一种海绵状大孔水凝胶的制备方法及在抗菌中的应用

1.本发明属于复合材料制备领域，具体涉及一种海绵状大孔水凝胶的制备方法及在抗菌中的应用。


背景技术：

2.糖尿病患者因微生物感染和氧化应激导致的伤口延迟愈合仍是临床面临的重大挑战。在正常的伤口部位，免疫细胞(如巨噬细胞、中性粒细胞)分泌并维持一定量的活性氧(ros)以清除外源性污染物(细菌、真菌、异物)，诱导组织分化和生长，促进伤口愈合。然而，由于持续性高血糖，细菌增殖和免疫系统受损会打破糖尿病患者ros水平的平衡，并出现氧化应激和血管损伤等并发症。因此，调节创面ros水平，预防细菌感染和氧化应激是促进糖尿病创面组织修复的关键参数。
3.水凝胶作为“软而湿”的材料，由三维交联聚合物网络组成，可以保留大量的水。由于类似于生物组织的软-湿性质，水凝胶具有广泛的生物医学应用，从体外细胞扩张、组织修复、药物递送、伤口敷料、止血和抗菌。大孔水凝胶利于气体交换、营养运输和细胞向内生长的特性使其更有潜力成为慢性伤口治疗的理想材料。


技术实现要素：

4.本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
5.为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种一种海绵状大孔水凝胶的制备方法，其特征在于，包括：
6.将丙烯酸、双键化多巴胺和去离子水混合，加入引发剂和交联剂，搅拌均匀，然后加入ti3c
2 mxene，混合和脱气后，室温下进行反应，得到海绵状大孔水凝胶。
7.优选的是，所述双键化多巴胺的制备方法为：在氮气保护下，将盐酸多巴胺加入硼酸钠、碳酸氢钠和水组成的混合溶液中，得到多巴胺混合溶液，将甲基丙烯酸酐溶解在四氢呋喃中，得到甲基丙烯酸酐溶液，将甲基丙烯酸酐溶液滴加到多巴胺混合溶液中，同时添加1mol/l的氢氧化钠溶液，以保持反应溶液的ph≥8；搅拌反应过夜后，通过加入盐酸溶液将反应溶液的ph降至2以下，使双键化多巴胺沉淀；然后，用乙酸乙酯萃取双键化多巴胺，用己烷重结晶，并冷冻干燥。
8.优选的是，所述硼酸钠和碳酸氢钠的质量比为3～7:1；所述硼酸钠与水的质量比为1:8～12；所述盐酸多巴胺与硼酸钠的质量比为1：1.5～3；所述甲基丙烯酸酐与四氢呋喃的体积比为1:4～6；所述硼酸钠与甲基丙烯酸酐的质量体积比为15～35g:8～12ml。
9.优选的是，所述丙烯酸与双键化多巴胺的质量比为100～200:1；所述丙烯酸与去离子水的质量比为3:8～12；所述丙烯酸与引发剂的质量比为10～15:1；所述丙烯酸与交联剂的质量比为150～250:1；所述丙烯酸与ti3c
2 mxene的质量比为1:200～800。
10.优选的是，所述引发剂为过硫酸铵，交联剂为n-n
’‑
亚甲基双丙烯酰胺。
11.优选的是，室温下进行反应的时间为30～480s。
12.优选的是，所述ti3c
2 mxene在使用前进行处理，其过程为：将ti3c2mxene加入超临界反应釜中，同时加入乙二胺，在乙二胺的超临界条件下处理5～10min，冷却到室温后，过滤，干燥，得到前处理ti3c
2 mxene。
13.优选的是，所述ti3c
2 mxene与乙二胺的质量体积比为1～3g:100～300ml；乙二胺的超临界条件的温度为320～350℃，压力12～16mpa。
14.其中，ti3c
2 mxene的制备方法为：将lif(1.0g)和ti3alc2(1.0g)溶于10ml盐酸(9.0m)中的teflon瓶中；然后，在35.0℃下连续搅拌混合物(600rpm)48小时，以蚀刻ti3alc2的al层。蚀刻后，用蒸馏水和离心(3500转/分，5分钟)清洗产品多次，直至悬浮液的ph值接近6.0。将沉淀物重新分散在50ml蒸馏水中，并采用水浴超声(200w)处理10min，以进一步剥离mxene片材。
