt70137、ilt70142、ilt70144和ilt70052)结合ilt7并抑制浆细胞样树突细胞释放ifn-α。
[0151]
在某些实施方式中，本发明的抗体包括结合ilt7的抗-ilt7抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，例如，抗体7c7、ilt70080、ilt70080.1-ilt70080.7、ilt70083、ilt70083.1-ilt70083.9、ilt70089、ilt70100、ilt70137、ilt70142、ilt70144和ilt70052。在某些实施方式中，抗-ilt7抗体结合人、灵长动物、鼠ilt7或者人、灵长动物和鼠ilt7的任意组合。
[0152]
在一实施方式中，本发明提供了分离的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其特异性地结合与抗体7c7、ilt70080、ilt70080.1-ilt70080.7、ilt70083、ilt70083.1-ilt70083.9、ilt70089、ilt70100、ilt70137、ilt70142、ilt70144或ilt70052相同的ilt7表位。在另一实施方式中，本发明提供了分离的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其特异性地结合与包括ilt70080、ilt70080.1-ilt70080.7、
ilt70083、ilt70083.1-ilt70083.9、ilt70089、ilt70100、ilt70137、ilt70142、ilt70144、ilt70052或7c7的vh和vl的抗体相同的ilt7表位。在另一实施方式中，本发明提供了分离的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其特异性地结合与包括ilt70080、ilt70080.1-ilt70080.7、ilt70083、ilt70083.1-ilt70083.9、ilt70089、ilt70100、ilt70137、ilt70142、ilt70144、ilt70052或7c7的vh和vl的抗体相同的ilt7表位。
[0153]
在另一实施方式中，本发明提供了分离的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其特异性地结合ilt7，并竞争性地抑制抗体7c7、ilt70080、ilt70080.1-ilt70080.7、ilt70083、ilt70083.1-ilt70083.9、ilt70089、ilt70100、ilt70137、ilt70142、ilt70144或ilt70052与ilt7的特异性结合，例如，人，灵长动物，鼠或人、灵长动物和鼠的任意组合的ilt7。在另一实施方式中，本发明提供了分离的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其特异性地结合ilt7，并竞争性地抑制包括ilt70080、ilt70080.1-ilt70080.7、ilt70083、ilt70083.1-ilt70083.9、ilt70089、ilt70100、ilt70137、ilt70142、ilt70144、ilt70052或c7c的vh和vl的抗体与ilt7(例如，人，灵长动物，鼠或人、灵长动物和鼠的任意组合的ilt7)的特异性结合。在另一实施方式中，本发明提供了分离的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其特异性地结合ilt7，并竞争性地抑制包括ilt70080、ilt70080.1-ilt70080.7、ilt70083、ilt70083.1-ilt70083.9、ilt70089、ilt70100、ilt70137、ilt70142、ilt70144、ilt70052或c7c的vh或vl的抗体与ilt7(例如，人，灵长动物，鼠或人、灵长动物和鼠的任意组合的ilt7)的特异性结合。
[0154]
在某些实施方式中，本发明的结合分子具有这样的氨基酸序列，其与参照抗-ilt7抗体分子的氨基酸序列有至少80％、85％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％的序列相同性。在另一个实施方式中，结合分子与参照抗体共有至少96％、97％、98％、99％或100％的序列相同性。在某些实施方式中，参照抗体抗体是7c7、ilt70080、ilt70080.1-ilt70080.7、ilt70083、ilt70083.1-ilt70083.9、ilt70089、ilt70100、ilt70137、ilt70142、ilt70144或ilt70052。
[0155]
在另一实施方式中，本发明包括分离的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其包括下述、主要由下述组成或由下述组成：具有与seq id no:22、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192、202、212、222、232、242、252和262所示vh氨基酸序列有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸序列的vh结构域，其中包括该vh结构域的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物特异性地或优选地结合ilt7。在另一实施方式中，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物抑制浆细胞样树突细胞释放ifn-α。
[0156]
在另一实施方式中，本发明包括分离的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其包括下述、主要由下述组成或由下述组成：具有与seq id no:27、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147、157、167、177、187、197、207、217、227、237、247、257和267所示vl氨基酸序列有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸序列的vl结构域，其中包括该vl结构域的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物特异性地或优选地结合ilt7。在另一实施方式中，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物抑制浆细胞样树突细胞释放ifn-α。
[0157]
在另一实施方式中，本发明包括分离的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其包括下述、主要由下述组成或由下述组成：具有分别与seq id no:22和27；42和47；52和57；62和67；72和77；82和87；92和97；102和107；112和117；122和127；132和137；142和147；152和157；162和167；172和177；182和187；192和197；202和207；212和217；222和227；232和237；242和247；252和257；or 262和267所示vh和vl序列有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸序列的vh和vl结构域，其中包括vh和vl结构域的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物特异性地或优选地结合ilt7。在另一实施方式中，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物抑制浆细胞样树突细胞释放ifn-α。
[0158]
在另一实施方式中，本发明包括分离的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其包括下述、主要由下述组成或由下述组成：具有分别为seq id no:23、24、25、28、29和30；43、44、45、48、49和50；53、54、55、58、59和60；63、64、65、68、69和70；73、74、74、78、79和80；83、84、85、88、89和90；93、94、95、98、99和100；103、104、105、108、109和110；113、114、115、118、119和120；123、124、125、128、129和130；133、134、135、138、139和140；143、144、145、148、149和150；153、154、155、158、159和160；163、164、165、168、169和170；173、174、175、178、179和180；183、184、185、188、189和190；193、194、195、198、199和200；203、204、205、208、209和210；213、214、215、218、219和220；223、224、225、228、229和230；233、234、235、238、239和240；243、244、245、248、249和250；253、254、255、258、259和260；263、264、265、268、269和270的vh-cdr1、vh-cdr2、vh-cdr3、vl-cdr1、vl-cdr2和vl-cdr3序列的vh结合和vl结构。在另一实施方式中，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物抑制浆细胞样树突细胞释放ifn-α。
[0159]
本发明抗-ilt7抗体的合适生物活性变体可用于本发明方法。这种变体将保持亲本抗-ilt7抗体的所需结合性质。本领域中制备抗体变体的方法通常是可得的。
[0160]
诱变和改变核苷酸序列的方法本领域中熟知。参见例如，walker和gaastra编(1983)techniques in molecular biology(《分子生物学技术》)(纽约麦克米兰出版公司(macmillan publishing company))；kunkel，proc.natl.acad.sci.usa 82:488-492(1985)；kunkel等，methods enzymol.154:367-382(1987)；sambrook等(1989)molecular cloning:a laboratory manual(《分子克隆：实验室手册》)(纽约州冷泉港(cold spring harbor,n.y.))；美国专利号4,873,192；以及其中引用的参考文献；其通过引用纳入本文。有关不影响感兴趣多肽生物学活性的合适氨基酸取代的指南可参见下述文献中的模型：dayhoff等(1978)，atlas of protein sequence and structure(《蛋白质序列和结构图册》)(华盛顿特区的国家生物医学研究基金会(natl.biomed.res.found.，washington，d.c.))，第345-352页，通过引用全文纳入本文。dayhoff等的模型利用单点可接受突变(point accepted mutation，pam)氨基酸相似矩阵(pam 250矩阵)来确定合适的保守性氨基酸取代。保守取代如用具有相似特性的另一氨基酸替换某种氨基酸可以是有益的。dayhoff等模型的pam 250矩阵中教导的保守性氨基酸取代的示例包括但不限于：和
[0161]
构建抗-ilt7结合分子的变体如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物时，生成修饰，从而变体持续拥有所需性质，如能特异性结合ilt7，在某些实施方式中，能够抑制ifn-α
释放。显然，在编码变体多肽的dna中产生的任何突变都必需不将该序列置于阅读框外。在一些实施方式中，在dna中生成的任何突变将不会产生可以产生二级mrna结构的互补区域。
[0162]
测定抗-ilt7结合分子如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的结合特异性的方法包括但不限于：标准竞争结合试验、细胞毒性试验、ifn释放试验、elisa试验等。
[0163]
本文在讨论本文公开的任何具体多肽(包括恒定区、cdr、vh结构域或vl结构域)是否与另一多肽至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者甚至100％相同时，相同性％可采用本领域已知的方法和计算机程序/软件测定，例如但不限于bestfit程序(威斯康星序列分析软件包，用于unix系统的第8版，遗传学计算机团队(genetics computer group)，威斯康星州麦迪逊科学大道575大学研究园(university research park)，53711)。bestfit利用smith和waterman(1981)adv.appl.math.2:482-489的局部同源性算法，以找到两条序列之间的最佳同源性区段。使用bestfit或任何其它序列比对程序来确定某具体序列是否与本发明所述参考序列(例如)95％相同时，当然要设定参数从而在参考多肽序列的全长上计算相同性百分数，并且在参考序列的氨基酸总数中允许多至5％的同源性缺口。
[0164]
出于本发明的目的，可采用史密斯-沃特曼(smith-waterman)同源性搜索算法测定序列相同性百分数，该算法使用仿射缺口搜索，其中缺口开放罚12分，缺口延伸罚2分，blosum矩阵计62分。smith和waterman(1981)adv.appl.math.2:482-489中公开了史密斯-沃特曼同源性搜索算法。变体与参照抗-ilt7抗体(例如，7c7、ilt70080、ilt70080.1-ilt70080.7、ilt70083、ilt70083.1-ilt70083.9、ilt70089、ilt70100、ilt70137、ilt70142、ilt70144或ilt70052)可以差异例如，少至1-15个氨基酸残基，少至1-10个氨基酸残基，如6-10个，少至5个，少至4、3、2、或者甚至1个氨基酸残基。
[0165]
能够特异性结合ilt7并保留所需活性的多肽的准确化学结构取决于多种因素。因为分子中存在可电离的氨基和羧基基团，所以可以作为酸性或碱性盐或其自然形式获得特定多肽。置于合适环境条件时保持生物学活性的所有这类制品均落入本文所用的抗-ilt7抗体的定义范围内。另外，可利用糖部分(糖基化)或其它补充分子如脂质、磷酸酯(盐)、乙酰基等通过衍生化来扩充所述多肽的一级氨基酸序列。其也可以通过与多糖结合而扩充。这样扩充的某些方面通过所生成的宿主的翻译后处理系统完成；其它这样的修饰可以体外引入。在任何情况下，这类修饰均包括在本文所用抗-ilt7抗体的定义范围内，只要抗-ilt7抗体的所需特性不被破坏。在不同实验中，预计这类修饰可通过提高或降低多肽活性来定量或定性地影响活性。此外，链中的单个氨基酸残基可以通过氧化、还原或其它衍生化作用修饰，而多肽可以经切割以获得保留活性的片段。不破坏所需特性(如对ilt7的结合特异性、结合亲和性和相关的活性，例如，抑制肥大细胞、内皮细胞释放ilt7驱动的细胞因子以及tf-1细胞的增殖)的这类改变不会使该多肽序列从本文所用的感兴趣抗-ilt7抗体定义中去除。
[0166]
本领域提供有关制备和使用多肽变体的大量指南。在制备抗-ilt7结合分子的变体如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物时，本领域技术人员不难确定对天然蛋白质核苷酸或氨基酸序列的哪种修饰将产生适用作本发明方法所用药物组合物的治疗活性组分的变体。
[0167]
可以多种方式使抗-ilt7抗体的恒定区突变从而改变效应物功能。例如，参见美国
专利号6,737,056b1和美国专利申请公开号2004/0132101a1，其公开了优化抗体与fc受体结合的fc突变。
[0168]
在某些抗-ilt7抗体中，可利用本领域已知技术突变fc部分以降低效应物功能。例如，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其它方式)可降低循环的修饰抗体与fc受体的结合。在其它情况下，与本发明相一致的恒定区修饰可以降低互补物结合，从而缩短所偶联细胞毒素的血清半衰期并减少非特异性结合。可利用恒定区的其它修饰来改变二硫键连接或寡糖部分，能因抗原特异性或抗体灵活性提高而加强定位。无需过多实验，即可容易地利用熟知的免疫学技术测定或定量分析修饰所产生的生理学概况、生物利用度和其它生化作用，如生物分布和血清半衰期。
[0169]
本文所提供的某些ilt7抗体是非岩藻糖基化的。缺少来自fc n-聚糖的核心岩藻糖残基的抗体在较低浓度时具有强adcc，与岩藻糖基化对应物相比效力高很多，并且它们可以通过其与γ受体iiia(fc fcγriiia)的高结合来避免血清免疫球蛋白g(igg)对adcc的抑制作用。
