一种双模磁弛豫上转换荧光生物传感器及其应用的制作方法

2-3次；
14.s116、取一定量的ucnps-氯仿混合液并添加至烧瓶中，再缓慢加入含有300mgpaa 的乙醇溶液20ml，并在室温下搅拌溶液24小时，通过离心处理后即可得到水相ucnps。
15.优选地，所述步骤s12的具体实现方式包括：
16.s121、将水相ucnps分散在pb缓冲液中，并添加浓度为10mg/ml的edc200ul和浓度为10mg/ml的nhs120ul进行混合，在室温下保持反应30min，其中pb缓冲液的浓度为 0.01mm，ph值为7.4；
17.s122、将混合反应后的溶液用水冲洗后在2000g条件下离心8min，然后添加黄曲霉毒素b1-特异性抗体进行混合，混合时间8h，进而得到功能性ucnps，其中，冲洗次数为2-3次，黄曲霉毒素b1-特异性抗体的浓度为6ug/ml，pb0.01mm，ph值为7.4。
18.优选地，所述功能性磁性复合纳米粒子的制备方法包括以下步骤：
19.s21、合成水相fe3o4；
20.s22、合成fe3o4@pcn-224；
21.s23、基于共价偶联法将黄曲霉毒素b1-特异性抗原与fe3o4@pcn-224进行混合，进而制备出功能性fe3o4@pcn-224。
22.优选地，所述步骤s21的具体实现方式包括：
23.s211、将2mmolfe(acac)3在20ml的苯醚中与10mmol的1,2-十六烷二醇、6mmol 的油酸和6mmol的油胺进行混合，并在氮气流下磁力搅拌；
24.s212、将混合物加热至200℃并保持30分钟，然后，在氮气流下加热至265℃并回流 30分钟；
25.s213、冷却混合物至室温，在空气氛围下利用40ml乙醇从混合物中沉淀出深棕色物质，并在3500g条件下进行离心处理，离心时间为10min；
26.s214、利用乙醇对离心处理后的混合物重新沉淀并重新分散在己烷中以生成油相fe3o4纳米粒子；
27.s215、将10mg油相fe3o4纳米粒子溶解在5ml甲苯中，然后添加5ml含有 50mgdmsa的甲醇并进行混合，将混合物在室温下静置24h；
28.s216、在30℃条件下将混合物静置的沉淀物进行真空干燥。
29.优选地，所述步骤s22的具体实现方式包括：
30.s221、将100mg0.13mmol的h2tcpp、300mg0.93mmol的zrocl2·
8h2o和3.3g27mmol 的苯甲酸溶于100ml的dmf中，并在95℃下搅拌混合物5小时；
31.s222、将搅拌后的混合物在9500g条件下离心15min，进而收集pcn-224纳米颗粒，利用dmf对收集的pcn-224纳米颗粒进行冲洗；
32.s223、将pcn-224超声分散在2.5ml的乙二醇中并在120℃下预热10分钟，然后逐滴添加3ml浓度为15mg/ml的聚乙烯吡咯烷酮和5ml浓度为1mg/ml的fe3o4水溶液并不断剧烈搅拌16分钟；
33.s224、将剧烈搅拌后得到的混合物在120℃保持10分钟后冷却至室温，对冷却后的混合物进行离心处理，最后用水和乙醇清洗数次后即可得到fe3o4@pcn-224。
34.优选地，所述步骤s23的具体实现方式包括：
35.s231、将5ml浓度为3.3mg/ml的fe3o4@pcn-224分散在pb缓冲液中，其中，pb缓冲液
的浓度为0.01mm，ph值为7.4；
36.s232、将400μl浓度为10mg/ml的edc和240μl浓度为10mg/ml的nhs添加到fe3o 混合液中，并在室温下保持反应30min；
37.s233、将反应后的混合溶液进行冲洗，并在180℃条件下离心处理5min，冲洗次数为2-3次；