15.本发明还公开了一种如上所述的制备方法制备的海绵状大孔水凝胶在抗菌中的应用。
16.本发明至少包括以下有益效果：
17.本发明所使用的ti3c
2 mxene诱导丙烯酸和双键化多巴胺聚合形成凝胶，加入双键化多巴胺后，双键化多巴胺为水凝胶提供抗氧化性能；ti3c
2 mxene与引发剂作用诱导大孔结构的生成，其原位氧化形成的tio2杂化结构还能为水凝胶提供抗菌性能；这样水凝胶可以作为具有营养物质传输、抗菌、抗氧化等多种功能的材料用于慢性伤口修复。
18.本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明：
19.图1为不同的水凝胶在光照下对大肠杆菌escherichia coli的杀菌率；
20.图2为不同的水凝胶在光照下对大肠杆菌escherichia coli的杀菌率；
21.图3为不同水凝胶在光照下对表皮葡萄球菌staphylococcus epidermidis的杀菌率；
22.图4为不同水凝胶在光照下对表皮葡萄球菌staphylococcus epidermidis的杀菌率；
23.图5为不同的水凝胶在光照和黑暗条件下对大肠杆菌escherichia coli的杀菌率；
24.图6为不同的水凝胶在光照和黑暗条件下对表皮葡萄球菌staphylococcus epidermidis的杀菌率；
25.图7为1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(dpph)与各种水凝胶反应后的紫外-可见光谱图；
26.图8为不同水凝胶的ros(活性氧)清除效率；
27.图9为通过cck8测定法培养1、3和7天后水凝胶上的细胞增殖；
28.图10为细胞在各种水凝胶上的相对活性；
29.图11为在各种水凝胶上培养3天的细胞的荧光照片；
30.图12a是各类型水凝胶治疗伤口不同天数的伤口实际照片；图12b是采集伤口面积
做的定量分析。
具体实施方式：
31.下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
32.应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
33.本发明中采用的ti3c
2 mxene的制备方法为：将lif(1.0g)和ti3alc2(1.0g)溶于10ml盐酸(9.0m)中的teflon瓶中；然后，在35.0℃下连续搅拌混合物(600rpm)48小时，以蚀刻ti3alc2的al层。蚀刻后，用蒸馏水和离心(3500转/分，5分钟)清洗产品多次，直至悬浮液的ph值接近6.0。将沉淀物重新分散在50ml蒸馏水中，并采用水浴超声(200w)处理10min，以进一步剥离mxene片材。
34.实施例1～4：
35.一种海绵状大孔水凝胶的制备方法，包括：
36.步骤一、在氮气保护下，将10g盐酸多巴胺加入20g硼酸钠、8g碳酸氢钠和200ml水组成的混合溶液中，得到多巴胺混合溶液，将9.4ml甲基丙烯酸酐溶解在50ml四氢呋喃中，得到甲基丙烯酸酐溶液，将甲基丙烯酸酐溶液滴加到多巴胺混合溶液中，同时添加1mol/l的氢氧化钠溶液，以保持反应溶液的ph≥8；搅拌反应过夜后，通过加入盐酸溶液将反应溶液的ph降至2以下，使双键化多巴胺沉淀；然后，用乙酸乙酯萃取双键化多巴胺，用己烷重结晶，并冷冻干燥；
37.步骤二、将丙烯酸、双键化多巴胺和去离子水混合，加入引发剂和交联剂，搅拌均匀，然后加入ti3c
2 mxene，混合和脱气后，室温下进行反应，得到海绵状大孔水凝胶；