[0170]
本发明抗-ilt7抗体也包括修饰的衍生物，例如通过将任何类型的分子共价连接到抗体上，从而该共价连接不会防止抗体特异性结合其关联表位。例如但不限于，抗体衍生物包括通过，例如糖基化、乙酰化、peg化、磷酸化、酰胺化、由已知保护/阻断基团衍生、蛋白水解切割、连接于细胞配体或其它蛋白质等方法修饰的抗体。通过已知技术可进行任意多种化学修饰，包括但不限于：特异性化学切割、乙酰化、甲酰化等。此外，衍生物可包含一种或多种非经典氨基酸。
[0171]“保守性氨基酸取代”是氨基酸残基被具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基取代。本领域已定义具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括：具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。或者，也可沿所有或一部分编码序列随机引入突变(例如通过饱和诱变)，可筛选所得突变体的生物学活性，以鉴定保持活性(例如，结合抗-ilt7多肽的能力)的突变体。
[0172]
例如，可能仅在抗体分子的构架区内或仅在cdr区内引入突变。引入的突变可以是沉默或天然错义突变，即对抗体结合抗原的能力没有或有很少的影响。可使用这些突变类型来优化密码子使用，或提高杂交瘤的抗体生成。或者，非天然错义突变可改变抗体结合抗原的能力。大部分沉默和中性错义突变的位置可能位于构架区内，而大部分非中性错义突变的位置可能在cdr内，但这不是绝对的要求。本领域技术人员将能够设计并测试具有所需性质的突变体分子，如没有抗原结合活性或结合活性的变化(例如，改善抗原结合活性或改变抗体特异性)。诱变之后，编码的蛋白质可经常规表达并且能使用本文所述的技术或者通过本领域已知的常规修饰技术来确定编码的蛋白质的功能和/或生物活性(例如，免疫特异性结合ilt7多肽的至少一个表位的能力)。
[0173]
在某些实施方式中，本发明的抗-ilt7抗体包含至少一个优化的互补决定区(cdr)。“优化cdr”指该cdr已被修饰，并且根据对包含该优化cdr的抗-ilt7抗体赋予维持或
提高的结合亲和性和/或抗-ilt7活性来选择优化序列。“抗-ilt7活性”可以包括，例如调节一种或多种下述与ilt7相关的活性的活性，所述与ilt7相关的活性例如，浆细胞样树突细胞释放ilt7驱动的干扰素，对ilt7-表达细胞的细胞毒性，或与ilt7相关的任何其它活性。抗-ilt7活性还可以归因于与ilt7表达相关的疾病的发生率或严重程度，包括但不限于特定类型的自身免疫病症，例如，系统性红斑狼疮、慢性风湿病和牛皮癣。修饰可包括取代cdr内的氨基酸残基，使得抗-ilt7抗体保留对ilt7抗原的特异性并且具有改善的结合亲和性和/或改善的抗-ilt7活性。
[0174]
iv.编码抗-ilt7抗体的多核苷酸
[0175]
本发明还提供编码本发明抗-ilt7抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物的核酸分子。
[0176]
在其他实施方式中，本发明包括分离的多核苷酸，其包括下述、主要由下述组成或由下述组成：编码具有与参照vh结构域多核苷酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸序列的vh结构域的核酸，所述参照vh结构域多核苷酸序列含有seq id no:12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192、202、212、222、232或242，其中包括编码的vh结构域的抗-ilt7抗体特异性地或优选地结合ilt7。在某些实施方式中，多核苷酸编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其抑制浆细胞样树突细胞释放ifn-α。
[0177]
在其他实施方式中，本发明包括分离的多核苷酸，其包括下述、主要由下述组成或由下述组成：编码具有与参照vl结构域多核苷酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同性的氨基酸序列的vl结构域的核酸，所述参照vh结构域多核苷酸序列含有seq id no:17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147、157、167、177、187、197、207、217、227、237或247，其中包括编码的vl结构域的抗-ilt7抗体特异性地或优选地结合ilt7。在某些实施方式中，多核苷酸编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其抑制浆细胞样树突细胞释放ifn-α。
[0178]
上述任何多核苷酸还可包含额外核酸，所述核酸编码例如信号肽以指导编码多肽、本文所述抗体恒定区或本文所述其它异源多肽的分泌。另外，如本文他处所详述，本发明包括含一种或多种上述多核苷酸的组合物。
[0179]
在一个实施方式中，本发明包括含第一多核苷酸和第二多核苷酸的组合物，其中所述第一多核苷酸编码本文所述的vh结构域，其中所述第二多核苷酸编码本文所述的vl结构域。具体地，组合物可以包括下述、主要由下述组成或由下述组成：如seq id no:11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231或241中所示的vh结构域-编码多核苷酸，以及如seq id no:16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156、166、176、186、196、206、216、226、236或246中所示的vl结构域-编码多核苷酸。组合物还可以包括下述、主要由下述组成或由下述组成：编码seq id no:12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192、202、212、222、232或242中所示序列的vh结构域-编码多核苷酸，以及编码seq id no:17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147、157、167、177、187、197、207、217、227、237、247、257或267中所示序列的vl结构域-编码多核苷酸。在一些实施方式中，vh结构域-编码多核苷酸和vl结构域-编码多核苷酸位于相同的载体上。在一些实施方式中，vh结构域-编
码多核苷酸和vl结构域-编码多核苷酸位于不同的载体上。
[0180]
如本文另述，本发明还包括本发明多核苷酸的片段。此外，本发明还考虑编码本文所述融合多肽、fab片段和其它衍生物的多核苷酸。
[0181]
多核苷酸可以通过本领域已知的任何方法生产或制造。例如，如果抗体的核苷酸序列已知，则可由化学合成的寡核苷酸组装编码该抗体的多核苷酸(如kutmeier等，bio techniques 17:242(1994)所述)，简言之，该方法包括合成含有编码该抗体的序列的某部分的重叠寡核苷酸，使这些寡核苷酸退火和连接，然后通过pcr扩增连接的寡核苷酸。
[0182]
或者，编码本发明抗-ilt7抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可由合适来源的核酸产生。如果无法获得含有编码特定抗体的核酸的克隆，但该抗体分子的序列已知，则可通过化学合成或利用可与该序列3'和5'端杂交的合成引物进行pcr扩增、或利用具体基因序列的特异性寡核苷酸探针进行克隆以鉴定例如cdna文库中编码该抗体或其它抗-ilt7抗体的cdna克隆，由合适来源(如抗体cdna文库，或由表达该抗体或其它抗-ilt7抗体的任何组织或细胞如选择表达抗体的杂交瘤细胞产生的cdna文库，或从中分离的核酸，例如聚a rna)获得编码该抗体的核酸。然后，可利用本领域熟知的任何方法将pcr产生的扩增核酸克隆到可复制克隆载体中。
[0183]
一旦确定抗-ilt7抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的核苷酸序列和相应氨基酸序列，就可利用本领域熟知的操作核苷酸序列的方法，例如重组dna技术、定点诱变、pcr等操作其核苷酸序列。(参见，例如以下文献中所述技术：sambrook等，(1990)，《分子克隆，实验室手册(molecular cloning,a laboratory manual)》(第2版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)和ausubel等编，(1998)，《新编分子生物学实验指南(current protocols in molecular biology)》(约翰威立父子出版公司(john wiley&sons)，纽约)，两者通过引用将其全部内容纳入本文)，以生成具有不同氨基酸序列的抗体，例如以产生氨基酸取代、缺失和/或插入。
[0184]
编码抗-ilt7结合分子如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸构成，可以是未修饰的rna或dna或修饰的rna或dna。例如，编码抗-ilt7抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可由以下构成：单链和双链dna、作为单链和双链区域混合物的dna、单链和双链rna以及作为单链和双链区域混合物的rna、杂交分子，所述杂交分子包含可以是单链或更常见是双链、或是单链和双链区混合物的dna和rna。此外，编码抗-ilt7结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可由包含rna或dna、或者rna和dna的三链区域构成。编码抗-ilt7结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸也可含有一个或多个修饰碱基，或者就稳定性或其它原因修饰的dna或rna主链。“修饰的”碱基包括但不限于三苯甲基化碱基和非常见碱基，诸如肌苷。可以对dna和rna进行各种修饰；因此“多核苷酸”包括化学修饰、酶促修饰或代谢修饰形式。
[0185]
编码衍生自免疫球蛋白(如免疫球蛋白重链部分或轻链部分)的非天然多肽变体的分离多核苷酸可通过将一个或多个核苷酸取代、添加或缺失引入免疫球蛋白的核苷酸序列来产生，从而将一个或多个氨基酸取代、添加或缺失引入编码蛋白。突变可以通过标准技术引入，如定点诱变和pcr介导的诱变。保守性氨基酸取代可以在一个或多个非必需氨基酸残基处完成。
[0186]
v.融合蛋白和抗体偶联物
[0187]
如本文他处详述，抗-ilt73结合分子如本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物还可与异源多肽的n-或c-末端重组融合，或与多肽或其它组合物化学偶联(包括共价和非共价偶联)。例如，抗-ilt7抗体可与用作检测实验标签和效应分子如异源多肽、药物、放射性核素或毒素的分子重组融合或偶联。参见例如pct公开wo 92/08495；wo 91/14438；wo 89/12624；美国专利号5,314,995；和ep 396,387。
[0188]
本发明的抗-ilt7抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可包括修饰的衍生物，即通过将任何类型的分子与抗体共价连接，从而该共价连接不防止抗体结合抗-ilt7。例如但不限于，抗体衍生物包括通过，例如糖基化、乙酰化、peg化、磷酸化、酰胺化、由已知保护/阻断基团衍生、蛋白水解切割、连接于细胞配体或其它蛋白质等方法修饰的抗体。通过已知技术可进行任意多种化学修饰，包括但不限于：特异性化学切割、乙酰化、甲酰化等。此外，衍生物可包含一种或多种非经典氨基酸。
[0189]
抗-ilt7结合分子，如本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可由通过肽键或经修饰肽键即肽等构物而彼此结合的氨基酸组成，并可包含20种基因编码氨基酸以外的氨基酸。例如，可通过天然方法如翻译后加工，或通过本领域熟知的化学修饰技术修饰抗-ilt7抗体。这些修饰在基础教材和更具体的专著以及大量研究文献中已有深入描述。可以在抗-ilt7结合分子的任何位置进行修饰，包括在肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端、或者在某部分如糖上进行修饰。应当了解相同类型的修饰可以在给定抗-ilt7结合分子的多个位置以相同或不同程度出现。并且，给定的抗-ilt7结合分子可包含许多类型的修饰。抗-ilt7结合分子可以是分支的，例如因泛素化造成，它们可以为有或没有分支的环状。环状、分支、和分支环状的抗-ilt7结合分子可以由翻译后的天然过程产生或者可通过合成方法产生。修饰包括乙酰化、酰基化、adp-核糖基化、酰胺化、共价结合黄素、共价结合血红素部分、共价结合核苷酸或核苷酸衍生物、共价结合脂质或脂质衍生物、共价结合磷脂酰肌醇、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ羧化、糖基化、gpi锚形成、羟基化、碘化、甲基化、十四烷基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒化、硫化、转移rna介导的氨基酸加入蛋白质如精氨酰化、以及泛素化。(参见例如，proteins
‑‑
structure and molecular properties(《蛋白质—结构和分子特性》)，t.e.creighton，w.h.弗里曼公司(w.h.freeman and company)，纽约；第2版(1993)；johnson编(1983)posttranslational covalent modification of proteins(《蛋白质的翻译后共价修饰》)(学术出版社(academic press)，纽约)，第1-12页；seifter等，meth.enzymol.182:626-646(1990)；rattan等，ann.ny acad.sci.663:48-62(1992))。
[0190]
本发明也提供包含抗-ilt7抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，以及异源多肽的融合蛋白。与抗体融合的异源多肽可用于某种功能或用于靶向表达抗-ilt7多肽的细胞。
[0191]
在一个实施方式中，本发明融合蛋白包含某一多肽、基本由其组成或由其组成，所述多肽具有本发明抗体的任何一个或多个vh结构域的氨基酸序列、本发明抗体或其片段、变体或衍生物的任何一个或多个vl结构域的氨基酸序列、以及异源多肽序列。
[0192]
在另一实施方式中，用于本文诊断和治疗方法的融合蛋白包含某一多肽、基本由其组成或由其组成，所述多肽具有抗-ilt7抗体、或其片段、变体或衍生物的vh结构域中任
何一个、两个、三个cdr的氨基酸序列，和/或抗-ilt7抗体、或其片段、变体或衍生物的vl结构域中任何一个、两个、三个cdr的氨基酸序列，以及异源多肽序列。在一个实施方式中，融合蛋白包含某一多肽，所述多肽具有本发明抗-ilt7抗体的至少一个vh结构域的氨基酸序列和本发明抗-ilt7抗体或其片段、衍生物或变体的至少一个vl结构域的氨基酸序列，以及异源多肽序列。在一些实施方式中，融合蛋白的vh和vl结构域对应于特异性结合ilt7中至少一个表位的单一来源抗体(或scfv或fab片段)。在另一实施方式中，用于本文所述诊断和治疗方法的融合蛋白包含某一多肽，所述多肽具有抗-ilt7抗体的vh结构域的任何一个、两个、三个或更多个cdr的氨基酸序列和抗-ilt7抗体或其片段或变体的vl结构域中任何一个、两个、三个或更多个cdr的氨基酸序列，以及异源多肽序列。在一些实施方式中，vh结构域或vl结构域的两个、三个、四个、五个、六个或更多个cdr对应于本发明的单一来源抗体(或scfv或fab片段)。编码这些融合蛋白的核酸分子也涵盖于本发明。
[0193]
文献中报道的示范性融合蛋白包括t细胞受体(gascoigne等，proc.natl.acad.sci.usa 84:2936-2940(1987))；cd4(capon等，nature 337:525-531(1989)；traunecker等，nature 339:68-70(1989)；zettmeissl等，dna cell biol.usa 9:347-353(1990)；和byrn等，nature 344:667-670(1990))；l-选择素(寻靶受体)(watson等，j.cell.biol.110:2221-2229(1990)；和watson等，nature 349:164-167(1991))；cd44(aruffo等，cell 61:1303-1313(1990))；cd28和b7(linsley等，j.exp.med.173:721-730(1991))；ctla-4(lisley等，j.exp.med.174:561-569(1991))；cd22(stamenkovic等，cell 66:1133-1144(1991))；tnf受体(ashkenazi等，proc.natl.acad.sci.usa 88:10535-10539(1991)；lesslauer等，eur.j.immunol.27:2883-2886(1991)；和peppel等，j.exp.med.174:1483-1489(1991))；和ige受体a(ridgway和gorman，j.cell.biol.卷115，摘要，第1448期(1991))的融合物。
