一种小麦蛋白源硒螯合肽的制备方法

1.本发明涉及一种性能稳定、吸收效率高的小麦蛋白源硒螯合肽的制备方法，属于功能食品加工技术领域。


背景技术：

2.硒（se）是我们人体所必需的微量元素之一，具有重要的营养生理作用。人体中硒的来源主要是食物，通过食物获得的硒往往不能满足生理的需求，这将会导致许多疾病的出现，研究发现人体中有40多种症状与缺硒有关。因此，近年来硒补充剂广受市场青睐。硒的补充形式主要包括有机硒和无机硒两种，其中无机硒主要有亚硒酸钠和硒酸钠，从金属矿藏的副产品中获得；有机硒是指硒的有机化合物，即硒与碳、氢、氧、氮等有机元素结合，或是与含有有机元素的物质结合，蛋白、含硒氨基酸、硒醇、硒醚、硒酚等以及它们的衍生物。研究表明，无机硒在人体内极少部分被吸收，大部分随尿液排出体外，生物利用率低；相反，有机硒的依循蛋氨酸代谢途径代谢，参与蛋白的合成，容易在组织内储存、吸收，被人体吸收后可迅速的被人体利用，有效改善人体内血硒状况。
3.根据中国军事医学科学院硒研究小组最新研究资料显示，如今许多号称有机硒的产品质量差别极大，并非有机硒产品都具有类似的品质及效果，如无机硒的中毒剂量是1500μg/天，有机硒种类不同，中毒剂量也有所差异，富硒酵母中毒剂量是5000μg/天，硒蛋白以覃类硒和麦硒为主，其中麦硒研究表明食用安全、无毒副作用、无蓄毒、吸收利用率高、营养价值高，是补硒最佳选择。
4.我国小麦资源丰富，成本低廉，富含优质蛋白及丰富的维生素和膳食纤维，将蛋白质酶解为多肽，可以与硒元素进行结合，将无机硒转化为有机硒，并进一步能够借助多肽在肠道消化中的吸收、转运特点以配合物的整体形式被主动吸收。该螯合肽还具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖等生物活性，具有重要的研究意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种性能稳定、吸收效率高的小麦蛋白源硒螯合肽的制备方法。
6.为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种小麦蛋白源硒螯合肽的制备方法，包括如下步骤：（1）酶解：称取一定质量的脱脂麦胚蛋白粉，加水调成质量分数为3-5%的悬浮液，加入alcalase2.4l碱性蛋白酶酶解2-3h，然后加热到100℃灭酶10min，冷却后在4500r/min离心20min，收集上清液；（2）超滤：取适量酶解液，加适量去离子水稀释，用0.45μm微孔滤膜过滤，泵入超滤系统，选择截留分子量为3000da的超滤膜除去大分子物质，收集透过液，冻干，备用；（3）螯合柱制备：制备壳聚糖金属螯合亲和层析柱，用蒸馏水洗3个柱体积，接着用0.1mol/l的亚硒酸钠溶液流洗4个柱体积，使填料充分吸附se
4
，再用蒸馏水洗去未结合
的se
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，得到硒离子-壳聚糖填料，最后用 0.05 mol/l，ph6.0 的磷酸缓冲液平衡金属螯合亲和层析柱；（4）分离：将麦胚蛋白酶解物用0.05 mol/l，ph6.0磷酸缓冲液配成10 mg/ml溶液，通过固定金属亲和层析柱，上样量为5 ml，流速为1ml/min，检测波长为220 nm，先用双蒸水洗去未结合的肽，再用含 0.1 mol/l nacl，ph6.0的磷酸缓冲液洗洗脱出金属螯合肽，收集各组分，冷冻干燥；（5）纯化：利用半制备rp-hplc-c18反相高效液相色谱再进行进一步分离，分离条件是用体积分数为0-50%的乙腈溶液作为洗脱液梯度洗脱，流速为3 ml/min，洗脱液至含体积为100%的水开始，至体积比50%乙腈和50%水混合液结束，进行梯度洗脱，收集体积比为25%乙腈和75%水的洗脱峰，采用lc/ms液质联用质谱仪分析得出保留时间为13.85 min处的峰为所述硒螯合特征肽。
7.步骤（1）所述的alcalase2.4l碱性蛋白酶添加量为3-5%，酶解温度为50-60℃，酶解ph值为9-10。
8.本发明具有如下优点：1、本发明立足于多肽具备与矿质元素离子螯合的作用位点，能够与其形成稳定的化合物，且多肽-矿质元素螯合物具有独特的螯合体制和转运机制，易被吸收、可同时补充氨基酸和矿质元素的理论基础，制备了小麦蛋白源硒螯合肽，能有效提高硒的利用率，天然安全无毒副作用。
9.2、此硒螯合肽可作为一种活性成分添加到食品或药品中，或者直接加工成产品用于服用，提高锌的生物利用率，对于提高国民健康具有重要意义，而且能进一步增加小麦的附加值。
具体实施方式
10.下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
11.实施例1一种小麦蛋白源硒螯合肽的制备方法，包括如下步骤：（1）酶解：称取一定质量的脱脂麦胚蛋白粉，加水调成质量分数为3%的悬浮液，加入质量分数为3%的alcalase2.4l碱性蛋白酶在50℃，ph值为9的条件下酶解3h，然后加热到100℃灭酶10min，冷却后在4500 r/min离心20 min，收集上清液；（2）超滤：取适量酶解液，加适量去离子水稀释，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，泵入超滤系统，选择截留分子量为3000 da 的超滤膜除去大分子物质，收集透过液，冻干，备用；（3）螯合柱制备：制备壳聚糖金属螯合亲和层析柱，用蒸馏水洗3个柱体积，接着用 0.1 mol/l的亚硒酸钠溶液流洗4个柱体积，使填料充分吸附 se