38.其中实施例1～4中丙烯酸、双键化多巴胺、去离子水h2o、引发剂过硫酸铵aps、交联剂n-n
’‑
亚甲基双丙烯酰胺bis和ti3c
2 mxene的用量如表1所示；
39.表1
[0040][0041]
实施例5～6：
[0042]
一种海绵状大孔水凝胶的制备方法，包括：
[0043]
步骤一、在氮气保护下，将10g盐酸多巴胺加入20g硼酸钠、8g碳酸氢钠和200ml水组成的混合溶液中，得到多巴胺混合溶液，将9.4ml甲基丙烯酸酐溶解在50ml四氢呋喃中，得到甲基丙烯酸酐溶液，将甲基丙烯酸酐溶液滴加到多巴胺混合溶液中，同时添加1mol/l
的氢氧化钠溶液，以保持反应溶液的ph≥8；搅拌反应过夜后，通过加入盐酸溶液将反应溶液的ph降至2以下，使双键化多巴胺沉淀；然后，用乙酸乙酯萃取双键化多巴胺，用己烷重结晶，并冷冻干燥；
[0044]
步骤二、将丙烯酸、双键化多巴胺和去离子水混合，加入引发剂和交联剂，搅拌均匀，然后加入前处理ti3c
2 mxene，混合和脱气后，室温下进行反应，得到海绵状大孔水凝胶；
[0045]
其中，所述ti3c
2 mxene在使用前进行处理，其过程为：将ti3c
2 mxene加入超临界反应釜中，同时加入乙二胺，在乙二胺的超临界条件下处理8min，冷却到室温后，过滤，干燥，得到前处理ti3c
2 mxene；所述ti3c
2 mxene与乙二胺的质量体积比为1.5g:200ml；乙二胺的超临界条件的温度为340℃，压力15mpa。
[0046]
其中实施例5～6中丙烯酸、双键化多巴胺、去离子水h2o、引发剂过硫酸铵aps、交联剂n-n
’‑
亚甲基双丙烯酰胺bis和前处理ti3c
2 mxene的用量如表2所示；
[0047]
表2
[0048][0049]
对比例1：
[0050]
一种海绵状大孔水凝胶的制备方法，包括：
[0051]
将丙烯酸、去离子水混合，加入引发剂和交联剂，搅拌均匀，混合和脱气后，室温下进行紫外线照射反应，得到水凝胶(paa)；
[0052]
对比例2：
[0053]
步骤二、将丙烯酸和去离子水混合，加入引发剂和交联剂，搅拌均匀，然后加入ti3c
2 mxene，混合和脱气后，室温下进行反应，得到水凝胶(smpaa)；
[0054]
对比例3：
[0055]
一种海绵状大孔水凝胶的制备方法，包括：
[0056]
将丙烯酸、双键化多巴胺、去离子水混合，加入引发剂和交联剂，搅拌均匀，混合和脱气后，室温下进行紫外线照射反应，得到水凝胶(paam)；
[0057]
其中对比例1～3中丙烯酸、双键化多巴胺、去离子水h2o、引发剂过硫酸铵aps、交联剂n-n
’‑
亚甲基双丙烯酰胺bis和ti3c
2 mxene的用量如表3所示；
[0058]
表3
[0059][0060]
对比例4：
[0061]
步骤二、将丙烯酸和去离子水混合，加入引发剂和交联剂，搅拌均匀，然后加入纳米二氧化钛，混合和脱气后，室温下进行紫外线照射反应，得到水凝胶(0.16％tio
2-paa)；
[0062]
对比例5：
[0063]
一种海绵状大孔水凝胶的制备方法，包括：
[0064]
步骤一、在氮气保护下，将10g盐酸多巴胺加入20g硼酸钠、8g碳酸氢钠和200ml水组成的混合溶液中，得到多巴胺混合溶液，将9.4ml甲基丙烯酸酐溶解在50ml四氢呋喃中，得到甲基丙烯酸酐溶液，将甲基丙烯酸酐溶液滴加到多巴胺混合溶液中，同时添加1mol/l的氢氧化钠溶液，以保持反应溶液的ph≥8；搅拌反应过夜后，通过加入盐酸溶液将反应溶液的ph降至2以下，使双键化多巴胺沉淀；然后，用乙酸乙酯萃取双键化多巴胺，用己烷重结晶，并冷冻干燥；
[0065]
步骤二、将丙烯酸、双键化多巴胺和去离子水混合，加入引发剂和交联剂，搅拌均匀，然后加入纳米二氧化钛，混合和脱气后，室温下进行紫外线照射反应，得到水凝胶(0.16％tio
