提升酿酒酵母对2-pe抗性的适应性进化方法和恒化培养装置

1.本技术涉及酿酒酵母及其实验室适应性进化方法领域，具体涉及一种提升酿酒酵母对2-pe(全称为β-苯乙醇)抗性的适应性进化方法和恒化培养装置。


背景技术：

2.β-苯乙醇是继香兰素之后应用最广泛的香味化合物，具有柔和、愉快而持久的玫瑰香气，被广泛用于食品、香料、化妆品和其他化工行业。同时，β-苯乙醇也是白酒、黄酒、清酒、果酒、葡萄酒、酱油、面包、干酪等传统发酵食品中重要的呈味物质。目前国际上较多使用化工的方法对β-苯乙醇进行合成，根据美国与欧洲相关法案，由微生物合成的β-苯乙醇属于天然香料物质，所以利用微生物细胞工厂完成高转化率、高效率的β-苯乙醇生产是工业香料领域的重大目标。
3.酿酒酵母是国际公认的高安全性和强生产力的宿主，在微生物工业生产中应用较广泛，是生产β-苯乙醇的优良选择。然而，β-苯乙醇作为酿酒酵母本身的一种信号分子，在高浓度下细胞毒性较大，特别是在乙醇存在的情况下，两者的协同毒性比其中任何一种单独的毒性强烈数倍。并且，由于crabtree效应的存在，酿酒酵母在高糖浓、高溶氧的情况下也会发酵产生乙醇，而在其他碳源耗尽，开始以乙醇为碳源进行生长或者生产时，其效率并不高，特别是在β-苯乙醇存在的情况下，酿酒酵母消耗乙醇阶段几乎不生长或生产。总而言之，酿酒酵母如果生成乙醇作为副产物，不仅浪费部分碳源，降低了转化率，而且还增强了产物β-苯乙醇的毒性，所以一般的工艺利用补料等手段将酿酒酵母的比生长速率控制在临界比生长速率左右，即避免crabtree效应的产生，避免了乙醇的积累，将更多的碳流转向菌体与产物的同时，降低了乙醇与β-苯乙醇的联合毒性。
4.然而，在如上所述的工艺中，酿酒酵母细胞将面对多个环境压力，首先是产物β-苯乙醇的累积会大幅度降低菌体生产的效率，同时对菌体本身造成不可逆转的损伤。工业上对于此种问题，常用的方法为采用原位产物分离的方式，将大部分的产物β-苯乙醇吸收于对其溶解性更好的有机相或者树脂相中，从而保护了水相中的酿酒酵母细胞，所以此时发酵的终点为水相中的β-苯乙醇达到酿酒酵母细胞的耐受上限。根据分配定理，如果能够提升水相酿酒酵母细胞的β-苯乙醇耐受性，那么理论上发酵终点时有机相中的产物浓度将提升数倍甚至数十倍，同时也能提升在一定β-苯乙醇浓度下菌体的生长和生产性能，以此提高发酵效率与产率。此外，菌体长期处于临界比生长速率，也就是糖不饱和的饥饿状态下，对于此种缺乏营养环境的抗性也是菌种需要提升的目标之一。


技术实现要素：

5.本技术提供一种提升酿酒酵母对2-pe抗性的适应性进化方法和恒化培养装置。
6.本技术提供一种提升酿酒酵母对2-pe抗性的适应性进化方法，其包括：
7.将酿酒酵母菌液接种于第一培养基中形成培养体系，进行批培养；
8.待所述培养体系的乙醇耗尽，对所述培养体系进行恒化培养进化：即以恒定速率
向所述培养体系加入含有初始浓度β-苯乙醇的第二培养基，并使所述培养体系保持设定体积或设定质量；
9.获得恒化培养进化过程中发酵尾气成分，利用发酵尾气成分监控并判断是否需要调整β-苯乙醇的浓度，将β-苯乙醇的浓度从初始浓度以阶梯式逐步提升至目标浓度；
10.获取在目标浓度的β-苯乙醇中保持恒定比生长速率生长的目标菌株，经筛选后，得到具有高β-苯乙醇抗性的酿酒酵母菌株。
11.可选的，在本技术一些实施例中，所述初始浓度为2.0g/l-3.0g/l；和/或
12.所述目标浓度为18g/l-21g/l。
13.可选的，在本技术一些实施例中，所述利用发酵尾气成分监控并判断是否需要调整β-苯乙醇的浓度，包括：
14.得到所述培养体系的our值和cer值，设定our阈值和cer阈值，所述our阈值和所述cer阈值均为15-25，将所述our值和所述cer值分别与所述our阈值和所述cer阈值比较：
15.在设定数量洗脱体积后，当所述our值和所述cer值分别维持在所述our阈值和所述cer阈值范围内的任意一个值时，并保持平衡，即更换含有更高浓度β-苯乙醇的第二培养基；
