SlMPP6基因在调控番茄灰霉病抗性中的应用

slmpp6基因在调控番茄灰霉病抗性中的应用
技术领域
1.本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种slmpp6在调控番茄灰霉病抗性中的应用。


背景技术：

2.茄灰霉病已成为危害番茄生产的重要病害之一。番茄灰霉病主要由灰葡萄孢菌引起。灰葡萄孢菌属于半知菌亚门、葡萄孢属(botrytis cinerea)，是一种死体营养型真菌，寄主多达235种，不仅危害番茄、马铃薯等蔬菜作物，还可侵染葡萄、草莓、鲜花切花等重要的水果花卉，使之软化腐烂，丧失商品价值，引起园艺产业采前采后的重大损失。
3.目前，生产上防治灰霉病主要采用物理防治、化学防治及生物防治相结合的办法。物理防治只能从表面上对灰霉菌加以控制，不能解决根本问题；化学防治虽然可以较为有效地杀灭灰霉菌，但是会带来有毒农药残留与环境污染的问题(hedjaroude,2007；li et al.,2015)；生物防治利用生防菌、植物诱抗剂、植物内生菌等抑制灰霉菌的繁殖或诱导植物自身的抗性(delong et al.,2018)，虽然取得了一些效果，但是应用生物防治制剂也面临田间效果不稳定的问题。
4.因此，依然有必要有针对性培育抗病品种才是防治灰霉病的有效途径。


技术实现要素：

5.基于此，有必要提供一种slmpp6在调控番茄抗灰霉病中的应用，针对性培育改良灰霉病的抗性作物品种。
6.本发明采用如下技术方案：
7.本发明提供slmpp6基因或其编码的蛋白在调控番茄灰霉病抗性中的应用，所述slmpp6基因的序列如a)或b)所示：
8.a)如seq id no.2所示的序列；
9.b)seq id no.2所示序列经取代、缺失和/或添加一个或者多个核苷酸且能够编码具有调控番茄灰霉病抗性功能蛋白的序列。
10.本发明还可以提供slmpp6基因或其编码的蛋白在用于改良作物灰霉病抗性育种中的应用，所述slmpp6基因的序列如a)或b)所示：
11.a)如seq id no.2所示的序列；
12.b)seq id no.2所示序列经取代、缺失和/或添加一个或者多个核苷酸且能够编码具有调控作物灰霉病抗性功能蛋白的序列。
13.在其中一些实施例中，所述slmpp6基因所编码的蛋白的氨基酸序列见seq id no.1所示。
14.在其中一些实施例中，扩增slmpp6基因的orf的引物如seq id no.3和seq id no.4所示。
15.在其中一些实施例中，本发明采用基因编辑敲除slmpp6基因以降低番茄灰霉病抗
性。
16.在其中一些实施例中，本发明采用crispr-cas9基因编辑技术敲除番茄的slmpp6基因。其中，crispr-cas9基因编辑技术的双靶点引物如seq id no.5和seq id no.6所示。
17.在其中一些实施例中，本发明通过在番茄体内超量表达slmpp6基因以提升番茄灰霉病抗性。
18.本发明的有益效果是：
19.与现有技术相比，本发明首次探索发现slmpp6基因可以调控番茄对灰霉病的抗性，从而能够利用该基因进行植物灰霉病抗性改良，便于解决种质资源匮乏的问题，还可以保证甚至提高番茄质量。
附图说明
20.图1为slmpp6正义(超量)表达载体构建过程。
21.图2为基因编辑载体构建过程。
22.图3为slmpp6在瞬时转化的烟草中的蛋白表达：1、2、3代表三片不同的叶，即三个生物学重复。
23.图4为slmpp6超量植株中slmpp6的蛋白表达情况。
24.图5为slmpp6基因编辑植株中基因的编辑情况比对。
25.图6为slmpp6基因编辑植株中基因的氨基酸序列比对。
26.图7为转基因材料离体叶片接种灰霉菌叶片发病情况。
27.图8为转基因材料离体叶片接种灰霉菌叶片病斑面积统计：图a为超量株系与对照a57病斑面积统计，图b为敲除株系与对照aty(通过a57与抗黄化曲叶病毒病优良自交系杂交并多代回交育成)病斑面积统计
28.图9为抗感材料中slmpp6受灰霉菌的诱导情况。
29.图10为slmpp6在番茄不同发育过程中的组织表达情况。
具体实施方式
30.下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