38.s234、将2ml浓度为16ug/ml黄曲霉毒素b1-特异性抗原添加到离心处理后的混合溶液中混合8h，进而得到功能性fe3o4@pcn-224，其中，黄曲霉毒素b1-特异性抗原的pb 浓度为0.01mm，ph值为7.4。
39.一种双模磁弛豫上转换荧光生物传感器的应用，基于上述所述的双模磁弛豫上转换荧光生物传感器应用于食品中的黄曲霉毒素b1检测。
40.与现有技术比较，本发明提供一种双模磁弛豫上转换荧光生物传感器，通过抗原抗体免疫识别单元将功能上转换纳米粒子与功能性磁性复合纳米粒子组装在一起，进而构建用于检测食品中黄曲霉毒素b1的双模磁弛豫上转换荧光生物传感器，所述双模磁弛豫上转换荧光生物传感器在mr模式下黄曲霉毒素b1检测限可达0.16ng/ml，在fl模式下黄曲霉毒素b1检测限达0.038ng/ml，因此，该生物传感器既保证了检测灵敏度，又克服了有色样品的干扰，从而提高了食品中黄曲霉毒素b1检测的准确性。
附图说明
41.图1是本发明中一种双模磁弛豫上转换荧光生物传感器的组装结构示意图，
42.图2是本实施例中ucnps和fe3o4@pcn-224检测结果示意图，
43.图3是本实施例中组装体检测结果示意图，
44.图4是本实施例中不同金属离子存在条件下不同浓度黄曲霉毒素b1的检测结果示意图。
具体实施方式
45.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明作进一步的详细说明。
46.如图1所示，图1示出了双模磁弛豫上转换荧光生物传感器的组装结构。所述双模磁弛豫上转换荧光生物传感器包括抗原抗体免疫识别单元、功能性磁性复合纳米粒子和功能性上转换荧光纳米颗粒，所述功能性磁性复合纳米粒子和功能性上转换荧光纳米颗粒通过抗原抗体免疫识别单元组装构成用于检测食品中的黄曲霉毒素b1的双模磁弛豫上转换荧光生物传感器。
47.本实施例中，所述上转换荧光纳米颗粒为ucnps，磁性复合纳米粒子为 fe3o4@pcn-224。由于功能性ucnps的荧光被功能性fe3o4@pcn-224中的pcn-224淬灭，水质子在fe3o4载体附近的自扩散系数降低，进而能够获得优异的横向弛豫性能；而且在fe3o4@pcn-224上，组装后生物传感器中的δt2值显著下降，且黄曲霉毒素b1 对功能性磁性复合纳米粒子和功能性上转换荧光纳米颗粒的组装过程有所影响，进而能够改变δt2值和黄曲霉毒素b1抗干扰分析的荧光强度，使得所述生物传感器既具有优异的灵敏度，又能够在微混浊和不透明样品中具有抗干扰检测能力。
48.本实施例中，利用tem(transmission electron microscopy，透射电镜)、dls (动态光散射，)和els(electrophoretic light scattering,电泳光散射)对组装体的水合粒径和形态进行测定和评估，如图3所示，3a示出了组装体的tem结果，3b 示出了ag-fe3o4@pcn-224、ab-ucnps和组装体的dls结果，3c示出了ucnps、 ab-ucnps、fe3o4@pcn-224和组装体的荧光变化结果(3c中曲线从上至下依次为
①②③④
)，3d示出了fe3o4@pcn-224、ag-fe3o4@pcn-224和组装体的横向弛豫率变化结果。由于ucnps被黄曲霉毒素b1包被-形成ab(aflatoxin b1)-ucnps的特异性抗体，fe3o4@pcn-224涂有黄曲霉毒素b1-特异性抗原形成功能性fe3o4@pcn-224(ag
‑ꢀ