16.当所述our值和所述cer值分别降低至所述our阈值和所述cer阈值的最低值以下，则更换前一β-苯乙醇浓度的第二培养基继续进化；
17.当所述our值和所述cer值分别高于所述our阈值和所述cer阈值的最大值时，则需判断是否染菌，若未染菌，则继续进化步骤，若染菌，则需重复批培养、恒化培养进化步骤。
18.可选的，在本技术一些实施例中，所述第一培养基的配方包括：4g/l-7g/l kh2po4、6.5g/l-8.5g/l(nh4)2so4、0.4g/l-0.6g/l mgso4·
7h2o、19.0g/l-21.0g/l葡萄糖、1ml/l-3ml/l金属离子母液、1ml/l-2.5ml/l维生素母液和0.5ml/l-1.05ml/l消泡剂。
19.可选的，在本技术一些实施例中，所述第二培养基的配方包括：3g/l-5g/l kh2po4、5g/l-7g/l(nh4)2so4、0.35g/l-0.6g/l mgso4·
7h2o、19.0g/l-20.0g/l葡萄糖、1ml/l-2ml/l金属离子母液、0.5ml/l-2ml/l维生素母液、0.5ml/l-1.5ml/l消泡剂和2.5g/l-20g/lβ-苯乙醇。
20.相应的，本技术还提供一种恒化培养装置，用于上述的提升酿酒酵母对2-pe抗性的适应性进化方法对酿酒酵母进行恒化培养进化，其包括：
21.反应器，为培养体系提供无菌有氧环境，所述反应器内设有用以搅拌所述培养体系的搅拌部件；
22.补料部，用于以恒定速率向所述反应器内加入含不同浓度的β-苯乙醇的第二培养基；
23.溢流部，用于排出所述反应器内超出设定体积的发酵液；
24.溶氧和ph监测部，用于监测所述培养体系的溶氧值以及检测并调控所述培养体系的ph值，使所述培养体系的溶氧值和ph值保持恒定；
25.气体检测部，获取所述反应器内的发酵尾气，检测得到用以判断当前β-苯乙醇浓度进化完成情况的发酵尾气成分。
26.可选的，在本技术一些实施例中，所述补料部包括：
27.第一储存容器，用于放置含有不同浓度β-苯乙醇的第二培养基；
28.第一管路，其一端与所述第一储存容器相连，另一端与所述反应器相连，所述第一管路上设有用于将所述第二培养基泵送至所述反应器内的第一蠕动泵；和/或
29.所述第一蠕动泵的泵速为0.4ml/min-1.0ml/min。
30.可选的，在本技术一些实施例中，所述溢流部包括：
31.第二储存容器，用于放置排出的发酵液；
32.第二管路，其一端与所述反应器相连，另一端与所述第二储存容器相连，所述第二管路上设有用于将所述发酵液从所述反应器泵送至所述第二储存容器的第二蠕动泵。
33.可选的，在本技术一些实施例中，所述溶氧和ph监测部包括：
34.用于实时监控溶氧值的溶氧电极；和
35.ph值监测部件，其包括：用于监测培养体系的ph值的ph电极和用于向所述培养体系中补充碱液的碱液管路。
36.可选的，在本技术一些实施例中，所述气体检测部包括：
37.用于检测发酵尾气成分的质谱仪；和
38.用于去除发酵尾气中的水蒸气的冷凝部件，其具有进气口和出气口，所述进气口与所述反应器相连，所述出气口与所述质谱仪的进口相连；
39.其中，所述反应器内的发酵尾气经所述冷凝部件去除水蒸气后送至所述质谱仪检测。
40.本技术具有至少以下一种或多种有益效果：
41.本技术，酿酒酵母菌株进化过程中未进行诱变处理，因此其基因组未发生剧烈变化，便于对得到的高2-pe抗性菌株进行抗性相关的基因测序与研究。
42.本技术，相较于普通实验室适应性进化的方法，本技术采用了改进后的恒化培养装置进行恒化培养进化，使反应器中的培养体系如ph、溶氧等均能维持在菌体培养最适的条件下，减少了其他方面的不利因素与进化压力；恒化培养进化的方式可以使接受进化压力的菌体细胞密度维持在较高水平，且一直处于指数生长阶段，提升了进化效率。