[0194]
如本文它处所述，抗-ilt7结合分子，如本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可与异源多肽融合，以提高所述多肽的体内半衰期或在使用本领域已知方法的免疫实验中应用。例如，在一个实施方式中，可将peg偶联于本发明抗-ilt7抗体，以提高其体内半衰期。参见leong等，cytokine 16:106(2001)；adv.in drug deliv.rev.54:531(2002)；或weir等，biochem.soc.transactions 30:512(2002)。
[0195]
此外，抗-ilt7结合分子，如本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可融合标记物序列如肽，以利于其纯化或检测。在一些实施方式中，标记物氨基酸序列是六组氨酸肽，例如pqe载体(凯杰公司(qiagen)，加利福尼亚州查茨沃斯(chatsworth)伊顿大街9259号，91311)提供的标签等，其中许多标记可市售获得。例如，如gentz等,proc.natl.acad.sci.usa 86:821-824(1989)中所述，六组氨酸提供了方便的融合蛋白纯化方法。用于纯化的其它肽标签包括但不限于：对应于流感血凝素蛋白衍生表位的“ha”标签(wilson等，cell 37:767(1984))，以及“flag”标签。
[0196]
可采用本领域熟知方法制备融合蛋白(参见例如，美国专利号5,116,964和5,225,538)。可以凭经验地选择进行融合的精确位点以优化结合融合蛋白的分泌和结合性质。然后，将编码融合蛋白的dna转染到宿主细胞中以用于表达。
[0197]
抗-ilt7结合分子如本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，可以非偶联形式使用，或者可偶联于各种分子中的至少一种，例如，以改善该分子的治疗特性、促进靶标
检测、或用于患者成像或治疗。可以在纯化前或纯化后，或者在进行纯化时标记或偶联抗-ilt7结合分子，如本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。
[0198]
具体地，本发明的抗-ilt7抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可偶联于治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物反应修饰剂、药物试剂或peg。
[0199]
本领域技术人员应理解，根据所选的待偶联物质还可采用各种技术组装偶联物。例如，可通过使结合多肽与生物素的活化酯如生物素n-羟基琥珀酰亚胺酯反应，制备有生物素的偶联物。相似地，可以在偶联剂如本文所列偶联剂存在下或通过与异硫氰酸酯如荧光素-异硫氰酸酯反应来制备有荧光标记物的偶联物。以类似方式制备本发明抗-ilt7抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的偶联物。
[0200]
本发明还包括偶联于诊断剂或治疗剂的抗-ilt7结合分子，如本发明抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。可将本发明抗-ilt7抗体(包括其抗原结合片段、变体和衍生物)用于诊断目的，例如，作为临床测试步骤的一部分监测疾病的发展或进展，从而(例如)确定给定治疗和/或预防方案的功效。例如，将抗-ilt7抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物偶联于可检测物质能促进检测。可检测物质的例子包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、使用各种正电子发射断层显像术的正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子。参见例如，美国专利号4,741,900中的金属离子，可根据本发明将其与抗体偶联用于诊断。合适酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适荧光材料的例子包括：伞形花内酯、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺；生物发光材料的例子包括：萤光素酶、萤光素和发光蛋白；合适的放射性材料的例子包括
125
i、
131
i、
111
in、
90
y或
99
tc。
[0201]
抗-ilt7结合分子如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物还可通过偶联于化学发光化合物进行可检测标记。然后，通过检测化学反应过程中产生的发光存在，确定化学发光标记的抗-ilt7结合分子的存在。特别有用的化学发光标记化合物的例子是鲁米诺、异鲁米诺、热性(theromatic)吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
[0202]
可以对抗-ilt7抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物进行可检测标记的方式之一是通过将其连接于酶并在酶学免疫试验(eia)中使用该连接的产物(voller,a.,"酶联免疫吸附测定(the enzyme linked immunosorbent assay)(elisa)"微生物学协会季刊(microbiological associates quarterly publication),马里兰州沃克斯维尔；diagnostic horizons 2:1-7(1978)；voller等,j.clin.pathol.31:507-520(1978)；butler,meth.enzymol.73:482-523(1981)；maggio编著(1980)enzyme immunoassay,crc出版社(crc press),佛罗里达州伯克莱屯；ishikawa等编著(1981)enzyme immunoassay(kgaku shoin,东京)。结合于抗-ilt7抗体的酶会与合适底物例如发色底物反应，其反应方式产生可通过(例如)分光光度法、荧光测定法或目测法检测的化学部分。能用于可检测标记抗体的酶包括但不限于：苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。此外，可通过利用酶发色底物的比色法完成检测。也可通过目测比较底物与类似制备标准品的酶反应程度完成检测。
[0203]
也可使用多种其他免疫试验中的任一种来完成检测。例如，通过放射性标记抗-ilt7结合分子如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，可以使用放射性免疫实验(ria)检测结合分子(参见例如，weintraub(1986年3月)principles of radioimmunoassays(《放射性免疫实验原理》)，第七届放射性配体实验技术培训课程(seventh training course on radioligand assay techniques)(内分泌协会(the endocrine society))，通过引用纳入本文)。放射性同位素可通过包括但不限于以下的方式检测：γ计数器、闪烁计数器或放射自显影。
[0204]
也可利用荧光发射金属如152eu或其它镧系元素对抗-ilt7结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物进行可检测标记。可用诸如二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)或乙二胺四乙酸(edta)的金属螯合基团将这些金属连接于结合分子。
[0205]
将不同部分偶联于抗体(如抗-ilt7抗体)或其抗原结合片段、变体或衍生物的技术是众所周知的，参见例如，amon等(1985)monoclonal antibodies for immunotargeting of drugs in cancer therapy(“癌症治疗中用于免疫靶向药物的单克隆抗体”)，收录于monoclonal antibodies and cancer therapy(《单克隆抗体和癌症治疗》)，reisfeld等编(arl公司(alan r.liss))，第243-56页；hellstrom等(1987)antibodies for drug delivery(“用于药物递送的抗体”)，收录于controlled drug delivery(《控制药物递送》)，robinson等编(第2版；马塞尔德克尔公司(marcel dekker))，第623-53页)；thorpe(1985)antibody carriers of cytotoxic agents in cancer therapy:a review(“癌症治疗中细胞毒性剂的抗体运载体：综述”)，收录于monoclonal antibodies'84:biological and clinical applications(《单克隆抗体'84：生物学和临床应用》)，pinchera等编，第475-506页；analysis,results,and future prospective of the therapeutic use of radiolabeled antibody in cancer therapy)“在癌症治疗中治疗性应用放射性标记抗体的分析、结果和展望”)，收录于monoclonal antibodies for cancer detection and therapy(《用于检测和治疗癌症的单克隆抗体》)，baldwin等编，学术出版社(academic press)，第303-16页(1985)；和thorpe等，(1982)the preparation and cytotoxic properties of antibody-toxin conjugates(抗体-毒素偶联物的制备和细胞毒性性质),immunol.rev.62:119-58。
[0206]
vi.抗体多肽的表达
[0207]
编码抗体的轻链和重链的dna序列可根据熟知方法利用逆转录酶和dna聚合酶同时或单独制备。基于公开的重链和轻链dna和氨基酸序列通过共有恒定区引物或通过特异性引物可以启动pcr。如上所讨论，pcr还可以用于分离编码抗体轻链和重链的dna克隆。在这种情况下，可通过共有引物或较大的同源探针，如小鼠恒定区探针筛选文库。
[0208]
dna通常是质粒dna，可利用本领域已知技术从细胞中分离，按照例如涉及重组dna技术的上面文献中详述的标准熟知技术进行限制性作图和测序。当然，可以在分离过程或后续分析期间的任何时间点按照本发明合成dna。
[0209]
操作分离的遗传物质以提供本发明抗-ilt7抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物后，通常将编码该抗-ilt7抗体的多核苷酸插入表达载体，以引入可用于产生所需量抗-ilt7抗体的宿主细胞中。
[0210]
重组表达抗体或其片段、变体或衍生物(例如结合本文所述靶分子如ilt7的抗体
重链或轻链)需要构建含有编码该抗体的多核苷酸的表达载体。一旦获得编码本发明抗体分子、或抗体的重链或轻链、或其一部分(例如含有重链或轻链可变区)的多核苷酸，可使用本领域熟知方法通过重组dna技术生成产生抗体分子的载体。因此，本文描述了通过表达含抗体编码核苷序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。可利用本领域技术人员熟知的方法构建含有抗体编码序列和合适转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如，体外重组dna技术、合成技术和体内遗传重组。因此，本发明提供可复制载体，其包含操作性连接启动子的编码本发明抗体分子、或其重链或轻链、其重链或轻链可变区的核苷酸序列。这种载体可包含编码抗体分子恒定区的核苷酸序列(参见例如，pct公开号wo 86/05807；pct公开号wo 89/01036；和美国专利号5,122,464)，可将抗体可变区克隆到这种载体中，以表达完整重链和轻链。
[0211]
本文所用的术语“载体”或“表达载体”指根据本发明用作载剂以在宿主细胞中引入和表达所需基因的载体。如本领域技术人员所知，这种载体可容易地选自质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒。通常，与本发明相容的载体包含选择标记物、有利于克隆所需基因的合适限制性位点和进入真核或原核细胞和/或在其中复制的能力。
[0212]
出于本发明目的，可采用多种表达载体系统。例如，一类载体利用dna元件，其源自动物病毒如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒、逆转录病毒(rsv、mmtv或momlv)或sv40病毒。其它涉及利用多顺反子系统与内部核糖体结合位点。此外，通过引入能够选择已转染宿主细胞的一种或多种标记物，可选择将dna整合入染色体中的细胞。该标记物可向营养缺陷型宿主提供原营养，以及杀生体抗性(如抗生素)或对重金属如铜的抗性。选择标记基因可直接连接于待表达的dna序列，或者通过共同转化引入同一细胞内。mrna的优化合成也可能需要其它元件。这些元件可以包括信号序列，剪接信号，以及转录启动子，增强子和终止子信号。
[0213]
在一些实施方式中，将克隆的可变区基因以及如上所述合成的重链和轻链恒定区基因(例如人)插入表达载体内。当然，能够在真核细胞中刺激表达的任何表达载体都可用于本发明。合适载体的例子包括但不限于：质粒pcdna3、phcmv/zeo、pcr3.1、pef1/his、pind/gs、prc/hcmv2、psv40/zeo2、ptracer-hcmv、pub6/v5-his、pvax1和pzeosv2(可获自加州圣地亚哥的英杰公司(invitrogen,san diego,calif.))和质粒pci(可获自威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(promega,madison,wis.))。通常，筛选大量转化细胞以选出表达适当高水平免疫球蛋白重链和轻链的转化细胞是可通过(例如)机器人系统进行的常规实验。
[0214]
更一般地，一旦制备得到编码抗-ilt7抗体单体亚基的载体或dna序列，可将表达载体引入合适的宿主细胞内。可利用本领域技术人员已知的任何技术将质粒引入宿主细胞。这些技术包括但不限于，转染(包括电泳和电穿孔)，原生质体融合，磷酸钙沉淀，与包膜dna的细胞融合，显微注射和用完整病毒的感染。参见ridgway(1988)载体中的“哺乳动物表达载体”("mammalian expression vectors"in vectors),编著rodriguez和denhardt(马萨诸塞州波士顿的巴特沃斯),第24.2章,第470-472页。通常，通过电穿孔将质粒引入宿主。具有表达结构的宿主细胞在适合产生轻链和重链的条件下生长，并且针对重链和/或轻链蛋白质合成进行分析。示例性的试验技术包括酶联免疫吸附试验(elisa)、放射性免疫试验(ria)、荧光活化细胞分选分析(facs)、免疫组化等。
[0215]
通过常规技术将该表达载体转移到宿主细胞中，然后通过常规技术培养该转染细
胞以产生用于本文所述方法的抗体。因此，本发明包括含有操作性连接异源启动子的本发明抗体或其重链或轻链的编码多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方式中，为了表达双链抗体，可以在宿主细胞中共同表达编码重链和轻链的载体，以表达整个免疫球蛋白分子，如下所详述。
[0216]
本文所用的“宿主细胞”指携带用重组dna技术构建并编码至少一种异源基因的载体的细胞。在描述从重组宿主中分离抗体的方法时，除非另有明确说明，术语“细胞”和“细胞培养物”可互换使用来指示抗体来源。换言之，从“细胞”收获多肽可以指从瞬时离心的全细胞或含有培养基和悬浮细胞的细胞培养物收获。
[0217]