fe3o4@pcn-224)。ab-ucnps的水合粒径从212nm增加到到237nm，它们的zeta 电位(zeta potential，是指剪切面的电位，又叫电动电位或电动电势，是表征胶体分散系稳定性的重要指标)从-18.01mv降低到-24.61毫伏。ag-fe3o4@pcn-224的水化粒径增加从141nm到180nm，它们的zeta电位从降低12.79mv至-18.01mv。以上结果表明ab-ucnps和ag-fe3o4@pcn-224的表面修饰成功。由生物识别事件诱发的 ag-fe3o4@pcn-224和ab-ucnps组装，表现为大型聚合组装物，dls测量进一步确认了组件的形成，如图2所示，2a和2b均示出了ucnps的tem图像结果，2c示出了 ucnps的ftir光谱结果，2d示出了fe3o4@pcn-224的xrd结果，2e示出了 fe3o4@pcn-224的n2吸附等温线结果，2f示出了fe3o4@pcn-224的横向弛豫率结果。
49.本实施例中，进一步地，对ag-fe3o4@pcn-224和ab-ucnps构建的双模传感器的可行性进行评估，即对ucnps荧光强度和fe3o4@pcn-224的横向弛豫率进行评估。图2c显示了发射光谱ucnps和fe3o4@pcn-224的紫外吸收光谱，由图可知，两个光谱之间有一个大的重叠，这初步表明在ucnps和fe3o4@pcn-224之间可能发生fret 过程(荧光共振能量转移，它是一种非辐射能量跃迁,通过分子间的电偶极相互作用, 将供体激发态能量转移到受体激发态的过程)；进一步测定ucnps、ab-ucnps和混合的ucnps和fe3o4@pcn-224的荧光强度，其分别为139.29、131.5和126.36，位于 543纳米，由此可以看出，该组装后的生物传感器的荧光强度(43.71)明显低于ucnps、 ab-ucnps及其混合物，说明了组装后的mr-fl生物传感器的fret过程成功实现；同时，在0.5tlf-核磁共振仪上测量其r2，由图2d可知，其r2按照以下顺序增加了： fe3o4@pcn-224(42.12mm-1s-1)《ag-fe3o4@pcn-224(43.47mm-1s-1)《组装(102.10mm-1s-1)，进而证实了组装后的mr-fl生物传感器的可行性。
50.其中，所述抗原抗体免疫识别单元的浓度为2-12μg/ml，fe3o4@pcn-224的浓度为1.5mg/ml，组装反应时间为40min。
51.本实施例中，由于组装时间、表面识别单元(抗原抗体免疫识别单元)浓度等检测条件和材料对mr-fl生物传感器的性能有显着影响。表面识别单元浓度对荧光猝灭效率的影响可以反映fret效率以及mr模式的灵敏度。荧光猝灭效率＝e％＝([f0-f]/f0)
ꢀ×
100％，其中fo和f分别代表ab-ucnps组装前后的荧光强度。由于纳米粒子的逐渐组装，随着抗体/抗原的浓度增加(2至12μg/ml)，荧光淬灭效率增加，δt2降低。高荧光猝灭效率体现fl模式的出色的检测灵敏度。然而，低δt2并无益处于传感器的检测灵敏度。本实施例中，所述抗原抗体免疫识别单元浓度优选为6μg/ml，随着ag
‑ꢀ
fe3o4@pcn-224的反应时间和浓度增加，荧光猝灭效率增加，δt2降低。
[0052]
其中，所述功能性磁性复合纳米粒子的制备方法包括以下步骤：
[0053]
s11、利用溶剂热法合成水相ucnps，具体为：
[0054]
s111、将12mloa(oleic acid，油酸)、30ml1-ode(1-octadecylene，1-十八烯) 和1mmol稀土氯化物络合物添加到三颈烧瓶中进行混合，其中，稀土氯化物络合物中y: yb:er＝78:20:2；