43.本技术，提供恒化培养装置通过设置气体检测部，进一步使用质谱仪对发酵尾气成分进行分析，并计算得到生长相关参数，实现了进化进程的实时监测，便于判断酿酒酵母菌株进化状态。
44.本技术，不仅能提升菌株对β-苯乙醇的抗性，而且较契合常规的酿酒酵母发酵生产β-苯乙醇工艺，常规生产工艺中为了防止产生副产物乙醇，使细胞处于饥饿状态，即是在糖限制条件下进行生产，而恒化培养进化的模式可以提升菌株对糖限制条件的抗性，因此，本技术进化得到的高2-pe抗性的酿酒酵母菌株更适应于实际生产工艺，提升了菌株对常规生产工艺中糖限制状态的抗性。
附图说明
45.为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
46.图1是本技术提供的恒化培养装置的结构示意图；
47.图中标记分别表示为：反应器1、ph电极2、溶氧电极3、搅拌部件4、第一蠕动泵5、第二蠕动泵6、第一储存容器7、第二储存容器8、冷凝部件9、质谱仪10。
具体实施方式
48.下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本技术保护的范围。此外，应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本技术，并不用于限制本技术。在本技术中，在未作相反说明的情况下，使用的方位词如“上”、“下”、“左”、“右”通常是指装置实际使用或工作状态下的上、下、左和右，具体为附图中的图面方向。
49.本技术提供一种提升酿酒酵母对2-pe抗性的适应性进化方法和恒化培养装置，以下分别进行详细说明。需要说明的是，以下实施例的描述顺序不作为对本技术实施例优选顺序的限定。且在以下实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述的部分，可以参见其它实施例的相关描述。
50.在本技术提供一种提升酿酒酵母对2-pe抗性的适应性进化方法，其包括：
51.s1，将酿酒酵母菌液接种于第一培养基中形成培养体系，接种量可以为10％，进行一批次的批培养：
52.可以采用以下方法获得酿酒酵母菌液：出发菌株的甘油管，经ypd斜面活化后，洗出菌液，依次转接至含酵母最低培养基的试管与摇瓶中进行活化。试管与摇瓶的活化过程具体为，挑取单菌落至含5ml酵母最低培养基的试管中活化24h，再倒入含200ml酵母最低培养基的摇瓶中培养36h，培养条件均为30℃，220rpm。菌株活化用斜面的ypd培养基配方包括：10g/l酵母提取物、20g/l蛋白胨、20g/l葡萄糖和20g/l琼脂。摇瓶中酵母最低培养基配方包括：14.4g/l kh2po4、7.5g/l(nh4)2so4、0.5g/l mgso4·
7h2o、20.0g/l葡萄糖、1ml/l金属离子母液和1ml/l维生素母液。出发菌株选为通用的酿酒酵母模式菌株s288c，便于后期基因测序比较。菌株活化过程分为两级，第一级体系为5ml，第二级体系为200ml。
53.s2，待培养体系的乙醇耗尽，对培养体系进行恒化培养进化：即以恒定速率向培养体系加入含有初始浓度β-苯乙醇的第二培养基，并使培养体系保持设定体积或设定质量。
54.上述步骤中，通过实时监测发酵尾气来判断批培养的发酵终点：当显示培养体系的cer值突然大幅度上升时，即判断出培养体系的乙醇耗尽，为批培养的发酵终点；选择在乙醇耗尽发酵终点开始恒化培养进化的理由如下：如果在培养体系中还存在其他碳源时即开始恒化培养进化，会使培养体系到达平衡所需的时间大大延长，且容易出现振荡现象，无法达到平衡，而在乙醇耗尽时，开始进行恒化培养进化，可防止培养体系中残留的乙醇导致后续恒化培养进化不稳定。
55.对培养体系进行恒化培养进化，具体地：以恒定速率向培养体系加入含初始浓度的β-苯乙醇的第二培养基(补料液)，将第二培养基的流加速率控制在0.2ml/min-0.43ml/min，比生长速率控制在0.04h-1-0.085h-1