可利用各种宿主-表达载体系统来表达用于本文所述方法的抗体分子。这类宿主-表达系统代表可产生并随后纯化感兴趣编码序列的载剂，但也代表用合适的核苷酸编码序列转化或转染时，可原位表达本发明抗体分子的细胞。它们包括但不限于微生物，例如用含有抗体编码序列的重组噬菌体dna、质粒dna或粘粒dna表达载体转化的细菌(如大肠杆菌(e.coli)和枯草芽孢杆菌(b.subtilis))；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(如毕赤酵母(saccharomyces pichia))；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒，camv；烟草花叶病毒，tmv)感染的或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(如ti质粒)转化的植物细胞系统；或者哺乳动物细胞系统(如cos、cho、blk、293和3t3细胞)，其携带含有衍生自哺乳动物细胞基因组启动子(如金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒启动子(如腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5k启动子)的重组表达构建物。利用细菌细胞如大肠杆菌(escherichia coli)或真核细胞(特别是表达完整重组抗体分子时)表达重组抗体分子。例如，哺乳动物细胞如中华仓鼠卵巢细胞(cho)与这样的载体联用是抗体的有效表达系统，所述载体包括来自人巨细胞病毒的主要中间体早期基因启动子元件(foecking等，1986，gene 45:101；和cockett等，1990，bio/technology 8:2)。
[0218]
用于表达蛋白质的宿主细胞系常常是哺乳动物来源的；本领域技术人员能够确定最适合所需基因产物在其中表达的具体宿主细胞系。示范性宿主细胞系包括但不限于：cho(中华仓鼠卵巢)、dg44和duxb11(中华仓鼠卵巢细胞系、dhfr-)、hela(人宫颈癌)、cvi(猴肾细胞系)、cos(具有sv40 t抗原的cvi衍生物)、very、bhk(幼仓鼠肾)、mdck、293、wi38、r1610(中华仓鼠成纤维细胞)balbc/3t3(小鼠成纤维细胞)、hak(仓鼠肾细胞系)、sp2/o(小鼠骨髓瘤)、p3.times.63-ag3.653(小鼠骨髓瘤)、bfa-1c1bpt(牛内皮细胞)、raji(人淋巴细胞)和293(人肾)。宿主细胞系通常可获自商业服务商美国组织培养物保藏中心(american tissue culture collection)或获自公开的文献。
[0219]
此外，可选择以所需的特定方式调节插入序列表达、或修饰和加工该基因产物的宿主细胞株。对蛋白质产物的这种修饰(如糖基化)和加工(如切割)可能对蛋白质功能重要。不同宿主细胞对蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰具有特征性和特定的机制。可选择合适的细胞系或宿主系统，以保证对所表达的外来蛋白进行正确的修饰和加工。为此，可采用具有适当加工初始转录物、对基因产物进行糖基化和磷酸化的细胞机构的真核宿主细胞。
[0220]
为了长期、高产率地生产重组蛋白，使用稳定的表达。例如，可工程改造稳定表达抗体分子的细胞系。用合适表达控制元件(如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸
化位点等)控制的dna和选择标记来转化宿主细胞,而不是使用含有病毒复制起点的表达载体。引入外来dna后，可以允许工程改造的细胞在富集培养基中生长1-2天，然后换到选择性培养基中。重组质粒中的选择标记提供对选择的抗性，使得细胞能够将该质粒稳定整合入染色体，生长形成细胞灶，进而可克隆并扩增成细胞系。可有利地使用这种方法工程改造稳定表达该抗体分子的细胞系。
[0221]
可采用许多选择系统，包括但不限于可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞的单纯疱疹病毒胸苷激酶(wigler等，cell 11:223(1977))、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(szybalska和szybalski，proc.natl.acad.sci.usa 48:202(1992))和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(lowy等，cell 22:817(1980))基因。另外，抗代谢剂抗性可用作选择以下基因的基础：dhfr，产生甲氨蝶呤抗性(wigler等，1980，natl.acad.sci.usa，77:357；o’hare等，1981，proc.natl.acad.sci.usa，78:1527)；gpt，产生霉酚酸抗性(mulligan和berg，1981，proc.natl.acad.sci.usa，78:2072)；neo，产生氨基糖苷g-418抗性(clinical pharmacy 12:488-505；wu和wu，1991，biotherapy 3:87-95；tolstoshev，1993，ann.rev.pharmacol.toxicol.32:573-596；mulligan，1993，science 260:926-932；和morgan和anderson，ann.rev.biochem.62:191-217(1993)；tib tech 11(5):155-215(1993年5月))；和hygro，产生潮霉素抗性(santerre等，1984，gene，30:147)。重组dna技术领域已知的可使用方法描述于ausubel等，current protocols in molecular biology(《新编分子生物学实验指南》)，纽约州的约翰韦利父子公司(john wiley&sons，ny)(1993)；kriegler，gene transfer and expression，a laboratory manual(“基因转移和表达，实验室手册”)，纽约的斯托克顿出版社(stockton press)(1990)；dracopoli等(编)(1994)current protocols in human genetics(《新编人类遗传学实验指南》)(纽约州的约翰韦利父子公司)，第12和13章；colberre-garapin等(1981)j.mol.biol.150:1，通过引用将其全文纳入本文。
[0222]
可通过载体扩增提高抗体分子的表达水平(综述参见bebbington和hentschel，“the use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in dna cloning”(在dna克隆中使用基于基因扩增的载体在哺乳动物细胞中表达克隆的基因)，(纽约州的学术出版社(academic press)))，第3卷。当表达抗体的载体系统中的标记可扩增时，提高宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平会增加标记基因的拷贝数。由于扩增区域与抗体基因相连，所以也会提高抗体的产量(crouse等，mol.cell.biol.3:257(1983))。
[0223]
体外生产允许按比例放大规模产生大量所需多肽。本领域已知在组织培养条件下用于哺乳动物细胞培养的技术，其包括均匀悬液培养，例如，在气升式反应器中或在连续搅拌反应器中，或固定或包埋的细胞培养，例如，在中空纤维，微胶囊，琼脂糖微珠或陶瓷盒中。如果必要和/或需要，多肽溶液可通过常规色谱法进行纯化，例如，在优选生物合成合成绞链区多肽之后或者在本文所述的hic色谱步骤之前或之后，进行如凝胶过滤、离子交换色谱、deae-纤维素色谱或(免疫-)亲和性色谱。
[0224]
编码本发明抗-ilt7抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的基因也可在非哺乳动物细胞，如昆虫细胞、细菌细胞、酵母细胞或植物细胞中表达。易于摄入核酸的细菌包括肠杆菌科成员，例如大肠杆菌(escherichia coli)或沙门菌属(salmonella)菌株；芽孢杆
菌科(bacillaceae)，如枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)；肺炎球菌(pneumococcus)；链球菌(streptococcus)和流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae)。将会进一步理解的是，当表达于细菌时，异源多肽通常成为包涵体的一部分。必需将异源多肽分离、纯化，然后组装进功能性分子。需要抗体的四价形式时，亚基随后会自组装成四价抗体(wo 02/096948a2)。
[0225]
在细菌系统中，可根据所表达抗体分子的指定应用对许多表达载体进行有利地选择。例如，要生成大量这类蛋白质时，为了产生抗体分子的药物组合物，可能需要能够指导易于纯化的融合蛋白产物高水平表达的载体。这类载体包括但不限于：大肠杆菌表达载体pur278(ruther等,embo j.2:1791(1983))，其中抗体编码序列可单独连接到载体内，与lacz编码区位于同一读框内，以产生融合蛋白；pin载体(inouye和inouye,nucleic acids res.13:3101-3109(1985)；van heeke和schuster,j.biol.chem.24:5503-5509(1989))；等。也可采用pgex载体表达外来多肽作为有谷胱甘肽-s-转移酶(gst)的融合蛋白。通常，这类融合蛋白可溶，并可通过吸附和结合于基质谷胱甘肽琼脂糖珠然后在游离谷胱甘肽存在下洗脱而容易地从裂解细胞中纯化。pgex载体设计成包含凝血酶或因子xa蛋白酶切割位点，从而能从gst部分释放克隆的靶基因产物。
[0226]
除原核生物外，还可使用真核微生物。酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)或常见的面包酵母是最常使用的真核微生物，尽管许多其它菌株市售可得，例如巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)。
[0227]
为了在酵母(saccharomyces)中表达，常常使用例如质粒yrp7(stinchcomb等，nature 282:39(1979)；kingsman等，gene 7:141(1979)；tschemper等，gene 10:157(1980))。这种质粒已经含有trp1基因，其为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变菌株如atcc编号44076或pep4-1(jones，genetics 85:12(1977))提供选择标记物。然后作为酵母宿主细胞基因组特征的trp1损伤的存在提供了通过在色氨酸不存在的情况下生长而检测转化的有效环境。
[0228]
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾(autographa californica)核多面体病病毒(acnpv)通常用作表达外来基因的载体。该病毒在草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda)细胞中生长。可将抗体编码序列单独克隆到病毒的非必需区(如多角体蛋白基因)中，并置于acnpv启动子(如多角体蛋白启动子)的控制下。
[0229]
本发明的结合分子一旦重组表达后，可通过本领域已知的任何免疫球蛋白分子纯化方法进行纯化，例如，通过色谱(如离子交换色谱，亲和性色谱，特别是在蛋白a之后对特定抗原的亲和性色谱，以及大小筛分柱色谱)、离心、差异溶解度或任何其它蛋白质纯化标准技术。或者，提高本发明抗体亲和性的有益方法公开于美国专利申请公开号2002 0123057 a1。
[0230]
vii.使用治疗性抗-ilt7结合分子的治疗方法
[0231]
本发明的方法涉及使用抗-ilt7结合分子如抗体治疗患者，所述抗体包括其抗原结合片段、变体和衍生物，所述患者有与ilt7表达细胞如ilt7-表达细胞相关的疾病。“ilt7-表达分子”指表达ilt7抗原的细胞。检测细胞中ilt7表达的方法是本领域已知的并且包括但不限于pcr技术、免疫组织化学、流式细胞术、western印迹、elisa等。
[0232]
尽管下述讨论涉及使用本发明抗-ilt7抗体的多种疾病和失调的诊断方法和治
疗，但本文所述方法也可应用于保持本发明抗-ilt7抗体所需的特性(例如能够特异性结合ilt7并中和ilt7致病活性)的抗-ilt7抗体的抗原结合片段、变体和衍生物。
[0233]
在一实施方式中，治疗包括将本发明抗-ilt7结合分子例如本文发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物应用于或给予对象或患者，或将抗-ilt7结合分子应用于或给予由对象或患者分离的组织或细胞系，其中所述对象或患者患有疾病、疾病症状或有疾病倾向。在另一实施方式中，治疗还意在包括将含抗-ilt7结合分子如本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的药物组合物应用于或给予对象或患者，或将包含抗-ilt7结合分子的药物组合物应用于或给予由对象或患者分离的组织或细胞系，其中所述对象或患者有疾病、疾病症状或有疾病倾向。
[0234]
抗-ilt7结合分子，如本发明的抗体或其结合片段、变体或衍生物能够用于治疗各种自身免疫性病症。例如，用至少一种抗-ilt7抗体进行治疗引起生理响应，例如，减少干扰素，这对人体中ilt7表达细胞相关性疾病状态的治疗有益。
[0235]
在一个实施方式中，本发明涉及用作药物，具体是用于治疗或预防自身免疫性病症或疾病的抗-ilt7结合分子，例如，抗体或其结合片段、变体或衍生物。自身免疫性疾病的例子包括但不限于：肌炎、糖尿病、桥本病、自身免疫性肾上腺皮质功能不全、真性红细胞性贫血、多发性硬化、类风湿性心脏炎、系统性红斑狼疮、牛皮癣、类风湿性关节炎、慢性炎症、舍格伦综合征、多肌炎、皮肌炎，包括体肌炎、少年肌炎和硬皮病。
[0236]
按照本发明的方法，利用本文另述的至少一种抗-ilt7结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物促进对于自身免疫应答的阳性治疗响应。关于自身免疫治疗的“阳性治疗响应”指与这些结合分子(如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)活性有关的疾病改善，和/或与疾病相关症状的改善。也就是，可以观测到降低干扰素-α水平，减少浆细胞样树突细胞的数量或活性，或减少与疾病相关的一种或多种症状。因此，例如，疾病改善的特征在于完全响应。“完全响应”指归一化任何之前测试结果时，不存在临床上可检测的疾病。这样的响应在根据本发明的方法的治疗后必需持续至少一个月。或者，疾病改善可分类为部分响应。
[0237]
抗-ilt7结合分子，如本文所述抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物也可用于治疗与ilt7表达细胞相关的免疫系统缺陷或失调以及自身免疫性疾病。自身免疫性疾病通过对象对其自身的细胞、组织和/或器官的免疫反应而引起的细胞、组织和/或器官损伤表征。在一实施方式中，自身免疫性疾病是系统性红斑狼疮。
[0238]
可利用筛选技术评估临床响应，如磁共振成象(mri)扫描、x-射线成像、计算机断层成像(ct)扫描、流式细胞术或荧光活化细胞分选仪(facs)分析、组织学分析、大体病理学分析和血液化学分析，包括但不限于可通过elisa、ria、色谱等检测到的改变。除这些阳性治疗响应外，接受抗-ilt7结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物治疗的对象可产生疾病相关症状改善的有益效果。
[0239]
本发明的另一实施方式是使用抗-ilt7结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)诊断性监测组织中的蛋白质水平作为临床测试步骤的一部分，例如用于确定给定治疗方案的功效。例如，将抗体与可检测物质偶联可利于检测。可检测物质的例子包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链
霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适荧光材料的例子包括：伞形花内酯、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺；生物发光材料的例子包括：萤光素酶、萤光素和发光蛋白；合适的放射性材料的例子包括
125
i、
131
i、
35
s或3h。
[0240]