[0055]
s112、在氮气氛围中将混合物从123℃加热至160℃并保温，直至混合物变为澄清溶液；
[0056]
s113、在混合物中逐滴加入含有3.25mmolnaoh和3.5mmolnh4f的甲醇溶液30ml，降温冷却至80℃后搅拌30min；在本步骤中，为了去除甲醇，需要将混合溶液在100℃下搅拌30min，并在氮气流下恒温保持1h；
[0057]
s114、冷却至室温，在混合物中添加体积比为1:1的乙醇和环己烷并在2000g条件下离心10分钟；
[0058]
s115、利用乙醇和水对混合物进行洗涤后使oa-ucnps分散在氯仿中，洗涤次数为 2-3次；
[0059]
s116、取一定量的ucnps-氯仿混合液并添加至烧瓶中，再缓慢加入含有300mgpaa 的乙醇溶液20ml，并在室温下搅拌溶液24小时，通过离心处理后即可得到水相ucnps；
[0060]
s12、基于共价偶联法将黄曲霉毒素b1-特异性抗体固定在水相ucnps表面，进而制备功能性ucnps，具体为：
[0061]
s121、将水相ucnps分散在pb(phosphate buffer)缓冲液中，并添加浓度为 10mg/ml的edc(n-(3-8二甲氨基丙基)-n-乙基碳二亚胺盐酸盐)200ul和浓度为10mg/ml 的nhs(n-89羟基琥珀酰亚胺)120ul进行混合，在室温下保持反应30min，其中pb缓冲液的浓度为0.01mm，ph值为7.4；
[0062]
s122、将混合反应后的溶液用水冲洗后在2000g条件下离心8min，然后添加黄曲霉毒素b1-特异性抗体进行混合，混合时间8h，进而得到功能性ucnps，其中，冲洗次数为2-3次，黄曲霉毒素b1-特异性抗体的浓度为6ug/ml，pb0.01mm，ph值为7.4。
[0063]
本实施例中，基于热溶剂法制备出水相ucnps，然后利用共价偶联方法将黄曲霉毒素b1-特异性抗体固定在水相ucnps的表面，进而得到功能性ucnps，所得到的功能性 ucnps需要在4℃下进行储存备用。
[0064]
其中，所述功能性磁性复合纳米粒子的制备方法包括以下步骤：
[0065]
s21、合成水相fe3o4，具体包括：
[0066]
s211、将2mmolfe(acac)3(乙酰丙酮铁(iii))在20ml的苯醚中与10mmol的 1,2-十六烷二醇、6mmol的油酸和6mmol的油胺进行混合，并在氮气流下磁力搅拌；
[0067]
s212、将混合物加热至200℃并保持30分钟，然后，在氮气流下加热至265℃并回流 30分钟；
[0068]
s213、冷却混合物至室温，在空气氛围下利用40ml乙醇从混合物中沉淀出深棕色物质，并在3500g条件下进行离心处理，离心时间为10min；
[0069]
s214、利用乙醇对离心处理后的混合物重新沉淀并重新分散在己烷中以生成油相 fe3o4纳米粒子；
[0070]
s215、将10mg油相fe3o4纳米粒子溶解在5ml甲苯中，然后添加5ml含有 50mgdmsa的甲醇并进行混合，将混合物在室温下静置24h；
[0071]
s216、在30℃条件下将混合物静置的沉淀物进行真空干燥；
[0072]
s22、合成fe3o4@pcn-224，具体包括：
[0073]
s221、将100mg0.13mmol的h2tcpp(meso-四(4-羧基苯基)卟啉)、300mg0.93mmol 的zrocl2·
8h2o(八水氧氯化锆)和3.3g27mmol的苯甲酸溶于100ml的dmf(n,n-二甲基甲酰胺)中，并在95℃下搅拌混合物5小时；
[0074]