,同时排出超出培养体系设定体积的多余发酵液，从而使培养体系保持设定体积或设定质量。例如：设定体积可以为300ml。在具体实施时，可以通过设置溢流装置排出反应器内多余体积的发酵液，以调控培养体系的体积，也可以通
过设置溢流装置排出多余质量的发酵液，以调控培养体系的质量。
56.将第二培养基的流加速率控制在0.2ml/min-0.43ml/min，即比生长速率控制在0.04h-1-0.085h-1
，该比生长速率为多次预实验得到。当加入第二培养基的流加速率太低时，导致比生长速率太慢，进化压力较小，影响进化效率；当第二培养基的流加速率过大，菌体很容易被洗脱掉，导致培养体系中菌体越来越少，菌体密度低于接受进化压力的标准。
57.上述步骤中，结合本技术提出的恒化培养装置对上述步骤进一步说明：在乙醇耗尽的发酵的终点，开启第一蠕动泵和第二蠕动泵，即开始恒化培养。
58.s3，获得恒化培养进化过程中发酵尾气成分，利用对发酵尾气成分分析结果监控并判断是否需要调整β-苯乙醇的浓度，将β-苯乙醇的浓度从初始浓度以阶梯式逐步提升至目标浓度。初始浓度为2.0g/l-3.0g/l；初始浓度最优选地为2.5g/l，2.5g/l为前期出发菌株的抗性预实验得到的一个合适的进化压力起点。
59.上述s3中，在每次调整补料部中β-苯乙醇的浓度前，取一定菌液到甘油管中，保存至-80℃冰箱中留样。
60.s4，获取在目标浓度β-苯乙醇中保持恒定比生长速率生长的目标菌株，经筛选后，得到具有高β-苯乙醇抗性的酿酒酵母菌株。
61.目标浓度可以为2.0g/l-21g/l范围内的任一浓度。目标浓度最优选地为18g/l-20g/l浓度，当浓度高于20g/l后，β-苯乙醇在30℃的培养体系中较难溶解。β-苯乙醇浓度范围最优选地为2.5g/l-20g/l。
62.上述s4中，筛选出目标菌株，具体为：将获取的目标菌株接种至含对应β-苯乙醇浓度的ypd平板培养基中，选择最大的菌落放置于ypd平板培养基中活化，并取菌液进行保种，得到具有高β-苯乙醇(简称2-pe)抗性的酿酒酵母菌株。
63.在具体实施时，在上述恒化培养进化到一定程度后，取出适量发酵液，吸取50微升，涂布于含有与进化进程相同浓度的β-苯乙醇的ypd平板上，培养4天后挑取最大的2-3个菌落于ypd平板培养基中活化后制成甘油管，保存在-80℃中，便于后续验证与使用。ypd平板培养基配方包括：10g/l酵母提取物、20g/l蛋白胨、20g/l葡萄糖、20g/l琼脂、对应浓度的β-苯乙醇，其中，β-苯乙醇浓度的范围为2.0g/l-21g/l，优选地为2.5g/l-20g/l。
64.本发明上述方法，针对工业生产β-苯乙醇工艺中酿酒酵母菌株需要面对的两种主要环境压力，以及当前基因工程方法以及诱变方法无法获得β-苯乙醇抗性达到工业生产强度的问题，提出了一种不需要剧烈诱变、性能稳定的能耐受高浓度β-苯乙醇且适应工业发酵环境的酿酒酵母的实验室适应性进化方法。
65.在本技术另一些实施例中，利用发酵尾气成分分析结果监控并判断是否需要调整β-苯乙醇的浓度，包括：
66.对发酵尾气成分分析，得到培养体系的our值和cer值，设定our阈值和cer阈值，our阈值和cer阈值均为15-25，将our值和cer值分别与our阈值和cer阈值比较：
67.在6-8个数量洗脱体积后，当our值和cer值分别维持在our阈值和cer阈值范围内的任意一个值时，并保持平衡，即更换含有更高浓度β-苯乙醇的第二培养基；若期间our值和cer值分别持续下降，降低至our阈值和cer阈值的最低值15以下，则说明前一浓度的进化尚未完成，需更换为前一β-苯乙醇浓度的第二培养基继续进化。选择上述判断方法的原因为：多批次预实验得到的发酵our阈值和cer阈值的参数范围，在该范围内则证明，当前浓度
cacl2、3.0g/l feso4·
7h2o、1.0g/l h3bo3、1.0g/l mncl2·
4h2o、0.4g/l na2moo4·
2h2o、0.3g/l cocl2·
6h2o、0.3g/l cuso4·