viii.药物组合物和给药方法
[0241]
本领域技术人员熟知或不难确定本文所提供的制备和给予抗-ilt7结合分子(如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的方法。
[0242]
如本文讨论，可以药学有效量给予抗-ilt7结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)，用于体内治疗ilt7-表达细胞介导的疾病，如特定类型的自身免疫性疾病。在这方面，应理解，将配制本发明公开的结合分子以利于给药并提高活性物质的稳定性。根据本发明的药物组合物可以包括药学上可接受的、无毒性的、无菌运载体。出于本技术目的，偶联或未偶联的抗-ilt7结合分子如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的药学有效量应认为指足以实现有效结合靶标和足以实现某一益处例如改善病症或失调症状或者检测物质或细胞的量。
[0243]
适合注射的药物组合物应该是无菌的并应该是易于注射的流体。它应该在制造和储存条件下稳定，并且受益于抵抗微生物如细菌和真菌的污染作用而保存。可以通过各种抗细菌剂或抗真菌剂实现微生物作用的预防。适用于本文所述治疗方法的制剂可参见《雷明顿药物科学》(remington's pharmaceutical sciences)(马克出版公司(mack publishing co.))第16版(1980)。
[0244]
在本发明范围内，本发明抗-ilt7抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可按照上述治疗方法给予人或其它动物，其给予量足以产生疗效。本发明的抗-ilt7抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以常规剂型给予所述人或其它动物，该剂型根据已知技术通过将本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物与常规的药学上可接受运载体或稀释剂合并来制备。本领域技术人员应认识到，药学上可接受运载体或稀释剂的形式和特点由混合的活性成分含量、给药途径和其它熟知变量决定。本领域技术人员还将进一步理解，包含本发明的一种或多种抗-ilt7结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的混合物可证明为特别有效。
[0245]“治疗有效剂量或治疗有效量”或者“有效量”指给予时，在患有待治疗疾病或病症患者的治疗方面带来阳性治疗响应的抗-ilt7结合分子(如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的用量。
[0246]
用于治疗ilt7-表达细胞介导的疾病(如特定类型的自身免疫性疾病，例如系统性红斑狼疮)的本发明的组合物的治疗有效剂量根据多种不同因素而变化，包括给药方式、靶标部位、患者生理状态、患者是人或是动物、给予的其它药物和该治疗是预防性治疗或是治疗性治疗。通常，患者是人，但也可治疗非人哺乳动物(包括转基因哺乳动物)。可以对治疗剂量进行滴定以优化安全性和功效。
[0247]
本发明还提供抗-ilt7结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)在制造用于治疗自身性免疫病的药物中的应用，所述疾病包括例如系统性红斑狼疮。
[0248]
ix.诊断
[0249]
本发明进一步提供在诊断ilt7-表达细胞介导的疾病(如特定类型的自身免疫性
疾病，包括例如系统性红斑狼疮)期间使用的诊断方法，所述诊断方法涉及测量来自个体的组织或其它细胞或体液中ilt7蛋白或转录本的表达水平，并将测得的表达水平与正常组织或体液中的标准的ilt7表达水平作比较，从而相较标准的表达水平上升表明存在疾病。
[0250]
使用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法(例如参见jalkanen,等,j.cell.biol.101:976-985(1985)；jalkanen等,j.cell biol.105:3087-3096(1987))，本发明的抗-ilt7抗体及其抗原结合片段、变体和衍生物可以用于在生物样品中测定ilt7蛋白水平。用于检测ilt7蛋白表达的其它基于抗体的方法包括免疫实验，如酶联免疫吸附实验(elisa)、免疫沉淀或蛋白质印迹。本文它处更详细描述了合适的试验。
[0251]“测定ilt7多肽表达水平”指对第一生物样品中的ilt7多肽水平以直接(例如，通过测定或估计绝对蛋白质水平)或相对(例如，通过与第二生物样品中的疾病相关多肽水平作比较)方式进行定性或定量测定或估计。可以测量或估计第一生物样品中的ilt7多肽表达水平，并与标准ilt7多肽水平作比较，该标准取自未患该疾病的个体所得的第二生物样品或通过未患该疾病的个体群的平均水平确定。本领域应当理解的是，一旦“标准”ilt7多肽水平为已知，可以将其作为标准重复用于比较。
[0252]“生物样品”指由可能表达ilt7的个体、细胞系、组织培养物或其它细胞来源获得的任何生物样品。从哺乳动物获得组织活检样品和体液的方法为本领域熟知。
[0253]
x.免疫实验
[0254]
可通过本领域的任何已知方法测定抗-ilt7结合分子，例如本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的免疫特异性结合。可使用的免疫实验包括但不限于，使用如下技术的竞争和非竞争实验系统，如蛋白质印迹、放射性免疫实验、elisa(酶联免疫吸附实验)、“夹心”免疫实验、免疫沉淀实验、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散实验、凝集实验、补体固定实验、免疫放射测定实验、荧光免疫实验、蛋白a免疫实验等等。这类实验是本领域公知的常规实验(参见例如，ausubel等编著,(1994)《新编分子生物学实验指南》(current protocols in molecular biology)(纽约约翰韦利父子公司(john wiley&sons),纽约)第1卷，其通过引用全文纳入本文)。下面简述示范性免疫测定(但不限于此)。
[0255]
此外，本发明的抗-ilt7抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以以组织学方式用于原位检测ilt7蛋白或其保守变体或肽片段(如在免疫荧光、免疫电镜或非免疫性试验中)。原位检测可以通过这样实现：从患者移出组织样本，并向其上施用经标记的抗-ilt7抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，例如，通过将经标记的抗体(或片段)覆盖于生物样品上进行施用。尽管使用这样的程序，但是即有可能检测ilt7蛋白或保守的变体或肽片段存在，还可以检测其在检测的组织中的分布。使用本发明，本领域普通技术人员将容易地认识到，为了实现这样的原位检测，可以对各种各样的组织学方法(如染色过程)中的任意一种进行改变。
[0256]
针对ilt7基因产物或其保守变体或肽片段的免疫试验或非免疫试验通常包括在经可检测标记的抗体存在的情况下孵育样品，所述样品如已经在细胞培养物中孵育的生物流体、组织提取物、新鲜获得的细胞或细胞的裂解物，所述经可检测标记的抗体能够结合ilt7或其保守的变体或肽片段，并且通过本领域熟知的技术中的任意一种检测结合的抗体。
[0257]
可以将生物样品与固相支持物或运载体如硝化纤维或其它固体支持接触并固定
于其上，所述其它固体支持物能够固定细胞、细胞颗粒或可溶性蛋白。所述支持物然后能用合适的缓冲液洗涤，随后用经可检测标记的抗-ilt7抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物处理。然后可以用缓冲液第二次洗涤固相支持物以去除未结合的抗体。任选地，然后标记抗体。然后，可通过常规方式检测所述固体支持物上结合的标记量。
[0258]“固相支持物或运载体”指能够结合抗原或抗体的任何支持物。熟知的支持物或运载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、右旋糖苷、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿。出于本发明的目的，运载体的性质可以是一定程度可溶的或是不可溶的。支持物材料实际上可以具有任何结构构造，只要偶联的分子能够结合抗原或抗体即可。因此，支持物构造可以是球形的，如珠，或圆柱形，如在试管的内表面中，或杆的外表面。或者，该表面可以是平面，例如片层，测试条等。示例性的支持物包括聚苯乙烯珠。本领域技术人员将知晓用于结合抗体或抗原的许多其它合适的运载体，或将能够采用常规实验确定此类载体。
[0259]
可以按照熟知方法确定给定批次的抗-ilt7抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的结合活性。本领域技术人员将能够通过进行常规实验确定针对各测定的操作性且优选的试验条件。
[0260]
可通过竞争性结合实验测定抗体与抗原的结合亲和性和抗体-抗原相互作用的解离速率。竞争性结合实验的一个例子是放射性免疫实验，包括在含量递增的未标记抗原存在下用感兴趣抗体培育标记抗原(如3h或
125
i)和检测结合于标记抗原的抗体。可通过scatchard作图分析的数据确定感兴趣的抗体与特定抗原的亲和性和结合解离速率。也可利用放射性免疫实验确定与第二抗体的竞争。在该情况下，在含量递增的未标记第二抗体存在下用偶联于标记化合物(如3h或
125
i)的感兴趣抗体孵育抗原。
[0261]
有各种方法可用于测定抗体-抗原相互作用的亲和性，但测定速率常数的相对较少。大多数的方法依赖于对抗体或抗原进行标记，其不可避免地使常规实验复杂化并且在测定量中引入不确定性。
[0262]
与测定抗体-抗原相互作用亲和性的常规方法相比，用进行的表面等离振子共振(spr)提供若干优点：(i)无需标记抗体或抗原；(ii)抗体不需要事先纯化，细胞培养物上清液可直接使用；(iii)实时测定，能够快速半定量地比较不同单克隆抗体相互作用，能够且足以用于许多评价目的；(iv)生物特异性表面可再生，从而能容易地在相同条件下比较一系列不同单克隆抗体；(v)分析步骤完全自动化，大量测定可以在没有操作人员干预的情况下进行。biaapplications handbook(《bia应用手册》)，ab版(1998再版)，编号br-1001-86；biatechnology handbook(《bia技术手册》)，ab版(1998再版)，编号br-1001-84。基于spr的结合研究需要结合对中的一个成员固定于传感器表面。固定的结合伴侣称之为配体。溶液中的结合伴侣称之为分析物。在某些情况下，配体通过结合被称为捕获分子的另一固定分子而间接地连接于表面。spr响应反映出随着分析物结合或解离，检测器表面上质量浓度的改变。
[0263]
根据spr，实时测定直接监测正在发生的相互作用。该技术非常适合确定动力学参数。比较亲和性排序简单易行，动力学和亲和性常数都可获自传感图数据。
[0264]
以独立脉冲在配体表面上注射分析物时，所得的传感器图可分成三个基本相：(i)
样品注射期间分析物与配体的结合；(ii)样品注射期间平衡或稳态，其中分析物结合速率通过从复合物解离达到平衡；(iii)缓冲液流动期间分析物与表面解离。
[0265]
结合和解离相提供有关分析物-配体相互作用的动力学信息(ka和kd是复合物形成和解离的速率，kd/ka＝kd)。平衡相提供有关分析物-配体相互作用亲和性(kd)的信息。
[0266]
bia评估软件提供综合的曲线拟合工具，其采用数值积分和全局拟合算法。通过对数据进行适当的分析，可由简单研究获得相互作用的分离速率和亲和性常数。可通过此种技术测定的亲和性范围非常宽泛，从mm级到pm级。
[0267]
表位特异性是单克隆抗体最重要的特征。与采用放射性免疫实验、elisa或其它表面吸附方法的常规技术不同，用进行表位作图不需要标记或纯化的抗体，并允许用若干单克隆抗体的序列进行多位点特异性测试。此外，可以自动处理大量分析物。
[0268]
逐对结合实验测试两种mab同时结合同一抗原的能力。针对单独表位的mab将独立结合，而针对相同或紧密相关表位的mab将互相干扰结合。采用的这些结合实验简单易行。
[0269]
例如，可使用捕获分子结合第一种mab，随后依次加入抗原和第二种mab。传感图将揭示：(1)有多少抗原结合第一mab，(2)第二mab结合表面连接抗原的程度，(3)如果第二mab没有结合，改变逐对测试的顺序是否改变结果。
[0270]
肽抑制是用于表位作图的另一种技术。该方法可以补足逐对抗体结合研究，并且当已知抗原一级序列时可以将功能性表位与结构特征关联。测定肽或抗原片段对不同mab与固定抗原结合的抑制作用。假定干扰给定mab结合的肽与该mab限定的表位在结构上相关。
[0271]
除非另有说明，本发明的实施将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组dna和免疫学的常规技术，它们均在本领域技术范围内。这些技术在文献中已有充分描述。参见例如，sambrook等编(1989)molecular cloning a laboratory manual(《分子克隆：实验室手册》)(第2版；冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press))；sambrook等编(1992)molecular cloning:a laboratory manual(《分子克隆：实验室手册》)，(纽约州的冷泉港实验室出版社(cold springs harbor laboratory，ny))；d.n.glover编，(1985)dna cloning(《dna克隆》)，第i和ii卷；gait编(1984)oligonucleotide synthesis(《寡核苷酸合成》)；mullis等，美国专利号4,683,195；hames和higgins编(1984)nucleic acid hybridization(《核酸杂交》)；hames和higgins编(1984)transcription and translation(《转录和翻译》)；freshney(1987)culture of animal cells(《动物细胞培养》)(arl公司(alan r.liss))；immobilized cells and enzymes(《固定的细胞和酶》)(irl出版社)(1986)；perbal(1984)a practical guide to molecular cloning(《分子克隆实践指南》)；论文，methods in enzymology(《酶学方法》)(学术出版社公司(academic press)，纽约州)；miller和calos编(1987)gene transfer vectors for mammalian cells(《哺乳动物细胞的转基因载体》)(冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory))；wu等编，methods in enzymology(《酶学方法》)，第154和155卷；mayer和walker编(1987)immunochemical methods in cell and molecular biology(《细胞和分子生物学中的免疫化学方法》)(学术出版社(academic press)，伦敦)；weir和blackwell编(1986)handbook of experimental immunology(《实验免疫学手册》)，
第i-iv卷；manipulating the mouse embryo(《小鼠胚胎操作》)，纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory，cold spring harbor，n.y.)，(1986)；和ausubel等(1989)current protocols in molecular biology(《新编分子生物学实验指南》)(马里兰州巴尔的摩的约翰韦利父子公司(john wiley&sons，baltimore，md.))。
[0272]