s222、将搅拌后的混合物在9500g条件下离心15min，进而收集pcn-224纳米颗粒，利用dmf对收集的pcn-224纳米颗粒进行冲洗；
[0075]
s223、将pcn-224超声分散在2.5ml的乙二醇中并在120℃下预热10分钟，然后逐滴添加3ml浓度为15mg/ml的聚乙烯吡咯烷酮和5ml浓度为1mg/ml的fe3o4水溶液并不断剧烈搅拌16分钟；
[0076]
s224、将剧烈搅拌后得到的混合物在120℃保持10分钟后冷却至室温，对冷却后的混合物进行离心处理，最后用水和乙醇清洗数次后即可得到fe3o4@pcn-224；
[0077]
s23、基于共价偶联法将黄曲霉毒素b1-特异性抗原与fe3o4@pcn-224进行混合，进而制备出功能性fe3o4@pcn-224，具体包括：
[0078]
s231、将5ml浓度为3.3mg/ml的fe3o4@pcn-224分散在pb缓冲液中，其中，pb缓冲液的浓度为0.01mm，ph值为7.4；
[0079]
s232、将400μl浓度为10mg/ml的edc和240μl浓度为10mg/ml的nhs添加到fe3o 混合液中，并在室温下保持反应30min；
[0080]
s233、将反应后的混合溶液进行冲洗，并在180℃条件下离心处理5min，冲洗次数为2-3次；
[0081]
s234、将2ml浓度为16ug/ml黄曲霉毒素b1-特异性抗原添加到离心处理后的混合溶液中混合8h，进而得到功能性fe3o4@pcn-224，其中，黄曲霉毒素b1-特异性抗原的pb 浓度为0.01mm，ph值为7.4。
[0082]
本发明还提供了一种双模磁弛豫上转换荧光生物传感器的应用，基于上述所述的双模磁弛豫上转换荧光生物传感器应用于食品中的黄曲霉毒素b1检测。
[0083]
基于上述所述双模磁弛豫上转换荧光生物传感器的评述，将该双模磁弛豫上转换荧光生物传感器应用到食品的黄曲霉毒素b1检测种，应具有相同的技术效果，此处不再赘述。
[0084]
为了进一步说明本发明的工作原理和技术效果，下面以一系列的实验对此进行验证。
[0085]
下面实验中，均使用nmi 20-ca(核磁共振成像分析仪)和荧光光谱仪f96pro(增益设置为10)直接分析最终混合物，其中，carr-purcell-meiboom-gill序列脉冲序列用于t2测量，核磁共振(nmr)频率为18mhz，重复时间为7,000ms，回波时间为1.7 ms，前置放大器增益为3，回波数为2,000，采样频率为100khz。黄曲霉毒素b1浓度与δt2的关系值(δt2＝ttargets-t0，其中ttargets和t0代表横向弛豫分别存在和不存在黄曲霉毒素b1的时间)和fl(荧光)值，用于黄曲霉毒素b1的定量分析。
[0086]
1、利用双模mr-fl生物传感器检测黄曲霉毒素b1
[0087]
将混合500μlab-ucnps(浓度为1.1mg/ml)、500μlag-fe3o4@pcn-224(浓度为3.3186mg/ml)和100μl不同浓度的黄曲霉毒素b1标准溶液(浓度分别为：0.011、 0.022、0.055、0.11、0.22、0.55、1.1、2.2、5.5、11、22、55、110、220、550、1100、 2200和5500ng/ml)
混合，将混合物于室温下孵育40分钟；
[0088]
2、特异性分析
[0089]