31.以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
32.在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
33.实施例1
34.本实施例探究发现番茄slmpp6基因所编码的氨基酸序列如下：
35.makrelsgtlrnlkfmqraslreekpkkeeevipdgnfssssapkrcviimegdphpgaikgrmsfqgfnpsidklseeaskprsegsaspacssetsewitkrengtsqyglensdvddtyddpnedikwkqdntsserqysnkshkrvlddpasspsssqrskmpqrldwsvlkppksqkrrr(seq id no.1)
36.番茄slmpp6的cdna序列如下：
37.gagcaggcccatttgagttcgaggaaaatttgttattttgaactcgagaagaacctcttcggttcagtaaactttttttagccctttggagttagctcgaggctagcgccggcgccgtcaccttgccggaaaattcaagaatagcaagtggggaaaagcaattttcagtttcggtgtgccataagaagttgttctgtaaatcagaatggccaaacgtgaactatccggtaccttgaggaacttgaagtttatgcaaagggcttctctcagagaggaaaagcccaagaaggaagaagaagtgatacctgatggaaacttctcctcctctagtgctcccaaaagatgtgttatcattatggaaggggatccccatcctggggctataaaaggtcggatgtcttttcaaggttttaatccttctattgataaattgagtgaagaagcttcaaaaccacgctccgaaggttctgcttcccctgcttgttcttcggagacgagtgaatggattactaaaagagaaaatggtacatcacaatatggattggagaactctgatgtggacgacacttatgacgaccctaacgaagatatcaaatggaaacaagacaatacatcctctgagaggcagtattcaaacaaatcacataagagagtcctggacgatccagcctcgtcacctagtagtagccagagatccaaaatgccacagagacttgactggagtgttctcaaacctccaaagtcgcaaaagagaagacggtaagtgtaacttaaaggtgatgttgtgtactgagttagaaaaattctgtattttcaatttatgttgtgaaatggtaacacattattagtcttgtggatctatggcgatcctaaattatatttcaattatattatctgccttctgcttacgagaaaagttatgccacatttgttggttga(seq id no.2)
38.扩增番茄slmpp6的orf片段的pcr引物组：
39.正向引物：
40.5'-ctccccttgctccgtggatccatggccaaacgtgaactatccgg-3'(seq id no.3)
41.反向引物：
42.5'-tccttgtagtcagaaggcctccgtcttctcttttgcgactttgg-3'(seq id no.4)
43.从番茄常用背景材料a57(ailsa craig)中扩增出全长slmpp6的orf(开放阅读框)序列。pcr扩增方法是先提取番茄rna，然后利用反转录试剂盒(购自北京全式金公司)，按照试剂盒说明书反转录合成slmpp6基因的cdna，然后通过pcr的方式扩增出所需要的orf片段，经1％琼脂糖凝胶检测，用回收试剂盒(omega，具体程序见说明书)回收目的片段。
44.实施例2采用crispr-cas9基因编辑技术敲除番茄的slmpp6基因
45.根据实施例1中番茄slmpp6的cdna序列设计cas9的双靶点引物。
46.第一个靶点的引物为：