抗体工程的一般原理可参见borrebaeck编(1995)antibody engineering(《抗体工程》)(第2版；牛津大学出版社(oxford univ.press))。蛋白质工程的一般原理可参见rickwood等编(1995)protein engineering，a practical approach(《蛋白质工程，实践方法》)，(英国牛津的牛津大学出版社的irl出版公司(irl press at oxford univ.press，oxford，eng.))。抗体和抗体-半抗原结合的一般原理可参见：nisonoff(1984)molecular immunology(《分子免疫学》)(第2版；马萨诸塞州桑德兰的辛奥尔联合公司(sinauer associates，sunderland，mass.))；和steward(1984)antibodies,their structure and function(《抗体的结构和功能》)(chapman和hall，纽约州纽约市)。此外，本领域已知且没有具体描述的免疫学标准方法通常按照下述文献所述进行：current protocols in immunology(《新编免疫学实验指南》)，纽约州的约翰韦利父子公司(john wiley&sons)；stites等编(1994)basic and clinical immunology(《基础和临床免疫学》)(第8版；appleton和lange，康涅狄格州的诺沃克(norwalk，conn.))和mishell和shiigi(编)(1980)selected methods in cellular immunology(《细胞免疫学的选用方法》)(w.h.弗里曼公司(w.h.freeman and co)，纽约州)。
[0273]
列出免疫学通用原理的标准参考文献包括：current protocols in immunology(《新编免疫学实验指南》)，约翰韦利父子公司(john wiley&sons)，纽约州；klein(1982)j.，immunology:the science of self-nonself discrimination(《免疫学：自身-非自身区别的科学》)(约翰韦利父子公司，纽约州)；kennett等编(1980)monoclonal antibodies,hybridoma:a new dimension in biological analyses(《单克隆抗体，杂交瘤：生物学分析的新领域》)(普莱努公司(plenum press)，纽约州)；campbell(1984)"monoclonal antibody technology"in laboratory techniques in biochemistry and molecular biology"(《生化和分子生物学实验室技术》中的“单克隆抗体技术”)，burden等编(的埃尔斯威尔公司(elsevere)，阿姆斯特丹)；goldsby等编(2000)kuby immunnology(《库比免疫学》)(第4版；h.弗里曼公司(h.freemand&co.))；roitt等(2001)immunology(《免疫学》)(第6版；伦敦：摩兹比公司(mosby))；abbas等(2005)cellular and molecular immunology(《细胞和分子免疫学》)(第5版；埃尔斯威尔健康科学分公司(elsevier health sciences division))；kontermann和dubel(2001)antibody engineering(《抗体工程》)(施普林格公司(springer verlan))；sambrook和russell(2001)molecular cloning:a laboratory manual(《分子克隆：实验室手册》)(冷泉港出版社(cold spring harbor press))；lewin(2003)gene viii(《基因viii》)(普伦蒂斯霍尔出版社(prentice hall)2003)；harlow和lane(1988)antibodies:a laboratory manual(《抗体：实验室手册》)(冷泉港出版社)；dieffenbach和dveksler(2003)pcr primer(《pcr引物》)(冷泉港出版社)。
[0274]
将上文中引用的所有参考文献以及其中引用的所有参考文献通过引用全文纳入本文。
[0275]
通过说明的方式，而非限制性方式提供以下实施例。
实施例
[0276]
材料和方法
[0277]
生物样品
[0278]
来自正常健康志愿者的人外周血通过米迪缪尼公司(medimmune)献血者计划获得，并由irb获得书面知情同意和批准。使用具有柠檬酸钠(美国新泽西州的bd公司(becton dickinson biosciences))的真空(vacutainer)cpt细胞制备管由新鲜全血分离外周血单核细胞(pbmc)。将管以最小制动、17000g、22℃旋转25分钟。旋转后，除去血清，将细胞棕黄层转移到50ml锥形管(bd生物科学公司(bd biosciences))中。用无菌磷酸盐缓冲盐水(pbs)(英杰生命技术公司(invitrogen life technologies))350g在22℃下两次洗涤纯化的细胞10分钟。将细胞重悬于补充有10％胎牛血清(英杰公司(invitrogen))的pbs或rpmi 1640培养基，然后使用具有细胞过滤器盖的bd falcon 5ml管(bd生物科学公司)过滤。采用vi-cell 细胞计数器(美国加利福尼亚州富勒敦的贝克曼库尔特公司(beckman coulter))测定细胞密度。。
[0279]
按照美国国家灵长动物护理和使用健康中心(national institutes of health for care and use of primates)的指南，由bioqual(美国马萨诸塞州bioqual有限公司(bioqual))获得来自健康动物的食蟹猴外周血。使用具有柠檬酸钠(如上所述)或具有histopaque 10771(美国密苏里州的西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich))的真空cpt细胞制备管分离食蟹猴pbmc。简言之，用无菌pbs将新鲜全血调节至50x初始血液体积。然后，将25ml稀释的血液覆盖于10ml的90％histopaque 10771(西格玛奥德里奇公司)上，并且将样品于室温、最小制动、400g旋转20分钟。去除细胞盘，并转移至新的50ml锥形管。用350g无菌pbs在22℃两次洗涤纯化的细胞10分钟。将细胞重悬于补充有10％胎牛血清的pbs或rpmi 1640培养基中，过滤并计数，如上所述。
[0280]
细胞
[0281]
ct-125和ct-550细胞获得自yong-jun liu博士(美国德克萨斯州休斯顿德克萨斯大学m.d.anderson癌症中心)。ct-125细胞通过用无标记的fcεr1γ和nfat-gfp受体基因转导2b4鼠t细胞杂交瘤生成，而ct-550细胞通过用ha-标记的人ilt7转导ct-125细胞生成(ohtsuka m.等,pnas 101:8126-8131(2004)；cao w.等,jem 203:1399-1405页(2006))。ct-125cyno ilt7稳定细胞系通过用克隆到pme18x质粒载体的食蟹猴ilt7基因转染ct-125细胞生成。ct细胞培养于补充有10％胎牛血清(fbs)和1x青霉素/链霉亲和素(所有均来自英杰生物计数公司)的rpmi 1640中。
[0282]
由波娃公司(美国新泽西州波娃公司(biowa))获得kc1333细胞。在补充有10％fbs，4mm l-谷氨酰胺，0.2μg/ml遗传霉素(均来自英杰公司)和18.3pg/ml重组人il-2(peprotech公司，美国新泽西州)的advance rpmi 1640中培养kc1333细胞。
[0283]
抗体和试剂：
[0284]
抗-ilt7人源化抗体变体、抗-ilt7克隆7c7(7c7)和人的同种型对照r347在米迪缪尼公司生产。偶联抗-ilt7人源化抗体变体、7c7、同种型对照r347的别藻蓝蛋白(apc)使用apc单克隆抗体标记试剂盒(美国伊利诺伊州赛默飞世尔科学有限公司(thermo fisher scientific))生产。r-藻红蛋白(pe)和fitc-标记的抗-人bdca-2抗体(克隆ac144)、r-pe抗-人bdca-4(克隆ad5-17f6)和人fcr阻断试剂来自美国加利福尼亚州美天旎生物技术公
司(miltenyi biotech)。偶联r-pe、fitc或apc的抗-人cd123(克隆7g3)，alexa fluor 488抗-人cd8(克隆rpa-t8)，alexa fluor 488抗-人cd3(克隆sp34-2)，fitc抗-人cd14(克隆m5e2)，fitc抗-人cd20(克隆2h7)和percp-cy 5.5抗-人hla-dr(克隆g46-6)获自bd生物科学公司。太平洋蓝抗-人cd56抗体(克隆mem-188)获自美国加利福尼亚州生物传奇公司(biolegend)。dylight 649-标记的抗-人igg和人完整igg来自美国宾夕法尼亚的杰克逊免疫研究公司(jackson immunoresearch)。
[0285]
使用bd facs裂解溶液(bd生命科学公司)进行全血染色。由英杰公司获得7-aad。人雄性ab血浆来自西格玛-奥德里奇公司。重组人il-2来自美国明尼苏达州的r&d系统公司(r&d systems)，而重组人干扰素β(ifn-β)来自美国新泽西州的pbl生物医疗公司(pbl biomedical)。cpg a odn 2216来自美国加利福尼亚州的英韦沃基公司(invivogen)。
[0286]
标记人和食蟹猴重组ilt7
[0287]
使用ez连接的磺基-nhs-lc-生物素(赛默科技公司/pierce，产品号21335)通过游离胺将蛋白质生物素化。将试剂溶解于无水二甲基甲酰胺中，并用在d-pbs中的1m nahco3将基于pbs的蛋白质溶液调节至ph～8。
[0288]
在所有情况下通过maldi-tof质谱分析法评估标记掺入，并使用d-pbs平衡的一次性sephadex g25柱通过缓冲液交换清除未反应的试剂。对于生物素化，使用从氨基酸序列计算的消光系数通过280nm吸光度确定最终蛋白质浓度。
[0289]
elisa结合试验
[0290]
单链fv片段在噬菌体颗粒上展示并在结合试验中测试以确定一组重组抗原的交叉反应性和特异性。如下在96孔深孔板上产生噬菌体展示的scfv上清液样品。将来自96孔主板各孔的5μl培养物转移到含500μl的2tyag(2ty 100μg/ml氨苄青霉素 2％葡萄糖)培养基的葛莱娜(greiner)深孔培养板中，并于37℃、280rpm孵育5小时。然后以100μl/孔添加k07 m13辅助噬菌体(在2tyag中稀释至1.5x10
11
pfu/ml)，然后将板以37℃、150rpm孵育以允许感染。将板以3200rpm离心10分钟，随后去除上清液。将细菌沉淀重悬于500μl/孔的2tyak(2ty 100μg/ml氨苄青霉素 50μg/ml卡纳毒素)，然后将板以25℃、280rpm过夜孵育。在早晨，将500μl的2x pbs中的6％(w/v)脱脂奶粉添加到各孔，并且将板在室温下孵育1小时。然后将板以3200rpm离心10分钟，而阻断的噬菌体展示的scfv上清液直接用于elisa实验。
[0291]
对于ec50测定，通常将纯化的igg在pbs中的3％(w/v)干奶粉(pbs-m)中稀释3倍，以得到11个浓度点。96孔的葛莱娜聚丙烯板(葛莱娜，650201)用于稀释制备。通常，每种稀释物一式两份制备。允许igg稀释物在直接用于elisa实验前在室温下封闭于pbs-m中1小时。
[0292]
il-t7结合试验是基于板的elisa，基本上如下进行。并非所有抗原都用于每个实验，但通常测试人、小鼠和食蟹猴il-t7抗原。也使用相关的对照抗原(牛胰岛素加il-4rα如果适用)测试非特异性结合。除牛胰岛素外，所有抗原都是生物素化的，所有抗原均使用细菌表达产生。使用ez连接生物素-bmcc(perbio/pierce 21900)通过游离的巯基将il-t7抗原生物素化。用于生成用作对照抗原的il-4rα描述于wo/2010/070346。使用ez连接磺基-nhs-lc-生物素(perbio/pierce,21335)通过游离的胺将il-4rα生物素化。
[0293]
用pbs中0.5μg/ml生物素化抗原涂覆链霉亲和素板(赛默科技公司，ab-1226)，然后以4℃过夜孵育。用pbs洗板3次，然后用300μl/孔阻断缓冲液(pbs-m)封闭1小时。用pbs洗涤板1次并添加阻断的样品，室温下50μl/孔持续1小时。用pbs-t(pbs 1％(v/v)吐温-20)洗板3次，并将检测试剂[抗-人igg hrp(西格玛公司，a0170)或抗-m13-hrp抗体(安马西亚公司(amersham)，27-9421-01)，用于分别检测igg或噬菌体展示的scfv]的1:5000稀释物在室温下以50μl/孔添加于pbs-m中1小时。板在pbs-t中洗涤3次，并用50μl/孔的tmb(西格玛(sigma)，t0440)显色。用50μl/孔0.1m h2so4将反应淬火，然后在envision
tm
酶标仪或相似的设备上在450nm处读取。
[0294]
使用prism(图垫公司(graphpad))曲线拟合软件绘制针对igg滴定的剂量应答曲线。如果450nm吸光度》0.5，那么认为噬菌体展示的scfv将结合il-t7抗原，而对于对照(胰岛素和il-4rα)的相同样品，450nm吸光度《0.1-0.2。单链fv片段展示于噬菌体颗粒上，并于单点elisa筛选中作为未纯化的制剂进行测试。
[0295]
荧光微量体积测定技术(fmat)细胞结合试验
[0296]
该均相测定评估以384孔(克斯塔(costar)3655)的形式的粗scfv上清液样品或纯化的igg与中国仓鼠卵巢(cho)细胞的结合，所述cho细胞表达人或食蟹猴ilt7。分别使用鼠抗-his/山羊抗-鼠标记的抗体(分子探针公司(molecular probes)a21236)混合物或山羊抗-人标记的抗体(分子探针公司a21445)检测结合细胞的scfv或ab。在应用生物系统公司(applied biosystems)细胞检测系统8200读数器上读取板。氦氖激发激光聚焦于孔底100μm的深处，扫描1mm2的区域。细胞沉积于孔的底部，并且在633nm激光的激发下，那些具有荧光团结合的珠(其中荧光团的局部浓度比未结合的荧光团相对高)在650-685nm处发射信号，这使用光电倍增管-1(pmt1)测量。溶液中未结合的荧光团在激发深度之外或处于相对低的局部浓度，因此不发射显著的信号。存在结合位于孔底细胞的scfv或igg样品导致在激发深度内alexafluor-标记的检测抗体的增加。这被测量为荧光增加。
[0297]
在这些实验中，试验缓冲液是含有0.1％bsa(西格玛a9576
–
50ml)、0.1％吐温-20(西格玛p2287)和0.01％叠氮化钠的pbs(吉布可公司(gibco)14190-094)。为了生成scfv检测混合物，鼠抗-his和抗-鼠af647抗体分别以1ug/ml和2ug/ml混合在试验缓冲液中。为了生成igg检测混合物，抗-人af647抗体以2ug/ml在试验缓冲液中制备。
[0298]
使用的细胞是表达人或食蟹猴ilt7的cho-k1细胞，其使用标准组织培养技术培养。细胞在f-10(吉布可公司，22390-025) 10％fcs(safc生物科学公司(safc biosciences)，13068c) 0.5mg/ml博莱霉素(英杰公司，r250-01)中生长至大约80％传代，用pbs洗涤，用细胞消化酶(accutase)(paa，l11-007)分离，并以1.5x105细胞/ml重悬于pbs。
[0299]
在96深孔板中制备粗scfv上清液样品。将来自96孔主板各孔的5μl培养物转移到含900μl的2ty(1.6％胰蛋白胨,1％酵母提取物,0.5％nacl，ph 7.0) 100μg/ml氨苄青霉素 0.1％葡萄糖培养基的葛莱娜深孔培养板中，并于37℃、280rpm孵育5小时。然后以100μl/孔添加ty中的10mm iptg，并以30℃、280rpm过夜孵育该区块。在早晨，将区块以3200rpm离心15分钟。对于高通量筛选，将来自深孔区块的scfv上清液直接转移至试验版供于所需的
20％稀释。
[0300]
向384孔透明底非结合表面黑色costar板的测试孔中添加如下所述内容：10μl样品(igg或scfv)，10μl检测抗体或抗体混合物，和30μl细胞。这些实验中所用阴性对照通常涉及添加同种型(igg)或不相关(scfv)对照，或替换实验样品的试验缓冲液。将板密封并在黑暗中孵育4小时，然后在应用生物系统公司细胞检测系统8200读数器上读取。通常用速率(velocity)算法分析数据，并将门选设置为颜色比《0.4、尺寸15-30和最小计数(min count)20。来自粗scfv上清液样品的命中(hit)定义为相比总结合对照孔显示50％或更高的信号抑制。使用prism(图垫公司(graphpad))曲线拟合软件绘制针对纯化的igg滴定的剂量应答曲线。
[0301]
对于ic50测定，通常将纯化的igg在试验缓冲液中从500nm稀释2倍，以得到11个浓度点。96孔的葛莱娜聚丙烯(葛莱娜，650201)板用于稀释制备。通常，每种稀释物一式两份制备。或者，在取自范围500nm
–
0.2nm的单个浓度进行igg测试。
[0302]
通过流式细胞术评估细胞系上的抗体结合
[0303]