所有金属离子(黄曲霉毒素b1、mg2 、cu2 、pd2 、fe2 、ag2 、ba2 、k2 、 zn2 ,和na )稀释至220ng/ml，混合500μlab-ucnps(浓度为1.1mg/ml)、500μl ag-202 fe3o4@pcn-224(浓度为3.3mg/ml)及100μl不同金属离子标准溶液，并在室温下孵育40分钟，均能够从最终混合物中检测出t2信号和荧光强度，如图4所示， 4a示出了不同浓度黄曲霉毒素b1的弛豫时间，4b示出了不同浓度黄曲霉毒素b1的荧光变化，4c示出了mr模式下不同浓度黄曲霉毒素b1的标准曲线，4d示出了fl模式下不同浓度黄曲霉毒素b1的标准曲线。
[0090]
3、自来水、红酒、鸡蛋、豆浆样品中黄曲霉毒素b1的检测
[0091]
采用现有分析的预处理方法对鸡蛋和豆浆进行预处理，即：将2％三氯乙酸和生鸡蛋(或豆浆)(10ml，2:8v/v)混合于离心机中的样品管，并超声处理10分钟；然后，将混合物以5,000g离心5分钟去除脂肪层，滤液保存在4℃下以供进一步检测；
[0092]
分别使用自来水、红酒、预处理过的鸡蛋或预处理过的豆浆将黄曲霉毒素b1(浓度分别为：22、55和110ng/ml)稀释至2、5和10ng/ml；再将500μlab-ucnps(浓度为1.1mg/ml)、500μlag-fe3o4@pcn-214(浓度为3.3mg/ml)和100μl上述稀释后的含黄曲霉毒素b1的食品基质溶液进行混合,在室温下孵育40分钟；
[0093]
结果表明，该最终混合液的t2信号和荧光强度均能检测出。
[0094]
4、样本分析
[0095]
为了评估双模式mr-fl生物传感器的实际可行性，经过简单的样品预处理，检测浑浊和不透明样品(鸡蛋和豆浆)以及透明或有色样品中(自来水和红酒；表1)的黄曲霉毒素b1。如表1所示，表1示出了所述双模式mr-fl生物传感器检测各种样品中黄曲霉毒素b1的结果，结果表明，在透明或有色样品中，上转换荧光和磁弛豫传感黄曲霉毒素b1的检测具有出色的样品回收率，其中，fl模式下样品回收率为：98.82％至107.81％，rsd(相对标准偏差)《5.74％；mr模式下样品回收率：100.76％至 109.78％，rsd《5.5％；由于上转换纳米粒子具有抗背景颜色干扰的优势，上转换荧光模式不会影响对有色样品中黄曲霉毒素b1的回收率。然而，在混浊和不透明样品中， fl模式比mr模式的样品回收率较低，其中，fl模式下样品回收率为：77.64％至94.03％，rsd《8.6％；mr模式下样品回收率为：99.49％至104.04％，rsd《8.29％，其根本原因在于样品只经过简单的预处理，并未完全去除存在于鸡蛋和豆浆中的蛋白质和脂质，导致基质略微粘稠且不透明，进而验证了该生物传感器双模方法的优势；即， fl的灵敏度模式允许检测痕量黄曲霉毒素b1并克服有色样品干扰，而磁弛豫传感器克服了混浊和不透明的样品的干扰。因此，所述mr-fl生物传感器提高了灵敏度黄曲霉毒素b1检测的准确性。
[0096]
表1采用双模式mr-fl生物传感器检测各种样品中黄曲霉毒素b1的结果表
[0097][0098]
综上所述，本发明提供的基于fe3o4@pcn-224和ucnps的用于检测黄曲霉毒素 b1的具备mr和fl双重信号的双模生物传感器具有出色的灵敏度，且有效克服了有色样品的干扰。其中，多孔结构的fe3o4@pcn-224可以降低水质子的自扩散系数，产生增强的横向驰豫现象，构建出可实现微混浊和不透明样品的抗干扰检测mr模式的。所述生物传感器能够适用于有色、微混浊和不透明样品中的黄曲霉毒素b1检测，协同效应使该双模生物传感器在复杂的食品基质中检测表现出优异的抗干扰性和出色的灵敏度，这将推动未来食品安全快速检测技术的发展。
[0099]
以上对本发明所提供的一种双模磁弛豫上转换荧光生物传感器及其应用进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。