47.gaatctaacagtgtagtttgtgaactatccggtaccttggttttagagctagaaatagc(seq id no.5)，
48.第二个靶点的引物为：
49.gctatttctagctctaaaactcaggtatcacttcttcttcaaactacactgttagattc(seq id no.6)。
50.通过pcr的方法，从pcbc-dt1t2质粒(来自中国农科院蔬菜花卉研究所崔霞课题组，可购自addgene，http://www.addgene ne.org)中扩增出一条长608bp的序列。扩增方法是用小量法提取pcbc-dt1t2质粒(试剂盒购自北京普博欣公司，具体程序见说明书)，以质粒为模板，采用一步法扩增，将扩增产物用回收试剂盒(购自北京普博欣公司，具体程序见说明书)回收目的片段。
51.用bsai(neb)将ptx041质粒(来自中国科学院遗传与发育生物研究所李传友研究组，详见李传友等报道的efficient generation of pink-fruited tomatoes using crispr/cas9 system，2017)酶切(37℃，》3h)，酶切产物1.0％琼脂糖胶检测并用回收试剂
盒切胶回收ptx041(18k左右)大片段，带有两个靶点的片段与载体以1:1的比例混合，加入exnase ii 1μl，5x cell buffer 2μl，线性化克隆载体25-100ng，插入片段扩增产物10-100ng，无菌水补充体积至10μl。37℃连接30min，全部连接产物用热激法转化大肠杆菌transt1，kan抗性lb平板筛选阳性克隆，挑斑摇菌，对液体菌液进行pcr检测。
52.检测所用前引物ptx-fw为：agcggataacaatttcacacagga，检测所用后引物ptx-rv为：gcaggcatgcaagcttattgg。
53.pcr产物用1.0％琼脂糖胶检测，空载片段大小为1820bp，而具有双靶点的载体为1169bp。将检测正确的菌液送公司测序(天一辉远)。进行序列比对，将正确的菌液小摇，用小量法提取质粒。载体构建过程见图2。
54.对获得的重组克隆利用电转化仪在1800v的电压下转化农杆菌gv3101，用含rif 100mg/l，kan 50mg/l的lb固体平板筛选，挑选阳性克隆，28℃、200r/min振荡培养过夜，取1μl农杆菌液作为模板，以载体引物进行pcr检测。
55.番茄遗传转化：利用农杆菌介导法将ptx-slmpp6转入番茄aty(将a57与抗黄化曲叶病毒病番茄自交系经过杂交，多代回交创制)获得mpp6基因敲除植株。其中，遗传转化方法详见欧阳波等报道的农杆菌介导法(2002)。
56.ctab法提取番茄的gdna，通过pcr产物测序的方法检测基因编辑情况，以番茄gdna为模板，扩增包括两个靶点在内的644bp：
57.前引物为5'-tcaagaatagcaagtggg-3'，
58.后引物为5'
‑‑
ttgtaatatcctagggacaa-3'，
59.1％琼脂糖凝胶检测，pcr产物送测序，测序比对发现：有4株均有基因编辑存在，cr-13、cr-27、cr-37纯和突变。测序比对结果见图5，而cr-33杂合双峰，无法比对。
60.经过氨基酸序列分析发现，cr-13突变位点存在于内含子区域，可能不会导致氨基酸序列变化，引起基因突变，而cr-27和cr-37突变均存在于外显子区域，都会导致提前终止(见图6)。
61.实施例3超表达slmpp6基因的载体构建
62.如图1所示，用bamhi stui双酶切pcambia2300-flag空载体(来自美国德州农工大学何平研究组，详见何平等报道的ligand-induced monoubiquitination of bik1 regulates plant immunity，2020)，1.0％琼脂糖胶检测，回收pcambia2300-flag的载体大片段，nano drop2000测定回收的基因片段与载体大片段的浓度，将克隆片段与载体以1:1的比例混合，加入5
×
cell buffer 2μl，exnase ii 1μl，无菌水补充体积至10μl。37℃连接30min，取全部10μl连接产物转化大肠杆菌transt1，kan抗性平板筛选阳性克隆，pcr检测，检测引物为35s加基因的反向引物。检测正确的克隆送公司测序，测序引物为35s。
