与西兰花花球低温变紫性状连锁的InDel标记物及引物组和应用

与西兰花花球低温变紫性状连锁的indel标记物及引物组和应用
技术领域
1.本发明涉及一种与西兰花花球低温变紫性状连锁的indel标记，具体涉及一种与西兰花花球低温变紫性状连锁的indel标记物及引物组和应用。


背景技术：

2.西兰花(brassica oleracea l.var.italica)是十字花科芸薹属甘蓝种中以花球为产品的一个变种，因营养丰富且富含萝卜硫素而深受人们的青睐，近年栽培面积逐年增长。西兰花在生产中常出现遇低温花球发紫的现象，影响商品花球外观品质。
3.研究表明植物紫色是甜菜红色素或花青素的色素显示(biosynthesis of plant pigments:anthocyanins,betalains and carotenoids.plant j.2008；54:733
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49；"la vie en rose":biosynthesis,sources,and applications of betalainpigments.mol plant.2018；11(1):7
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22；illuminating colors:regulation of carotenoid biosynthesis and accumulation by light.curr opin plant biol.2017；37:49
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55)。甜菜红色素呈现红紫或黄色，仅存在于石竹目植物中；花青素在许多不同植物种普遍存在，呈现从红到紫到蓝的颜色(outchkourov ns,karlova r,m,schrama x,blilou i,jongedijk e,et al.transcription factor-mediated control of anthocyanin biosynthesis in vegetative tissues.j plant physiol.2018；176(2):1862
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78.)。对芸薹属植物鲜明紫色的研究结果表明，芸薹属植物中鲜艳紫色是转录因子myb的表达增强引起的(the purple cauliflower arises from activation of a myb transcription factor.plant physiol.2010；154(3):1470
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80；purple brassica oleracea var.capitata f.rubra is due to the loss ofbomybl2-1 expression.bmc plant biol.2018；18:82
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97)。
4.目前，西兰花花球低温发紫性状的研究不多，鲜见与该性状紧密连锁的位点或标记的研究报道。西兰花花球低温持绿是长期以来的育种方向之一。因此，挖掘并开发控制西兰花花球低温变紫基因及相关分子标记具有重要的生产应用价值和现实意义，并为聚合西兰花低温持绿优良位点、培育耐低温的西兰花新品种及材料鉴定等提供技术支撑。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种与西兰花花球低温变紫性状连锁的indel标记物及引物组和应用，能够对西兰花材料进行检测，可早期、快速、精准的检测西兰花花球低温变紫材料，利用kasp技术对所开发的indel标记进行基因分型。
6.为了达到上述目的，本发明提供了一种与西兰花花球低温变紫性状连锁的indel标记物，该indel标记物的核苷酸序列如seq id no.6所示，该indel标记物与西兰花花球低温变紫性状紧密连锁，其物理位置为chr9.60169854。
7.本发明的另一目的是提供一种与西兰花花球低温变紫性状连锁的indel标记引物
组，该引物组包含：核苷酸序列如seq id no.1所示的特异性引物primer f、核苷酸序列如seq id no.2所示的特异性引物primer h，和核苷酸序列如seq id no.3所示的通用引物primer c。
8.优选地，所述特异性引物primer f和特异性引物primer h的5’端接上不同的荧光序列，该荧光序列分别为fam荧光序列和hex荧光序列。
9.优选地，所述fam荧光序列如seq id no.4所示。
10.优选地，所述hex荧光序列如seq id no.5所示。
11.本发明的另一目的是提供一种所述的indel标记引物组的应用，该应用选自以下任意一种：
12.(1)在鉴别西兰花花球低温变紫、低温持绿性状中的应用；
13.(2)在西兰花分子标记辅助育种中的应用。
14.本发明的另一目的是提供一种鉴别西兰花花球低温变色性状的方法，该方法包含：采用所述的indel标记引物组，以待检测西蓝花的dna基因组为模板，进行kasp反应，根据结果分析西兰花花球低温变色性状：若仅有如seq id no.6所示的核苷酸序列的插入的扩增产物，则待检测西蓝花的花球表现低温发紫；若仅有无如seq id no.6所示的核苷酸序列插入的扩增产物，则待检测西蓝花的花球表现低温持绿；若既有如seq id no.6所示的核苷酸序列的插入的扩增产物，又有无如seq id no.6所示的核苷酸序列插入的扩增产物，则待检测西蓝花的花球表现低温发紫。