5h2o和0.1g/l ki；用2mol/l hcl将ph调至4.0。维生素母液配方包括：50mg/l生物素、1000mg/l泛酸半钙盐、1000mg/l盐酸硫胺素、1000mg/l盐酸吡哆醇、1000mg/l烟酸、200mg/l对氨基苯甲酸和25000mg/l肌醇；用2mol/l naoh将ph调至6.5。
77.在具体实施时，上述第二培养基中葡萄糖需要115℃湿热灭菌20min后单独加入，维生素母液需要过滤除菌后待培养基冷却到室温后加入，其他成分均为121℃灭菌30min。由于生物素等成分在高温下容易降解，因此，维生素母液需要过滤除菌后待培养基冷却到室温后再加入。
78.在第二培养基的配方中添加双倍浓度金属离子母液和维生素母液，原因为菌体在不利环境下生长进化需要比正常培养更多的该类营养物质。
79.本实施例还提供一种恒化培养装置，用于上述的提升酿酒酵母对2-pe抗性的适应性进化方法对酿酒酵母进行恒化培养，其包括：反应器、补料部、溢流部、溶氧和ph监测部和气体检测部。
80.反应器为培养体系提供无菌有氧环境。反应器内设有用以搅拌培养体系的搅拌部件。搅拌部件可以为磁力驱动搅拌系统。该反应器为一微型的生物反应器。培养体系的体积控制在300ml，选择微型反应器，操作方便，且节省了原料，使整个进化方法更加经济，而300ml的体积足够使接受进化压力的菌体细胞达到数量要求。反应器可以采用但不限于：500ml的四联平行反应器，进行多个培养体系的平行进化实验。四联平行反应器可以选自上海国强生化工程装备有限公司。
81.补料部用于以恒定速率向反应器内加入含不同浓度的β-苯乙醇的第二培养基(即为补料液)。
82.溢流部用于排出反应器内超出设定体积的多余的发酵液。
83.溶氧和ph监测部用于监测培养体系的溶氧值以及检测并调控培养体系的ph值，以使培养体系的溶氧值和ph值保持恒定。
84.气体检测部获取反应器内的发酵尾气并对其成分进行实时检测分析，得到用以判断当前β-苯乙醇浓度进化完成情况的our值和cer值，由our值和cer值的曲线走势实时监控并判断是否需要调整补料部向反应器送入的β-苯乙醇的浓度，以此作为是否需要调整补料部中β-苯乙醇的浓度的依据。
85.进一步还可以设置：控制部，获取气体检测部得到的培养体系的our值和cer值，根据our值和cer值控制补料部向反应器输送所需浓度β-苯乙醇的第二培养基。
86.采用上述装置进行恒化培养：
87.将第一培养基放置在反应器1中，将酿酒酵母菌液接种至反应器1中的第一培养基中，接种量可以为10％。通过反应器1底部的加热底座与冷凝套管维持温度为30℃。批培养与后续进化过程中的恒化培养在500ml的反应器1中进行，培养体积为300ml，四个平行实验同时进行。优选条件为：反应器1的无菌空气的通气量为2vvm，搅拌转速为700rpm，使用溶氧电极与ph电极实时检测反应器1内培养体系的溶氧与ph值情况。上述条件可以保证培养体系溶氧维持在40％以上，利用溶氧和ph监测部控制ph值为5.0。
88.在本技术另一些实施例中，参照图1所示，补料部包括：第一储存容器7、第一管路
和第一蠕动泵5。
89.第一储存容器7用于放置含有不同浓度β-苯乙醇的第二培养基(即为补料液)；第一储存容器可以为桶体。
90.第一管路的一端与第一储存容器7相连，第一管路的另一端与反应器1相连，第一管路上设有将不同浓度β-苯乙醇的第二培养基从第一储存容器泵送至反应器内的第一蠕动泵5。第一管路可以采用19号软管。上述第一储存容器7通过第一蠕动泵5和软管将第二培养基泵入反应器1中。
91.第一蠕动泵5的泵速为0.4ml/min-1.0ml/min。第一蠕动泵5的泵速控制在0.4ml/min-1.0ml/min，配合使用19号软管，从而将第二培养基的流加速率控制在0.2ml/min-0.43ml/min，比生长速率控制在0.04h-1-0.085h-1