4
，再用蒸馏水洗去未结合的se
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，得到硒离子-壳聚糖填料，最后用 0.05 mol/l，ph6.0 的磷酸缓冲液平衡金属螯合亲和层析柱；（4）分离：将麦胚蛋白酶解物用0.05 mol/l，ph6.0磷酸缓冲液配成10 mg/ml溶液，通过固定金属亲和层析柱，上样量为5 ml，流速为1ml/min，检测波长为220 nm，先用双蒸水洗去未结合的肽，再用含 0.1 mol/l nacl，ph6.0的磷酸缓冲液洗洗脱出金属螯合肽，收集
各组分，冷冻干燥；（5）纯化：利用半制备rp-hplc-c18反相高效液相色谱再进行进一步分离，分离条件是用体积分数为0-50%的乙腈溶液作为洗脱液梯度洗脱，流速为3 ml/min，洗脱液至含体积为100%的水开始，至体积比50%乙腈和50%水混合液结束，进行梯度洗脱，收集体积比为25%乙腈和75%水的洗脱峰，采用lc/ms液质联用质谱仪分析得出保留时间为13.85 min处的峰为所述硒螯合特征肽。
12.步骤（1）所述的alcalase2.4l碱性蛋白酶添加量为3-5%，酶解温度为50-60℃，酶解ph值为9-10。
13.实施例2一种小麦蛋白源硒螯合肽的制备方法，包括如下步骤：（1）酶解：称取一定质量的脱脂麦胚蛋白粉，加水调成质量分数为5%的悬浮液，加入质量分数为5%的alcalase2.4l碱性蛋白酶在60℃，ph值为10的条件下酶解2h，然后加热到100℃灭酶10min，冷却后在4500 r/min离心20 min，收集上清液；（2）超滤：取适量酶解液，加适量去离子水稀释，用 0.45 μm 微孔滤膜过滤，泵入超滤系统，选择截留分子量为3000 da 的超滤膜除去大分子物质，收集透过液，冻干，备用；（3）螯合柱制备：制备壳聚糖金属螯合亲和层析柱，用蒸馏水洗3个柱体积，接着用 0.1 mol/l的亚硒酸钠溶液流洗4个柱体积，使填料充分吸附 se
4
，再用蒸馏水洗去未结合的se
4
，得到硒离子-壳聚糖填料，最后用 0.05 mol/l，ph6.0 的磷酸缓冲液平衡金属螯合亲和层析柱；（4）分离：将麦胚蛋白酶解物用0.05 mol/l，ph6.0磷酸缓冲液配成10 mg/ml溶液，通过固定金属亲和层析柱，上样量为5 ml，流速为1ml/min，检测波长为220 nm，先用双蒸水洗去未结合的肽，再用含 0.1 mol/l nacl，ph6.0的磷酸缓冲液洗洗脱出金属螯合肽，收集各组分，冷冻干燥；（5）纯化：利用半制备rp-hplc-c18反相高效液相色谱再进行进一步分离，分离条件是用体积分数为0-50%的乙腈溶液作为洗脱液梯度洗脱，流速为3 ml/min，洗脱液至含体积为100%的水开始，至体积比50%乙腈和50%水混合液结束，进行梯度洗脱，收集体积比为25%乙腈和75%水的洗脱峰，采用lc/ms液质联用质谱仪分析得出保留时间为13.85 min处的峰为所述硒螯合特征肽。
14.实施例3一种小麦蛋白源硒螯合肽的制备方法，包括如下步骤：（1）酶解：称取一定质量的脱脂麦胚蛋白粉，加水调成质量分数为4%的悬浮液，加入质量分数为4%的alcalase2.4l碱性蛋白酶在55℃，ph值为10的条件下酶解2.5h，然后加热到100℃灭酶10min，冷却后在4500 r/min离心20 min，收集上清液；（2）超滤：取适量酶解液，加适量去离子水稀释，用 0.45 μm 微孔滤膜过滤，泵入超滤系统，选择截留分子量为3000 da 的超滤膜除去大分子物质，收集透过液，冻干，备用；（3）螯合柱制备：制备壳聚糖金属螯合亲和层析柱，用蒸馏水洗3个柱体积，接着用 0.1 mol/l的亚硒酸钠溶液流洗4个柱体积，使填料充分吸附 se
4
，再用蒸馏水洗去未结合的se
4
，得到硒离子-壳聚糖填料，最后用 0.05 mol/l，ph6.0 的磷酸缓冲液平衡金属螯合亲和层析柱；
（4）分离：将麦胚蛋白酶解物用0.05 mol/l，ph6.0磷酸缓冲液配成10 mg/ml溶液，通过固定金属亲和层析柱，上样量为5 ml，流速为1ml/min，检测波长为220 nm，先用双蒸水洗去未结合的肽，再用含 0.1 mol/l nacl，ph6.0的磷酸缓冲液洗洗脱出金属螯合肽，收集各组分，冷冻干燥；（5）纯化：利用半制备rp-hplc-c18反相高效液相色谱再进行进一步分离，分离条件是用体积分数为0-50%的乙腈溶液作为洗脱液梯度洗脱，流速为3 ml/min，洗脱液至含体积为100%的水开始，至体积比50%乙腈和50%水混合液结束，进行梯度洗脱，收集体积比为25%乙腈和75%水的洗脱峰，采用lc/ms液质联用质谱仪分析得出保留时间为13.85 min处的峰为所述硒螯合特征肽。