抗-ilt7变体和同种型对照对人和食蟹猴ilt7的结合通过流式细胞术分析分别使用ct-550和cynoilt7 ct-125细胞评估。ct-125细胞用作对照。将细胞以5百万细胞/ml的浓度重悬于封闭缓冲液(补充由10％fbs的pbs)，然后以100μl/孔转移到圆底96孔板(bd falcontm透明微量板，bd生物科学公司)中。在摇床上以4℃将细胞添加于抗-ilt7变体和对照抗体上30分钟。用pbs洗涤细胞3次，然后重悬于封闭缓冲液(100μl/孔)。使用与dylight 649(1:1000稀释)偶联的二抗-人igg抗体检测细胞表面上人igg结合。将细胞在摇床上以4℃黑暗孵育30分钟。用pbs洗涤细胞3次，并使用lsrii流式细胞系统和facsdiva软件(两者都来自bd生物科技公司)获得表面荧光。
[0304]
通过流式细胞术评估全血和pbmc上的抗体结合
[0305]
通过流式细胞术分析评估人和食蟹猴全血上apc标记的抗-ilt7抗体和同种型对照的结合。将全血转移到50ml锥形管中，每管1ml。将apc标记的抗体直接添加到全血中。抗-bdca-2-pe和抗-cd123-pe抗体在人全血染色和食蟹猴全血染色中分别用作浆细胞样树突细胞(pdc)特异性标记物。将全血与抗体在摇床上以4℃黑暗孵育30分钟。根据生产商的说明，用bd facs裂解溶液处理血液。洗涤细胞，并通过使用lsrii流式细胞系统和facsdiva软件的流式细胞术评估抗体结合。
[0306]
对于pbmc染色，首先用pbs洗涤pbmc，并在摇床上以4℃重悬于基于冷pbs的封闭缓冲液中15分钟，所述封闭缓冲液含有50％人雄性ab血浆、20μg/ml人igg和200μl/ml的人fcr封闭试剂。15分钟后，将apc标记的抗-ilt7变体或apc标记的同种型对照抗体直接加入封闭溶液。抗-bdca-2-pe和抗-bdca-4-pe抗体任选地用作人pbmc染色的pdc特异性标记物。在食蟹猴pbmc中，pdc定义为hla-dr 、谱系-、cd11c-和cd123高(malleret等,immunology 124:223-233(2008))。因此，抗-hla-dr percp-cy5.5、谱系-fitc(cd3、cd8、cd20和cd14抗体)和抗-cd123-pe抗体用作食蟹猴pbmc染色的pdc特异性标记物。将pbmc在摇床上以4℃黑暗孵育30分钟。洗涤细胞，并通过使用lsrii流式细胞系统和facsdiva软件的流式细胞术评估抗体结合。
[0307]
通过抗体依赖型细胞介导的细胞毒性(adcc)试验使用细胞系评估抗体效力
[0308]
使用adcc体外基于细胞的试验测定抗-ilt7抗体的效力。kc1333细胞(效应物)和
ct细胞(靶标)以5:1的比例(2.5x105kc1333对于0.5x105ct细胞)于圆底96孔板中共培养。将细胞在存在抗-ilt7抗体或同种型对照的情况下在补充有10％fbs的rpmi 1640培养基中以37℃、5％co2共培养16小时。然后将细胞洗涤并转移至封闭缓冲液(pbs-10％fbs)中。使用太平洋蓝抗-cd56抗体检测kc1333细胞。使用7-aad检测死细胞。靶细胞活力通过使用lsrii流式细胞系统和facsdiva软件的流式细胞术评估。使用以下公式得到细胞毒性的百分比：细胞毒性％＝100
–
(存活靶标的数量/位于基线存活靶标的数量)x 100。
[0309]
通过adcc试验使用人pbmc评估抗体效力
[0310]
用pbs洗涤人pbmc，并将其重悬于rpmi培养基，所述rpmi培养基补充有10％fbs和200ng/ml浓度为5.0x106细胞/ml的重组人il-2。将pbmc一式两份以100μl/孔接种到圆底96孔板中。制备抗-ilt7抗体和对照抗体的10倍连续稀释，并将100μl抗体溶液添加至适当的孔中至33.85nm
–
3.385fm的最终浓度。细胞在37℃，5％co2下孵育6小时。孵育后，将细胞在250μl冷pbs中洗涤两次。将细胞以4℃重悬于100μl基于冷pbs的封闭缓冲液中15分钟，所述基于冷pbs的封闭缓冲液含有50％人雄性ab血浆、20μg/ml人igg和200μl/ml的人fcr封闭试剂。封闭步骤后，将含有fitc-抗-人bdca2和apc-抗-人cd123抗体的100μl冷封闭缓冲液添加到适当的孔。将板在4℃孵育、温和摇晃30分钟。孵育后，将细胞在250μl冷pbs中洗涤2次，最终重悬于200μl冷pbs中。将50μl冷7-aad(英杰)溶液添加至所有孔，而7-aad阳性浆细胞样树突细胞使用lsrii流式细胞系统和facsdiva软件评估。
[0311]
用人pbmc的ifnα分泌试验
[0312]
用pbs洗涤人pbmc，然后将其一式两份以150,000
–
156,000细胞/孔的最终密度接种至圆底96孔板中补充有10％fbs和200ng/ml重组人il-2的rpmi培养基中。制备抗-ilt7抗体和对照抗体的10倍连续稀释，并将100μl抗体溶液添加至适当的孔中至6.77nm
–
0.677fm的最终浓度。细胞和抗体在37℃，5％co2下孵育9.5-10小时。孵育后，将50ul的odn2216(invitrogen
tm
)添加至合适的孔中至0.5μm的最终浓度，并将板进一步在37℃，5％co2下孵育额外的16小时。孵育后，将板以350g离心10分钟，小心地去除上清液，并使用多亚型ifnαelisa试剂盒(pbl生物医疗公司)对ifnα进行定量。
[0313]
用食蟹猴pbmc的ifnα分泌试验
[0314]
用pbs洗涤食蟹猴pbmc，并将其重悬于rpmi 1640培养基，所述rpmi 1640培养基补充有10％fbs、220ng/ml重组人il-2和500iu/ml重组人ifn-β。向具有314,000
–
818,000细胞/孔密度范围的适当孔中添加最大数量的细胞。制备抗-ilt7抗体和对照抗体的10倍连续稀释，并将100μl抗体溶液添加至适当的孔中至33.85nm
–
3.385fm的最终浓度。细胞和抗体在37℃，5％co2下孵育9.5-10小时。孵育后，将50ul的odn2216(invitrogen
tm
)添加至合适的孔中至0.5μm的最终浓度，并将板进一步在37℃，5％co2下孵育额外的16小时。孵育后，将板以350g离心10分钟，小心地去除上清液，并使用恒河猴/食蟹猴ifnαelisa试剂盒(pbl生物医疗公司)对上清液ifnα进行定量。
[0315]
统计学分析
[0316]
使用graphpad prims 5软件(美国加利福尼亚州graphpad软件公司(graphpad software))生成针对结合、adcc和细胞因子分泌试验的ec50和ic50曲线。
[0317]
实施例1
[0318]
由鼠抗体sbi28生成人源化ilt7抗体
[0319]
通过构架改组(framework shuffle)(dall’acqua等,methods 36:43-60(2005))将鼠mab sbi28(sbi28指美国专利公开公开号2009/0280128所提供的抗-ilt7抗体ilt7#28)人源化。使用该方法，鼠mab sbi28通过包含其框内融合的6个cdr的组合文库进行人源化，以汇集个体人种系构架。由公众可及的抗体种系基因库选择人构架基因。这些通用构架引物库包括46个人种系κ链基因、5个人种系jk序列、44个人种系重链基因和6个人种系jh序列。设计引物库以编码各种系基因的各种构架。还用简并末端合成抗体特异性cdr引物，所述简并末端与构架库重叠。sbi28构架改组文库通过将可变重链构架改组亚文库与可变轻链构架改组亚文库配对而构建。构架改组亚文库使用pcr通过重叠延伸顺序地组装。进行第一融合pcr以合成与对应cdr的部分框内融合的各单个人种系构架。然后使用融合pcr产物作为模板进行第二“组装pcr”以扩增全长vh和vl亚文库。使用kunkel杂交诱变方法将sbi28构架改组文库克隆到基于m13的fab表达载体中。来自sbi28构架改组文库的大约1300个克隆使用mesoscale discovery(msd)试验在表达重组ilt7cho-细胞的cho细胞上进行筛选。一个人源化变体10d10以比其嵌合亲本("sbi28ch")低3倍的亲和性结合人ilt7，如proteon上通过表面等离子体共振(spr)所测。sbi28ch表示美国专利公开申请号2009/0280128(通过引用全文纳入本文)中所提供的抗-ilt7抗体ilt7#28。
[0320]
启动10d10的亲和性优化，以改善其对人和食蟹猴ilt7的结合亲和性。将10d10首先克隆到基于m13的scfv表达载体用于简约诱变(parsimonious mutagenesis)。在该方法中，以各残基位置使用两个单独的文库(nss和nws)对所有6个cdr的各单个氨基酸随机突变。使用kunkel杂交诱变方法，针对6个cdr构建总计12个独立的文库(kunkel,t.a.,等methods enzymol.154:367(1987))。筛选合成的文库包括单点elisa，其设计成捕获由细菌培养基分泌的scfv的极限浓度，以将各孔中的scfv浓度标准化。标记的ilt7抗原结合捕获的scfv，而该相互作用的信号强度与相对结合亲和性关联。筛选约2,000至3,000个克隆。为了进一步工程改造具有改善亲和性的变体，将所有有益的单个氨基酸改变一起编码，产生小且聚焦的重组文库。在该步骤中，对6个cdr中位于9个位置的14个个体阳性命中同时编码以建立组合scfv文库。简言之，将简并启动子设计为编码所有有益氨基酸改变以及位于相同位置的亲本残基。用单点捕获elisa如前所述筛选组合文库。筛选约1,200个克隆。将亲和性改善的变体7c7的可变区单独克隆进哺乳动物表达poe载体并瞬时表达于hek293细胞中。分泌的可溶性人igg由条件培养基直接纯化。使用proteon和facs测试纯化的igg对rilt7的结合。在proteon实验中，亲和力优化的抗体7c7显示出比sbi28ch超过约60倍的kd改善。通过fac，其中测量了与表达于cho细胞的重组人和cynoilt7的结合，相较于sbi28ch，7c7对人和食蟹猴ilt7分别展现出了2.2倍和14倍更好的ec50。图1a和1b分别显示了sbi28、10d10和7c7的vh和vl序列比对。
[0321]
实施例2
[0322]
由人文库生成人ilt7抗体
[0323]
除了将鼠抗-ilt7抗体进行人源化(如上述实施例1所述)，使用人序列的文库生成人抗体。采用多种策略生成抗-ilt7抗体将生成具有不同性状的抗-ilt7抗体的机会最大化，因此可以选出用于特定目的的理想抗体。
[0324]
2.1选择
[0325]
使用源自未免疫成年供体骨髓的个体重链可变区和轻链可变区生成大单链fv
(scfv)人抗体文库，将其克隆到基于丝状噬菌体m13的噬菌粒载体用于选择(hutchings,c.,"生成未免疫人的抗体文库(generation ofhuman antibody libraries)"载于《抗体工程(antibody engineering)》,dubel.柏林,施普林格实验室手册(springer laboratory manuals):93页(2001)；lloyd等,protein eng.des.sel.22(3):159-68(2009))。基本如之前vaughan等(nat.biotechnol.14(3):309-14(1996))中所述，以对重组人和/或食蟹猴ilt7的一系列重复选择循环由噬菌体展示文库分离ilt7特异性scfv抗体。简言之，在溶液中用生物素化重组ilt7(使用ez连接的磺基-nhs-lc-生物素(赛默科技公司/pierce，产品号21335)通过游离胺将蛋白质生物素化)孵育scfv噬菌体颗粒。通常，用100nm生物素化的重组ilt7孵育scfv噬菌体颗粒1小时。然后按照生产商的推荐用链霉亲和素包被的顺磁性珠(m-280)捕捉与抗原结合的scfv。未结合的噬菌体在使用pbs-吐温的系列洗涤循环中被洗掉。洗脱保留在抗原上的噬菌体颗粒，感染入细菌并拯救以进行下一轮选择。通常以这种方式进行3轮选择。
[0326]
2.2通过噬菌体elisa鉴定ilt7特异性结合剂。
[0327]
svfv在噬菌体颗粒上展示并在结合试验中测试以确定对重组抗原的交叉反应性和特异性。详细的测定方法参见材料和方法章节。由该结合试验生成了大约2100个不同的数据点，并对鉴定的命中(即显示出结合重组ilt7的scfv克隆)进行dna测序(osbourn等,immunotechnology 2(3):181-96(1996)；vaughan等,nat.biotechnol.14(3):309-14(1996))。
[0328]
2.3通过fmat鉴定ilt7结合剂
[0329]
不同的scfv表达在细菌周质中，并在荧光微量体积测定技术(fmat)结合试验中筛选它们的结合活性。使用山羊抗-鼠标记的抗体检测scfv与表达于细胞表面的ilt7的结合。详细的测定方法参见材料和方法章节。
[0330]
2.4将scfv变型(reformatting)成igg1
[0331]
将最有效的scfv结合剂转变成全免疫球蛋白g1(igg1)抗体形式，基本如persic等(gene 187(1):9-18(1997))所示并具有下述修改。在该表达载体中包括orip片段，以促进cho-瞬时细胞的使用以及允许附加型复制。将vh结构域克隆入含有人重链恒定结构域和调节元件的载体(peu1.3)以在哺乳动物细胞中表达完整的igg1重链。类似地，将vl结构域克隆入表达人轻链(λ)恒定结构域和调节元件的载体(peu4.4)以在哺乳动物细胞中表达完整的igg轻链。为获得igg，将重链和轻链igg表达载体转染入cho-瞬时哺乳动物细胞。igg经表达分泌入培养基。合并收集物，过滤后纯化。然后，采用a蛋白层析纯化igg。将培养物上清液加载于大小合适的a蛋白陶瓷柱(生物谱公司(biosepra))上，用50mm tris-hcl ph 8.0，250mm nacl洗涤。利用0.1m柠檬酸钠(ph 3.0)将结合的igg从柱上洗脱，加入tris-hcl(ph 9.0)中和。利用nap10柱(安玛西亚公司(amersham)，第17-0854-02号)将洗脱物质经缓冲液置换入pbs，利用基于igg的氨基酸序列的消光系数，通过分光光度法测定igg的浓度(mach等,anal.biochem.200(1):74-80(1992))。
[0332]
2.5 igg的结合试验
[0333]
使用fmat结合试验测定抗-ilt7抗体的物种交叉反应性。详细的测定方法参见材料和方法章节。下述11个抗体被鉴定为在fmat筛选试验中成功结合人和食蟹猴ilt7的抗
体：ilt70019、ilt70028、ilt70052、ilt70076、ilt70080、ilt70083、ilt70089、ilt70100、ilt70137、ilt70142和ilt70144。
[0334]
实施例3
[0335]
ilt7抗体结合ilt7-表达细胞
[0336]
为了确定ilt70019、ilt70028、ilt70052、ilt70076、ilt70080、ilt70083、ilt70089、ilt70100、ilt70137、ilt70142和ilt70144在表达人ilt7的细胞上的结合ec50，候选物通过流式细胞术就ct-550细胞的结合进行筛选。ilt70080(ec50＝0.28nm)、ilt70083(ec50＝0.37nm)、ilt70137(ec50＝0.41nm)、ilt70144、ilt70142、ilt70052和ilt70100结合人ilt7-表达细胞。候选物ilt70019、ilt70028和ilt70076不结合人ilt7-表达细胞。抗-ilt7抗体7c7(7c7在上述实施例1中描述)和sbi33(sbi33指抗-ilt7抗体ilt7#33，其提供于美国专利公开申请号2009/0280128中)用作阳性对照。同种型对照r347用作阴性对照，并且不显示对ilt7-表达细胞的任何结合。图2中示出的图表表示来自两个独立实验的平均值，并且图2中示出的表格显示平均ec50。
[0337]
为了测定变体对表达食蟹猴ilt7的细胞的结合ec50，抗体通过流式细胞术就cynoilt7 ct-125细胞的结合进行筛选。ilt70052(ec50＝0.35nm)、ilt70080(ec50＝0.44nm)、ilt70083(ec50＝1.37nm)、ilt70137(ec50＝1.40nm)、ilt70100(ec50＝1.63nm)和ilt70144(ec50＝7.81nm)、ilt70142和ilt70089对人ilt7的结合呈阳性。ilt70019、ilt70028和ilt70076不结合食蟹猴ilt7-表达细胞。同种型对照r347不显示对ilt7-表达细胞的任何结合。图3中的图表表示来自两个独立实验的平均值，并且图3中的表格显示平均ec50。
[0338]
因此，所有的ilt70052、ilt70080、ilt70083、ilt70100、ilt70137、ilt70142和ilt70144结合表达食蟹猴ilt7或人ilt7的细胞。使用ilt70080、ilt70083和ilt70137获得了表达食蟹猴和人ilt7的细胞的特别低的ec50值。
[0339]
实施例4
[0340]
ilt7抗体的adcc效力
[0341]