2-paam)；
[0066]
其中对比例4～5中丙烯酸、双键化多巴胺、去离子水h2o、引发剂过硫酸铵aps、交联剂n-n
’‑
亚甲基双丙烯酰胺bis和纳米二氧化钛的用量如表4所示；
[0067]
表4
[0068][0069]
1.水凝胶体外抗菌测试
[0070]
选择paa、paam、smpaam-0.16、smpaam-0.12、smpaam-0.08、smpaam-0.08-1、smpaam-0.04、smpaam-0.04-1、0.16％tio
2-paa、0.16％tio
2-paam水凝胶作为实验组。不含水凝胶的样品作为对照组。每组四个平行样本用于抗菌试验。所有细菌都在琼脂蛋白培养基中培养。首先，将样品置于24孔板中，并将100μl细菌悬液(106cfu/毫升)加入每个样品的表面。接下来，在有或没有50w日光灯照明的情况下，将样品在37℃下孵育1小时。然后，将900μl琼脂-蛋白质培养基加入平板的每个孔中，样品在37℃下进一步孵育24小时。最后，收
集每个样品上的200μl细菌悬液，并转移到96孔板中。通过测量600nm处的光密度(od)来监控细菌生长。水凝胶的杀菌率根据以下公式计算:
[0071][0072]
其中，图1为不同的水凝胶在光照下对大肠杆菌escherichia coli的杀菌率；从图中可以看出，添加mxene的水凝胶具有良好的抗菌性；
[0073]
图2为不同的水凝胶在光照下对大肠杆菌escherichia coli的杀菌率；从图中可以看出，添加前处理的mxene的水凝胶具有更加良好的抗菌性；
[0074]
图3为不同水凝胶在光照下对表皮葡萄球菌staphylococcus epidermidis的杀菌率；从图中可以看出，添加mxene的水凝胶具有良好的抗菌性；
[0075]
图4为不同水凝胶在光照下对表皮葡萄球菌staphylococcus epidermidis的杀菌率；从图中可以看出，添加前处理的mxene的水凝胶具有更加良好的抗菌性；
[0076]
图5为不同的水凝胶在光照和黑暗条件下对大肠杆菌escherichia coli的杀菌率；从图中可以看出，添加mxene的凝胶在光照下比直接添加tio2凝胶的抗菌性更优；
[0077]
图6为不同的水凝胶在光照和黑暗条件下对表皮葡萄球菌staphylococcus epidermidis的杀菌率；从图中可以看出，添加mxene的凝胶在光照下比直接添加tio2凝胶的抗菌性更优；
[0078]
2.水凝胶体外活性氧清除
[0079]
paa、paam和smpaam的抗氧化活性用dpph清除试验测定。首先，将paa、paam和smpaam分别加入乙醇(3毫升)中。然后，将1，1-二苯基-2-苦基肼(dpph，100微米，1毫升)溶液和乙醇(1毫升)分别加入不同的样品中。在黑暗中经过不同的反应时间(10、20、40和60分钟)后，使用紫外-可见分光光度计(tu-1901，中国浦西)测量样品的紫外吸收。dpph清除效率(e)使用以下方程确定:
[0080][0081]
其中a0是无样品时dpph溶液的吸光度，as是有样品时dpph溶液的吸光度；
[0082]
其中，图7为1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(dpph)与各种水凝胶反应后的紫外-可见光谱图；
[0083]
图8为不同水凝胶的ros(活性氧)清除效率；从图7和8可以看出，添加双键化多巴胺后水凝胶可以获得良好的抗氧化性能。
[0084]
3.水凝胶细胞培养
[0085]