63.对获得的重组克隆利用电转化仪在1800v的电压下转化农杆菌gv3101，用含rif 100mg/l，kan 50mg/l的lb固体平板筛选，挑选阳性克隆，28℃、200r/min振荡培养过夜，收集20μl菌液，ddh2o重悬，95℃变性10min，10000r/min离心1min，取2μl上清液作为模板，以35s为正向引物，基因特异反向引物进行pcr检测。
64.烟草中瞬时转化：首先将含有超量重组载体pcambia2300-slmpp6-flag的农杆菌用含rif 100mg/l，kan50 mg/l的液体lb在28℃、200r/min振荡培养16h，离心，收集农杆菌细胞，用ddh2o将菌液重悬至od
600
＝1；将菌液注射进入本氏烟草叶片中，正常条件培养3d，
注射过与未注射过的叶片取样，液氮磨样，2
×
sds裂解蛋白，sds-page检测蛋白表达。可以发现在注射过菌液的烟草中slmpp6是能够正常表达的，检测结果如图3。
65.番茄遗传转化：利用农杆菌介导法将超量重组载体pcambia2300-slmpp6-flag转入番茄a57(alisa craig)。获得mpp6基因超表达的转基因植株。其中，遗传转化方法详见欧阳波等报道的农杆菌介导法(2002).
66.超量株系中slmpp6蛋白表达检测：获得转基因阳性植株以后，对超量株系每一个系均进行slmpp6蛋白表达量的检测。通过wb检测发现，slmpp6-oe-flag-62、slmpp6-oe-flag-7中slmpp6蛋白表达极低或不表达，19、23、32、35、50、53、87株表达量较高，进一步选取表达量较高的slmpp6-oe-flag-19、slmpp6-oe-flag-50、slmpp6-oe-flag-87进行后续实验。具体见图4。
67.为了验证slmpp6在番茄抗灰霉病方面的功能，进一步对转基因植株和对照植株a57(非转基因植株)取生长势一致的健康植株同一部位复叶的成熟小叶的背面进行灰霉菌孢子接种鉴定，22℃恒温，16h光照/8h黑暗，相对湿度75％放置72h，发现转基因植株叶片的发病情况更轻，病斑面积较小，对照植株则发病严重，叶片病斑面积较大(见图7)。
68.进一步用万深植物叶面积分析软件计算了病斑面积并对数据进行统计分析，结果表明，slmpp6转基因超量材料的三个阳性株系与野生型株系a57的病斑面积差异显著，病斑面积显著降低(见图8a)；slmpp6敲除株系与野生型株系aty的病斑面积差异显著，病斑面积显著增加(见图8b)。
69.上述试验结果表明，番茄slmpp6在番茄抗灰霉病方面功能显著，是一个能够在番茄上应用的抗病功能蛋白。
70.选择抗感材料检测slmpp6对灰霉病的诱导情况，分别是三个抗病材料：ts13(pime-bruce)、ts107(la1542)、ts125；两个感病材料：ts3(la2475)、ts114，材料来源详见黄三文等报道的genomic analyses provide insights into the history of tomato breeding(2014)。通过接种灰霉菌，然后在0h、12h、24h取样，提取rna，之后反转录形成cdna，通过特异引物检测slmpp6的表达情况发现：在抗感材料中，slmpp6普遍受灰霉诱导到更高的表达水平，大部分抗病材料中slmpp6表达原本就比较高，受到灰霉诱导变得更高而感病材料中slmpp6虽然受灰霉诱导，但它的表达维持在一个相对较低的水平，这些都说明slmpp6在番茄抗灰霉病的过程中起着十分重要的作用。具体表达情况见图9。
71.经过qpcr检测发现：slmpp6在完全开放的花和果实破色期表达量较高，尤其是在破色期急剧升高。在不同发育时期叶片中表达相对稳定，在花发育过程中逐渐升高，果实发育过程中先降低，在2cm大的果实中表达最低，而后升高，到破色期表达最高。说明slmpp6在花发育和果实成熟过程中可能也起作用(见图10)。
72.在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。