使用体外基于细胞的试验测试抗-ilt7抗体针对人ilt7-表达细胞系的adcc效力。在抗-ilt7变体或同种型对照存在的情况下，将表达人ilt7的细胞(靶细胞)与自然杀伤(nk)细胞系kc1333(效应物细胞)以1：5的比例接种18小时。流式细胞分析期间，使用nk标记物cd56(biolegend#304624)门选kc1333细胞，并使用7-aad区分活细胞和死细胞。使用该方法，计算存活靶细胞的百分比，并与基线(无抗体对照)比较。使用以下公式计算细胞毒性：
[0342]
细胞毒性％＝100
–
(存活靶标的数量/无抗体对照存活靶标的数量)x 100。
[0343]
ilt70080具有针对人ilt7-表达细胞最强的adcc(ec50＝0.022nm)，然后是ilt70137(ec50＝0.044nm)和ilt70083(ec50＝0.094nm)。ilt70142、ilt70052、ilt70100和ilt70144也展现adcc活性(图4)。同种型对照r347以及非岩藻糖基化的r347("afuc r347")并不展现与人ilt7-表达细胞的任何adcc活性。
[0344]
使用体外基于细胞的活性还测试抗-ilt7抗体针对食蟹猴ilt7-表达细胞的adcc效力。ilt70080具有针对食蟹猴ilt7-表达细胞最强的adcc效力(ec50＝0.008nm)，然后是ilt70137(ec50＝0.015nm)、ilt70142(ec50＝0.058nm)、ilt70052(ec50＝0.073nm)、ilt70144(ec50＝0.123)、ilt70100(ec50＝0.188nm)和ilt70083(ec50＝0.433nm)。
ilt70089也展现adcc活性。对于食蟹猴ilt7-表达细胞，阳性对照7c7展现adcc，而同种型(阳性)对照r347不展现任何adcc。图5中的图表和表格表示2个独立的实验。
[0345]
因此，ilt70080和ilt70137在食蟹猴和人ilt-7表达细胞中都显示最强的adcc活性。
[0346]
实施例5
[0347]
ilt7抗体结合pbmc
[0348]
抗-ilt7抗体ilt70080、ilt70083和ilt70137对人pbmc的结合通过流式细胞术使用2.5μg/ml的抗体浓度进行评估。itl70080、ilt70083和ilt70137特异性地结合pdc(bdca-4

细胞)(图6a和b)。同种型对照r347的结合为阴性。
[0349]
抗-ilt7抗体ilt70080、ilt70083和ilt70137对食蟹猴pbmc的结合也通过流式细胞术进行评估。itl70080和ilt70083特异性地结合pdc(hla-dr

,谱系-,cd123
高
细胞)。
[0350]
实施例6
[0351]
ilt7抗体对ifn-α分泌的作用
[0352]
如上所示，测试抗-ilt7变体在人和食蟹猴pbmc中的adcc效力。通过elisa测量用抗-ilt7抗体和gpg-a培养的pbmc上清液中的ifnα分泌。ilt70080、ilt70083和ilt70137均抑制人和食蟹猴pbmc中对cpg-a的ifnα应答。ilt70080对ifnα应答具有最强的抑制作用。
[0353]
实施例7
[0354]
ilt70080和ilt70083抗体的非岩藻糖基化
[0355]
igg1抗体在fc区含有针对n-连接寡糖的2个位点，而这些位点在人抗体中重度岩藻糖基化。通过将淋巴细胞受体与抗体fc区结合介导抗体依赖性细胞毒性(adcc)，并且受到岩藻糖基化量的影响。观察到adcc增加伴随岩藻糖基化减少。因此，生成并分析非岩藻糖基化的ilt7。
[0356]
7.1生成非岩藻糖基化的抗ilt7抗体
[0357]
ilt70080和ilt70083 igg1表达于缺少α-1,6-岩藻糖基转移酶的cho细胞系。在该细胞系中的表达产生这样的抗体，所述抗体的重链asn-297的n-聚糖上缺少α-1,6岩藻糖部分。
[0358]
7.2测试非岩藻糖基化ilt70080和ilt70083抗ilt7抗体
[0359]
进行非岩藻糖基化和亲本ilt70080和ilt70083抗体对ilt7-表达细胞的结合试验，以评估非岩藻糖基化是否影响抗体的结合ec50。亲本和非岩藻糖基化抗体对人和食蟹猴ilt7-表达细胞显示相似的结合(图7)。
[0360]
使用上述体外基于细胞的试验(实施例3)，在人和食蟹猴ilt7-表达细胞上测试非岩藻糖基化的ilt70080和ilt70083抗体的adcc效力。对于所有测试的候选物，非岩藻糖基化增加adcc效力(图8)。在人和食蟹猴试验中非岩藻糖基化后，观测到ilt70080抗体效力增加了10倍(分别由ec50＝0.013nm至ec50＝0.001nm和由ec50＝0.006nm至ec50＝0.00051nm)，同时观测到ilt70083增加了6至7倍(分别由ec50＝0.089nm至ec50＝0.0105nm和由ec50＝0.36nm至ec50＝0.057nm)。非岩藻糖基化同种型对照r347不显示对ilt7-表达细胞的任何adcc。
[0361]
非岩藻糖基化抗-ilt7抗体ilt70080和ilt70083对人pbmc的结合通过流式细胞术进行评估。非岩藻糖基化变体itl70080和ilt70083特异性地结合pdc(bdca-2

细胞)。同种
表达细胞系的adcc效力。所有的ilt70080变体相较于亲本抗体具有增加的adcc效力(ec50《14.1pm)。参见图13。具有最低ec50的2个候选物是ilt70080.6(ec50＝6.9pm)和ilt70080.1(ec50＝8.0pm)。其它ilt70080变体的ec50值如下：ilt70080.1 ec50＝10.0pm；ilt70080.3 ec50＝11.0pm；ilt70080.4 ec50＝11.9pm；ilt70080.5 ec50＝8.6pm；和ilt70080.7 ec50＝7.8pm。发现所有的ilt70083变体相较于亲本抗体具有降低的效力(ec50》89.0pm)。参见图14。
[0373]
实施例9
[0374]
工程改造的ilt70080和ilt70083抗体的非岩藻糖基化
[0375]
生成非岩藻糖基化的ilt70080.6。ilt70080.6抗体的非岩藻糖基化并不影响其与人或食蟹猴ilt7-表达细胞的结合。非岩藻糖基化ilt70080.6对人和食蟹猴ilt7-表达细胞的结合ec50分别为152.3pm和366.2pm。参见图15。图15中的表格提供了测量平均荧光强度(mfi)的3个独立结合实验的平均结果。
[0376]
也评估了非岩藻糖基化的ilt70080.6和ilt70083(参见上述实施例7)的adcc活性。ilt70080.6的非岩藻糖基化改善了其对人和食蟹猴ilt7-表达细胞的adcc效力约10倍。参见图16。非岩藻糖基化的ilt0080.6的ec50对于ilt7表达细胞为1.12pm，而对于食蟹猴ilt7-表达细胞为0.44pm。图16中的表格提供了测量细胞毒性的3个独立adcc试验的平均结果。
[0377]
测试非岩藻糖基化的ilt70080.6和ilt70083在人pbmc中的adcc效力。通过流式细胞术评估抗体的细胞毒性，并且通过elisa测量上清液中cpg a介导的ifnα分泌。结果示于图17。在食蟹猴pbmc中，使用非岩藻糖基化ilt70080.6和ilt70083抗体的ifnα分泌的ec50值分别为58pm和5216pm。
[0378]
在人全血和pbmc中，发现非岩藻糖基化的ilt70080.6和ilt70083抗体特异性地结合bdca-2阳性细胞。两种抗体的结合限于所有测试浓度的人pdc(0.1-5.0μg/ml)。
[0379]
在食蟹猴全血中，发现非岩藻糖基化的ilt70080.6和ilt70083抗体在所有测试的浓度(0.5
–
2.5μg/ml)结合pdc(hla-dr

谱系
–
cd123
高
细胞)。
[0380]
实施例10
[0381]
ilt70137抗体的非岩藻糖基化
[0382]
如上实施例7针对ilt70080和ilt70083抗体生成非岩藻糖基化的ilt70137抗体。
[0383]
10.1与可溶性重组人ilt7的结合
[0384]
使用biacore(表面等离子体共振)利用igg-捕获试验形式测量非岩藻糖基化igg1 ilt70137对人ilt7蛋白结合的动力学速率(k
on
、k
off
)常数。在传感器芯片表面上捕获igg，然后是ilt7蛋白或设备缓冲液后，记录2倍稀释系列的各浓度ilt7蛋白的结合。在各对注射之间，再生igg捕获表面。然后，由获得的结合曲线使用可及的bia评估(biaevaluation)软件通过供应商的软件采用1:1拟合模型计算个体结合和解离速率常数，其包括就质量传输受限结合(mass transport limited binding)(如果检测到)进行校正的项目。由数据的高分辨率biacore图像，ilt7蛋白与非岩藻糖基化的igg1 ilt70137结合的结合速率常数和解离速率常数确定为1.855
×
105m-1
s-1
。相同的图像还用于就该相互作用确定对应的解离速率常数，其经测量为3.175
×
10-2
s-1
通过这些速率常数，然后由k
off
/k
on
商计算kd为171nm。这些结果总结于以下表3中。k
on
和k
off
的个体误差低并且与数据的总体拟合好，如通过经计算的r
max
(最大应答)的～1％的chi2值所判断。总之，这表明使用一位点(one-site)结合模型来拟合数据是合适的。该评估并未指出结合是质量传输受限的，因此认为该测量的结合速率常数有效。
[0385]
表3：用于人ilt7蛋白与非岩藻糖基化的igg
1 ilt70137的结合的动力学速率常数和kd数据的总结
[0386][0387]kon
＝结合速率常数；k
off
＝解离速率常数；kd＝平衡结合常数.
[0388]
10.2结合ilt7-表达细胞系
[0389]
非岩藻糖基化的ilt70137与ilt7的结合使用稳定表达人或食蟹猴ilt7的细胞系确定。细胞结合的抗体的平均荧光强度由流式细胞术评估。将细胞在4℃用范围在0.004至333.3nm的浓度递增的测试抗体孵育30分钟。孵育后，用冷pbs洗涤细胞，并在4℃用抗-人-alexa fluor 647抗体孵育30分钟。然后通过facs测定荧光强度，而ec50值使用graphpad prism 6软件中非线形拟合方程式计算。
[0390]
结果示于图18。发现非岩藻糖基化的ilt70137以剂量依赖型的方式结合重组人和食蟹猴ilt7-表达细胞。同种型对照并未观测到显著的结合。非岩藻糖基化的ilt70137与人ilt7表达细胞的结合的平均半最大有效浓度(ec50)为0.303nm，而与食蟹猴ilt7表达细胞为2.148nm。
[0391]
10.3 ilt7-表达细胞系的adcc活性
[0392]
非岩藻糖基化的ilt70137诱导adcc的潜力通过对表达人或食蟹猴ilt7的靶细胞进行荧光激活细胞分选(facs)试验而测量。靶细胞与效应物nk细胞系kc1333以1:5的比例在浓度递增的非岩藻糖基化的ilt70137或同种型对照(范围为0
–
6.66
×
10-9
m)存在的情况下共培养。对于通过流式细胞术评估靶细胞活力，使用cd56对kc1333进行门控，而死细胞使用7-氨基-放线菌素d(7-aad)活力染色进行门控。有活力的靶细胞被定义为cd56阴性、7-aad阴性。使用以下公式计算细胞毒性百分比：细胞毒性％＝100-(存活靶细胞百分比/无抗体对照中存活靶标的百分比)
×
100。使用graphpad prism 6软件中非线形拟合方程式计算半最大有效浓度(ec50)。x-轴：抗体浓度。
[0393]
结果示于图19。非岩藻糖基化的ilt70137在表达ilt7的细胞上以剂量依赖型的方式诱导adcc，其对于表达人ilt-7的细胞的ec50为4.19pm，而对于表达食蟹猴ilt7的细胞的ec50为1.89pm。
[0394]
10.4原代浆细胞样树突细胞的adcc活性
[0395]
响应toll样受体9(tlr9)激动剂的ifn-α分泌很大程度上是由于外周血单核细胞(pbmc)制备中的浆细胞样树突细胞(pdc)。因此，非岩藻糖基化的ilt70137诱导原代pdc的adcc的潜力通过评估其在pbmc中阻断ifn-α分泌的能力间接测量。在这些试验中，纯化的pbmc接种于96孔圆底板中补充有10％肽牛血清和200ng/ml重组人il-2的培养基中。将非岩藻糖基化的ilt70137和对照抗体的系列稀释一式两份添加到合适的孔内，并且孵育9.5小时。孵育后，将50μl的tlr9激动剂odn2216添加至各孔到最终浓度0.5μm。使用多亚型ifn-αelisa试剂盒对ifn-α进行定量，并以上清液的pg/ml示于图20。使用graphpad prism v5.01
软件中的非线形拟合方程式计算adcc的ic50。
[0396]
非岩藻糖基化的ilt70137以剂量依赖型的方式减少pbmc中tlr9介导的ifn-α分泌，其半数最大抑制浓度(ic50)为0.048nm。这些结果表明非岩藻糖基化的ilt70137有效清除pbmc中自然产生的原代人pdc。
[0397]
10.5与原代浆细胞样树突细胞的结合
[0398]
非岩藻糖基化的ilt70137对人原代浆细胞样树突细胞(pdc)的特异性通过的facs在外周血单核细胞(pbmc)中评估。pbmc分离自人供体。为了适当地鉴定该树突细胞亚组，首先利用标记物cd123(表达于pdc和嗜碱性粒细胞)和cd304(pdc所特有)。pdc为cd123 cd304 双阳性，而cd304染色足以鉴定pdc。参见图21(上图)。非岩藻糖基化的ilt70137仅结合cd304阳性细胞，这表明其与pdc独特地结合。参见图21(下右图)。用人igg1同种型非岩藻糖基化的对照抗体r3-47并未观测到对于该群体的显著结合。参见图21(下左图)。
[0399]
实施例11
[0400]
ilt7抗体的体内活性
[0401]
向雄性食蟹猴给予3个抗-ilt7抗体：非岩藻糖基化的7c7、非岩藻糖基化的ilt70080.6和非岩藻糖基化的igg1 ilt70137。所有3个抗体在清除浆细胞样树突细胞(pdc)中具有活性。
[0402]
非岩藻糖基化的ilt70080.6的给予耐受性良好。然而，观测到如下病理学发现：中性粒细胞计数减少，血管白细胞增多，肾小球基质增加和血管/血管周围炎症。此外，针对非岩藻糖基化的ilt70080.6抗体的抗体(抗药抗体)的出现与非岩藻糖基化的ilt70080.6的清除增加相关。
[0403]
在另一项研究中，研究了非岩藻糖基化的7c7和非岩藻糖基化的ilt70137的毒代动力学。在该研究中，将5当量剂量的抗体通过输注给予食蟹猴。给予后，稳定状态下的非岩藻糖基化的ilt70137和非岩藻糖基化的7c7之间的暴露相当。此外，如图22所示，使用任一种抗体实现了特异性和可逆性清除pdc。pdc清除导致ifnα产生的离体抑制。参见图23。
[0404]
然而，使用非岩藻糖基化的7c7和非岩藻糖基化的ilt70137处理的动物的病理不同。在一些用非岩藻糖基化的7c7处理的动物中观测到脾脏重量增加。也在一些用非岩藻糖基化的7c7处理的动物中观测到显微结果。具体而言，在脾脏中观察到红髓和巨噬细胞肥大/增生。在肝脏中观察到库普弗(kupffer)细胞肥大/增生。此外，免疫组织化学显示igg/7c7和含有猴igg的颗粒沉积物与肝脏中肥大/增生的库普弗细胞以及脾脏中的红髓巨噬细胞相关。这些观测结果与含有药物(7c7)和抗药抗体(ada)的免疫复合物被夸大的生理清除性一致。相反，用非岩藻糖基化的ilt70137并未观测到对组织重量的改变以及宏观或微观发现。
[0405]
此外，尽管用非岩藻糖基化的7c7抗体处理的2只猴的中性粒细胞计数降至低于1e3/μl，并未在用对照或非岩藻糖基化的ilt70137处理的猴中观测到中性粒细胞计数的显著改变。
[0406]
因此，尽管3种抗体在体内清除pdc，但是在给予非岩藻糖基化的ilt70137后优异的安全性和缺乏抗药抗体是令人惊讶地有利的。
[0407]
实施例12
[0408]
表位作图
[0409]
为了测定被ilt7抗体结合的表位，构建含有ilt7和ilt1多肽的嵌合多肽，测试ilt7抗体对于这些构建体的结合。选择ilt1(登录号q8n149)来构建嵌合变体，因为其具有与ilt7相同的模块结构并且与ilt7具有65％的相同性，但是不被ilt7单克隆抗体识别。嵌合多肽通过将ilt7的胞外ig结构域替换为ilt1对应物而生成。所有的这些构建体含有n-末端flag标签。这些结果证明，ilt70080和ilt70083结合ilt7的ig1结构域。相反，7c7抗体结合ilt7的ig2结构域。
[0410]
***
[0411]
以上具体实施方式的描述完全揭示了本发明的一般性质，通过应用本领域技术范围内的知识，他人无需过多实验即能很容易地在不背离本发明总体理念的前提下就各种应用改良和/或修改这些具体实施方式。因此，基于本文所列出的教导和指南，应理解为这些修改和改良落入所公开实施方式的等同形式的含义和范围内。应当理解本文中的措词和术语仅仅是描述性的而非限制性的，从而本说明书中的术语或措词可由本领域技术人员根据所述教导和指南解读。
[0412]
本发明的宽度和范围不应受限于任何上述示例性实施方式，而应仅根据下列权利要求书及其等同项来定义。