研究了paa、paam和smpaam水凝胶的细胞相容性。nih-3t3成纤维细胞(atcc细胞库)在37℃的co2培养箱中，在具有10％胎牛血清(hyclone)和1％青霉素-链霉素溶液(hyclone)的dulbecco最小必需培养基(dmem)中培养。在接种细胞之前，直径为7mm、厚度为2.5mm的水凝胶首先在磷酸盐缓冲液(pbs)中纯化，并用75％乙醇灭菌24小时，然后置于具有dmem的24孔板中，并在37℃下溶胀至平衡状态2天，以制备浸提液。处于生长期的细胞用胰蛋白酶处理，收获，然后悬浮在培养基中以获得1
×
105细胞/ml的细胞密度。将细胞以5
×
104个细胞的密度接种在组织培养板的孔中3小时以允许细胞附着，然后加入1ml浸提液用
于共培养。将补充有10％fbs的另外1ml dmem加入每个孔中。允许细胞粘附并生长3和5天。培养3天后，用水凝胶浸提液培养的细胞用钙黄绿素am染色，并通过共聚焦激光扫描显微镜(clsm，tcssp5，徕卡)成像。通过cck8试验分析细胞的生存力。培养3天和5天后，向每个孔中加入200μl cck 8溶液，将平板在37℃下培养4小时。除去培养基后，将所得紫色甲溶解在400μl二甲基(dmso)中，用酶标仪(tecan，spark 10m)测量450nm处的吸光度。
[0086]
图9为通过cck8测定法培养1、3和7天后水凝胶上的细胞增殖；
[0087]
图10为细胞在各种水凝胶上的相对活性；
[0088]
图11为在各种水凝胶上培养3天的细胞的荧光照片；
[0089]
从上述图中可以看出，本发明的水凝胶不会影响细胞的增殖和分化。
[0090]
4.水凝胶伤口治疗
[0091]
(1)糖尿病模型建立
[0092]
饮食适应一周后，小鼠在第一次感染前禁食过夜，然后在尾部静脉注射stz(75mg/kg，sigma)。每5天测量一次随机血糖水平。5天后，观察到多食、多饮和多尿。2周后，随机葡萄糖水平高于18mmol/l的小鼠被指定为糖尿病小鼠。
[0093]
(2)伤口愈合评估
[0094]
使用全层皮肤缺损模型来评估水凝胶的伤口愈合能力。简言之，将糖尿病小鼠麻醉并在无菌条件下操作。在每只小鼠的背部产生圆形全层皮肤伤口(直径8mm),同时在每个伤口周围剥离正常皮肤(2mm),以防止植入的水凝胶脱落。每个伤口中的表皮、真皮和软骨膜被完全去除。将小鼠随机分为四组，接受对照(未治疗)、paa、paam和smpaam水凝胶。麻醉恢复后，将小鼠放回笼子。在术后第0、3、7、10和14天监测伤口愈合情况。每组的伤口愈合率计算为伤口愈合面积与伤口原始面积的比率。
[0095]
16只2个月大的雄性sd大鼠，体重200-300g，购自成都道赛生物技术有限公司。所有手术操作均按照当地伦理委员会批准的方案和中国实验动物管理条例进行。所有动物手术程序均经四川大学动物使用和护理委员会批准(wchsirb-d-2021-532)。
[0096]
图12a是各类型水凝胶治疗伤口不同天数的伤口实际照片，可以明显看到本发明的水凝胶处理的伤口愈合更好，图12b是采集伤口面积做的定量分析。
[0097]
本发明使用ti3c
2 mxene诱导聚丙烯酸水凝胶的凝胶化反应，ti3c2mxene一方面与引发剂作用产生气体促进了水凝胶海绵状结构的产生，同时ti3c
2 mxene或其氧化产物与水凝胶分子链之间的强相互作用使得海绵状水凝胶具有稳定的理学性能及抗溶胀性能；除此之外，ti3c
2 mxene原位氧化形成的tio2@c或tio2@ti3c2杂化结构具有良好的光催化灭菌效果，并且分子链中所含的多巴胺可以有效去除活性氧。因此，这种海绵状的大孔水凝胶具有多种治疗功能，能在慢性疾病患者伤口修复领域得到良好的应用。
[0098]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。