；选择该流加速率的原因为：为多次预实验得到的优选，当第二培养基的流加速率太低，导致比生长速率太慢，进化压力较小，影响进化效率；当第二培养基的流加速率过大，菌体很容易被洗脱掉，导致培养体系中菌体越来越少，菌体密度低于接受进化压力的标准。
92.上述第一蠕动泵可以采用但不限于：兰格蠕动泵bt100-2j，泵头为yz1515x，第一管路为19号管，均来自于保定兰格恒流泵有限公司。
93.在本技术另一些实施例中，参照图1所示，溢流部包括：第二储存容器8和第二管路，其中，第二储存容器8用于放置从反应器1内排出的发酵液；第二储存容器8可以为桶体。第二管路的一端与反应器1相连，其另一端与第二储存容器相连，第二管路上设有用于将发酵液从反应器泵送至第二储存容器8的第二蠕动泵6。在具体实施时，将上述第二蠕动泵6的转速开到最大，利用溢流部将超出设定体积的多余发酵液及时地从反应器1中泵出至第二储存容器8中，使培养体系的体积保持恒定。第二软管可以采用19号软管。
94.上述第二蠕动泵6可以采用但不限于：兰格蠕动泵bt100-2j，泵头为yz1515x，第二管路为19号管，均来自于保定兰格恒流泵有限公司。
95.在本技术另一些实施例中，反应器设有供氧管路，供氧管路向反应器内输送无菌空气，无菌空气的通入速率为2vvm。通入无菌空气保证反应器内部的供氧。
96.在本技术另一些实施例中，参照图1所示，溶氧和ph监测部包括：溶氧电极3和ph值监测部件，其中，溶氧电极3用于实时监测培养体系的溶氧含量；ph值监测部件，其包括：用于监测培养体系的ph值的ph电极2和用于向培养体系补充碱液并与反应器连通的碱液管路。碱液管路向反应器1内补充碱液。由ph电极2与碱液管路联动控制，保持培养体系的ph值恒定不变。
97.在本技术另一些实施例中，参照图1所示，气体检测部包括：质谱仪10和冷凝部件9，其中，质谱仪10用于检测发酵尾气成分；质谱仪10可以采用但不限于：winsford u.k.cw7 3ga，来自于美国thermo公司。
98.冷凝部件9去除发酵尾气中的水蒸气，冷凝部件9具有进气口和出气口，进气口通过第三管路与反应器相连，出气口通过第四管路与质谱仪10的进气口相连，其中，反应器的发酵尾气经冷凝部件9去除水蒸气后送至质谱仪10检测。通过质谱仪10对尾气分成进行即时分析，得到氧气与二氧化碳的成分，并通过软件计算得到单位发酵体积氧气消耗速率our、单位发酵体积二氧化碳生成速率cer与呼吸熵rq，在软件上显示曲线，通过our值和cer值的曲线走势实时监控并判断是否需要调整向反应器中加入β-苯乙醇的浓度，此作为是否
需要调整补料部向反应器送入的β-苯乙醇的浓度的依据。
99.在本技术另一些实施例中，反应器进一步设有液位监测部件，用以监测反应器内培养体系的液位，获取液位数据，并将获取的液位数据反馈至溢流部。
100.在本技术另一些实施例中，将质量百分含量为8％-10％的二甲基二氯硅烷溶解在异丙醇中，涂淋于反应器液面以上部分的罐体表面、挡板或者设于反应器内暴露于培养体系外的其他部件表面，用80℃烘箱干燥10分钟，涂淋与干燥的步骤重复3-5次，在反应器液面以上的内表面、其他部件的表面形成一层防护涂层，抑制长期恒化培养进化过程中菌体的贴壁生长。其他部件可以指：搅拌部件、ph电极及溶氧电极。
101.上述实施例所述的整个适应性进化的反应器及培养体系条件，包括整套装置的结构、过程中条件参数的控制、进出料的速率以及进化进程的判定方式都在本发明保护范围内。
102.以上对本技术进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本技术的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本技术的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本技术的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本技术的限制。