15.本发明的与西兰花花球低温变紫性状连锁的indel标记物及引物组和应用，具有以下优点：
16.本发明的与西兰花花球低温变紫性状连锁的indel标记可应用于西兰花花球低温紫/绿性状的辅助选择，可在早期对育种材料进行批量检测，从而可在早期淘汰大量非理想的材料，检测方便，费用低廉，大幅度减少后期所需的定植、田间管理、表型鉴定的工作量。
17.而传统育种方法完全依赖于对花球颜色的调查结果进行选择，而花球的花蕾低温变紫对花球的花蕾低温持绿为显性，表型为紫色的个体并不代表不携带有低温持绿的基因位点，因此利用表型选择低温持绿的材料往往需要额外自交一代，需耗费大量时间；若直接淘汰低温变紫的个体，则会无意识中丢失一些其他性状优良的个体。本发明的方法可针对相应位点的基因型进行鉴定，直接确定样品中是否含有低温持绿的基因。
18.本发明利用kasp技术对所开发的indel标记进行基因分型，kasp技术流程中pcr体系构建和荧光信号检测等自动化，可高通量检测样本。
附图说明
19.图1为本发明的分离群体kasp分型图。
具体实施方式
20.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
21.实施例1与西兰花花球低温变紫性状连锁的indel标记
22.1、引物设计
23.通过bsa-qtl初定位和bc2f2大群体的精细定位等系列分析获得与西兰花花球低温变紫性状紧密连锁标记的物理位置(chr9.60169854)，该位点是否存在一个43bp碱基(seq id no.6)的缺失，若该位点有缺失，则对应的花球表现低温持绿；若该位点无缺失，则对应的花球表现低温发紫；若该位点为杂合位点，则对应的花球表现低温发紫。提取indel位点和侧翼序列，设计引物组(两条特异性引物和一条通用引物)，并在两条特异性引物的5’端分别接上fam和hex荧光序列。
24.43bp的碱基的核苷酸序列(seq id no.6)：
25.atccgttagagttccaccctcaccgtcaaaatcagttccctta；
26.特异性引物primerf的核苷酸序列(seq id no.1)：
[0027]5’‑
caatagcaaggctttgatctcagtag-3’；
[0028]
特异性引物primer h的核苷酸序列(seq id no.2)：
[0029]5’‑
caatagcaaggctttgatctcagtat-3’；
[0030]
通用引物primer c的核苷酸序列(seq id no.3)：
[0031]5’‑
gcacacggacatgcttagcacttta-3’；
[0032]
fam荧光序列(seq id no.4)：
[0033]
gaaggtgaccaagttcatgct；
[0034]
hex荧光序列(seq id no.5)：
[0035]
gaaggtcggagtcaacggatt。
[0036]
2、indel标记应用
[0037]
(1)待检测西兰花基因组dna提取
[0038]
将待检测西兰花材料按照常规ctab方法分别提取基因组dna，-20℃保存，备用。
[0039]
(2)kasp反应测试
[0040]
kasp反应在intelliqube高通量基因分型平台(lgc，biosearch technologies)上进行。
[0041]
在微孔反应板上加入约5～10ng dna样品，加入kasp反应液，反应总体系1.6μl，其中primer c终浓度为1.74μm，primer f和primer h的终浓度均为0.69μm，1
×
kasp mastermix。
[0042]
pcr扩增在水浴热循环仪中完成，touchdown pcr反应条件为：94℃预变性15min，1个循环；94℃变性20sec，61℃～55℃退火并延伸60sec，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；第二步扩增反应，94℃变性20s，55℃退火并延伸60s，26个循环。
[0043]
反应完成后利用intelliqube对kasp反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果将自动转化成图形。
[0044]
(3)标记分型数据
[0045]
根据上述检测方法，对一个f2分离群体中92个单株(为一个低温发紫和一个低温不发紫的纯和材料杂交后自交的f2分离群体)和23个重要西兰花纯和材料进行验证。92个单株的kasp验证结果与表型100％吻合。23份核心材料的kasp验证结果与表型的吻合度为95％(见表1)。可见，本发明中的引物可高效、高精度检测西兰花花球低温发紫/持绿性状。
23份核心材料中表型与kasp检测结果不是100％吻合，说明自然界中西兰花低温持绿的基因或位点不仅限于本发明中涉及的位点。
[0046]
表1为23份材料的基因分型数据
[0047][0048]
注：deletion表示缺失；insert表示插入；hx-1至hx-23均为纯和育种材料。
[0049]
图1为本发明针对92个单株检测的分离群体kasp分型图，蓝色点代表低温花蕾变紫，红色点代表低温花蕾持绿，紫色点代表低温花蕾变紫，但是含有低温持绿的基因。
[0050]
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。